重組雌激素受體基因酵母細胞檢測牛尿液中β—雌二醇殘留的方法

陳劍等

摘要：為探索畜禽產品中雌激素殘留的檢驗方法，加強對畜禽生產過程中激素添加的監控，本研究選擇了在我國幾種常見影響比較大的合成雌激素-β-雌二醇（E2）為研究對象，建立用于測定動物尿液中雌激素的重組基因酵母檢測法。結果表明本方法簡單、有效，能夠作為雌激素殘留檢測體系的有益補充。

關鍵詞：畜禽產品；重組雌激素受體基因酵母細胞；牛尿液；雌激素；β-雌二醇；殘留檢測

中圖分類號： S852.23 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）03-0166-02

生產中廣泛應用的雌激素，可以通過食物鏈富集作用于人體，導致生殖障礙、出生缺陷、發育異常、代謝紊亂以及某些癌癥的發生[1]。世界很多國家計劃或已經制定了一些法律法規限制此外類物質的使用，譬如除己烯雌酚等人工合成類雌激素化合物于1980年華沙國際學術討論會和同年的聯合國糧農組織與世界衛生組織聯席會議決定全面禁用[2]。就目前而言，對于環境雌激素的研究還處于起步階段，很多問題有待進一步揭示。隨著重組DNA技術、基因表達及酵母分子遺傳學研究的進展，越來越多的外源基因在酵母細胞中獲得高效表達，因此，酵母作為一個基因工程表達系統受到廣泛研究應用[3]。通過本研究希望能夠為我國建立快速檢測牛生產中添加雌激素情況的監測提供新技術支持、構建我國畜禽安全生產的預警體系。

1 測定原理

將人類雌激素受體基因（hER cDNA）轉化于酵母，使其高效表達，再將雌激素反應原件（ERE）與編碼β-半乳糖苷酶的LacZ報告基因相串聯，重組于酵母細胞。當牛尿中的雌激素活性物質與酵母中的hER結合后，會通過生物變構效應，經雌激素效應元件（ERE）順式激活Lac Z （β-半乳糖苷酶） 基因表達，從而使Lac Z的表達量增加。通過測定Lac Z的活性就可以定量反映牛尿中雌激素的含量。

2 試驗材料

2.1 試驗樣品采集

小牛尿液：從揚州大學實驗農牧場采集出生10日齡的小牛尿液12份，依次編號分別為112、113、116、117、119、120、121、122、123、124、125、128。

2.2 試驗材料

C18柱（美國Welch公司）；甲醇（上海振興化工一廠，分析純）；丙酮、無水乙醇、濃鹽酸氫氧化鈉、二氯甲烷（上海焱晨化工實業有限公司，均為分析純）；瓊脂粉（中國醫藥集團上海化學試劑公司）；酵母基本合成配養基（SD）及無色氨酸、尿嘧啶（-Trp、-Ura）營養補料原料（美國Clontech公司）；β-雌二醇（揚州大學醫學院李湘鳴教授提供）。

3 試驗過程

3.1 重組雌激素受體基因細胞酵母培養

3.1.1 培養板制作 按照配方配制選擇性固體培養平板SD/-trp、-ura （無色氨酸、尿嘧啶），經121 ℃滅菌20 min，取約15 mL倒入消毒培養皿中，冷凝后用保鮮膜密封，4 ℃保存備用。

3.1.2 重組雌激素受體基因酵母細胞（W303-1A/hER-ERE-LacZ）接種 在無菌操作臺內將W303-1A/hER-ERE-LacZ劃線接種于SD/-trp、-ura 平板，置于30 ℃培養箱內培養3～4 d，使其長出3～4 mm的酵母克隆，保鮮膜密封，4 ℃冰箱保存。

3.1.3 擴增酵母克隆 取消毒玻璃瓶1只，加入3 mL SD/-trp、-ura 培養液，用接種環從SD/-trp、-ura 培養板挑取酵母克隆置于3 mL SD/-trp、-ura 培養液中，在30 ℃恒溫振蕩器中培養過夜（約14 h）。

3.2 樣品預處理

用定性濾紙和漏斗將原尿過濾至干凈消毒玻璃瓶中。為減少誤差，用具塞試管分裝過濾牛尿至消毒玻璃瓶中，每樣2份，一份取5 mL做加樣試驗，另一份取5 mL做空白對照。

3.3 試劑配制

（1） 8 mol/L NaOH （分子量40）：稱取NaOH 32 g，用 100 mL 雙蒸水充分溶解。（2） 0.1 mg/mL溶菌酶的ONPG：取40 mg ONPG粉末，加入10 mL的Z Buffer，再加入溶菌酶使其終濃度為 0.1 mg/mL，避光充分混勻，分裝為2 mL/管，冷凍保存。

3.4 尿樣加標

小牛尿液分別加入試驗選擇的雌激素物質：乙炔雌二醇。β-雌二醇做加標后在小牛尿液中的終濃度達到0.050 mol/L。空白對照（即尿樣空白）加入等量的乙醇；試劑空白用2 mL蒸餾水代替小牛尿液。

3.5 C18吸附柱活化

用移液器吸取2.5 mL甲醇淋洗C18吸附柱，每次 15 min，共3次，再用雙蒸水清洗3次，每次15 min，將活化后的吸附柱放入4 ℃冰箱保存備用。

3.6 水解

目的是將內源性的結合性雌激素類化合物水解為游離型。分別取加標尿液2 mL置于具塞試管中，依次加入2 mL HCl、2 mL甲醇；空白對照和試劑空白與尿樣完全相同。

將試管于100 ℃水浴作用1 h，然后吸取2 mL用 8 mol/L NaOH調節溶液pH值至3.0。

3.7 吸附

將上述pH值為3.0水解液分別通過活化C18吸附柱，棄去流出液。在無液體流出后（吸附約20 min），用循環水式真空泵抽氣5 min，盡量除去C18吸附柱中殘留的水分。然后用4 mL二氯甲烷洗脫C18吸附柱2次，每次約30 min。將洗脫液洗置于消毒玻璃瓶中，封口編號。

4 雌激素類化學物測定

4.1 作用于酵母細胞

在無菌操作臺內，將每份試驗尿樣用二氯甲烷洗脫液吸取0.1 mL至消毒玻璃瓶中，置于37 ℃烘箱內，揮發5 min。加入1.5 mL SD/-trp、-ura 培養液，再加入0.5 mL過夜酵母培養液，使其在培養液中濃度分別為100、0 mg/mL（對照），30 ℃繼續振蕩培養6 h。

4.2 顯色

取透明酶標板，每3孔分為1組。加入20 μL受試物作用的酵母細胞培養液，然后加入40 μL含0.1 mg/mL溶菌酶的ONPG，最后加入160 μL含1%SDS Z Buffer，在37 ℃振蕩箱內顯色，記錄受試樣品的顯色時間，最后用50 μL 1 mol/L的NaCO3 中止其反應。同時以同樣的方法取透明酶標板，加入0.1 mL于30 ℃作用6 h的酵母培養液，用于測波長為 630 nm 處的細胞密度。

4.3 測光密度

用酶標儀測光密度，于波長為405 nm處測顯色尿樣，波長為630 nm處測經受試物作用的酵母細胞培養液的細胞密度，求D405 nm/D630 nm之比值。

5 結果與分析

5.1 重組基因酵母細胞對β-雌二醇的反應

表1為重組基因酵母細胞對加入β-雌二醇和小牛原尿的反應變化，以D405 nm/D630 nm之比值表示。由表1可以看出，重組基因酵母細胞對100 ng/mL濃度的β-雌二醇可以產生明顯的響應，12份加入β-雌二醇小牛尿的D405 nm/D630 nm最高值達1.624，最低值為0.679；而小牛原尿D405 nm/D630 nm普遍較低，最高值為1.394，最低值為0.393，經配對t檢驗表明2組差異極顯著（t=3.722，P=0.003 3）。空白試劑中雌激素活性更低，說明小牛原尿中僅含極微量的雌激素。

5.2 重組基因酵母細胞對β-雌二醇的反應分析

根據試驗所得數據和研究分析，重組基因酵母細胞對加入β-雌二醇的小牛原尿的反應明顯，所有加標尿樣中的雌激素水平很高，均高于不加標樣，說明剛出生的小牛性器官還處于原始狀態，雌激素分泌極少。小牛原尿和空白試劑（蒸餾水）反應差別不大，但稍高于空白試劑，說明小牛原尿中含極微量的雌激素，可能是小牛攝入母乳所致。因為小牛畢竟是生物活體，所產生的體液中還具有其他的生物活性物質，因此與空白試劑相比，所測結果也可能是其他生物活性物質的干擾性反應。通過比較分析，小牛原尿組成的雌激素類化合物和蒸餾水無明顯差別。

這次檢測的尿液樣本的過程相對簡單，利用酵母檢測雌激素生物活性方法靈敏、快速、方便。不過該驗證方法只是定性篩選方法，所以如果篩選出可疑樣品需要做進一步證實。選擇10日齡小牛尿作為試驗對象是真實物質載體，可以更好地說明酵母細胞檢測方法準確方便的優異性。

5.3 問題與展望

雌激素的種類繁多，廣泛存在于生活和生產環境中，對人體可產生多方面的作用。隨著工業的發展，雌激素的污染進一步加重，威脅著人類的健康、生存與繁衍。而隨著污染的日益嚴重，將會有越來越多的物質被懷疑具有雌激素效應。但是就目前而言，對于環境雌激素的研究還處于起步階段，其種類還在增加，很多問題有待進一步揭示。因此，建立快速經濟、簡單有效的生物檢測方法就顯得尤為重要。發展出快速、簡便的方法是國內外許多專家、學者致力的研究目標，并且已經取得了一些進步，但有效監控雌激素還需廣大科技工作者做出更多的努力。

參考文獻：

[1]王一梅，王 洋，唐 非. 環境雌激素的研究現狀（二）——環境雌激素的測定[J]. 公共衛生與預防醫學，2009（2）：47-49.

[2]郁 倩. 動物性食品和水中雌激素殘留污染檢測的研究[D]. 無錫：江南大學，2008.

[3]李湘鳴， 羅方妮， 劉桂霞，等.基因重組酵母細胞檢測養殖場污水中環境雌激素[J]. 農業環境科學學報，2007，26（6）：2200-2205.

4.2 顯色

取透明酶標板，每3孔分為1組。加入20 μL受試物作用的酵母細胞培養液，然后加入40 μL含0.1 mg/mL溶菌酶的ONPG，最后加入160 μL含1%SDS Z Buffer，在37 ℃振蕩箱內顯色，記錄受試樣品的顯色時間，最后用50 μL 1 mol/L的NaCO3 中止其反應。同時以同樣的方法取透明酶標板，加入0.1 mL于30 ℃作用6 h的酵母培養液，用于測波長為 630 nm 處的細胞密度。

4.3 測光密度

用酶標儀測光密度，于波長為405 nm處測顯色尿樣，波長為630 nm處測經受試物作用的酵母細胞培養液的細胞密度，求D405 nm/D630 nm之比值。

5 結果與分析

5.1 重組基因酵母細胞對β-雌二醇的反應

表1為重組基因酵母細胞對加入β-雌二醇和小牛原尿的反應變化，以D405 nm/D630 nm之比值表示。由表1可以看出，重組基因酵母細胞對100 ng/mL濃度的β-雌二醇可以產生明顯的響應，12份加入β-雌二醇小牛尿的D405 nm/D630 nm最高值達1.624，最低值為0.679；而小牛原尿D405 nm/D630 nm普遍較低，最高值為1.394，最低值為0.393，經配對t檢驗表明2組差異極顯著（t=3.722，P=0.003 3）。空白試劑中雌激素活性更低，說明小牛原尿中僅含極微量的雌激素。

5.2 重組基因酵母細胞對β-雌二醇的反應分析

根據試驗所得數據和研究分析，重組基因酵母細胞對加入β-雌二醇的小牛原尿的反應明顯，所有加標尿樣中的雌激素水平很高，均高于不加標樣，說明剛出生的小牛性器官還處于原始狀態，雌激素分泌極少。小牛原尿和空白試劑（蒸餾水）反應差別不大，但稍高于空白試劑，說明小牛原尿中含極微量的雌激素，可能是小牛攝入母乳所致。因為小牛畢竟是生物活體，所產生的體液中還具有其他的生物活性物質，因此與空白試劑相比，所測結果也可能是其他生物活性物質的干擾性反應。通過比較分析，小牛原尿組成的雌激素類化合物和蒸餾水無明顯差別。

這次檢測的尿液樣本的過程相對簡單，利用酵母檢測雌激素生物活性方法靈敏、快速、方便。不過該驗證方法只是定性篩選方法，所以如果篩選出可疑樣品需要做進一步證實。選擇10日齡小牛尿作為試驗對象是真實物質載體，可以更好地說明酵母細胞檢測方法準確方便的優異性。

5.3 問題與展望

雌激素的種類繁多，廣泛存在于生活和生產環境中，對人體可產生多方面的作用。隨著工業的發展，雌激素的污染進一步加重，威脅著人類的健康、生存與繁衍。而隨著污染的日益嚴重，將會有越來越多的物質被懷疑具有雌激素效應。但是就目前而言，對于環境雌激素的研究還處于起步階段，其種類還在增加，很多問題有待進一步揭示。因此，建立快速經濟、簡單有效的生物檢測方法就顯得尤為重要。發展出快速、簡便的方法是國內外許多專家、學者致力的研究目標，并且已經取得了一些進步，但有效監控雌激素還需廣大科技工作者做出更多的努力。

參考文獻：

[1]王一梅，王 洋，唐 非. 環境雌激素的研究現狀（二）——環境雌激素的測定[J]. 公共衛生與預防醫學，2009（2）：47-49.

[2]郁 倩. 動物性食品和水中雌激素殘留污染檢測的研究[D]. 無錫：江南大學，2008.

[3]李湘鳴， 羅方妮， 劉桂霞，等.基因重組酵母細胞檢測養殖場污水中環境雌激素[J]. 農業環境科學學報，2007，26（6）：2200-2205.

4.2 顯色

取透明酶標板，每3孔分為1組。加入20 μL受試物作用的酵母細胞培養液，然后加入40 μL含0.1 mg/mL溶菌酶的ONPG，最后加入160 μL含1%SDS Z Buffer，在37 ℃振蕩箱內顯色，記錄受試樣品的顯色時間，最后用50 μL 1 mol/L的NaCO3 中止其反應。同時以同樣的方法取透明酶標板，加入0.1 mL于30 ℃作用6 h的酵母培養液，用于測波長為 630 nm 處的細胞密度。

4.3 測光密度

用酶標儀測光密度，于波長為405 nm處測顯色尿樣，波長為630 nm處測經受試物作用的酵母細胞培養液的細胞密度，求D405 nm/D630 nm之比值。

5 結果與分析

5.1 重組基因酵母細胞對β-雌二醇的反應

表1為重組基因酵母細胞對加入β-雌二醇和小牛原尿的反應變化，以D405 nm/D630 nm之比值表示。由表1可以看出，重組基因酵母細胞對100 ng/mL濃度的β-雌二醇可以產生明顯的響應，12份加入β-雌二醇小牛尿的D405 nm/D630 nm最高值達1.624，最低值為0.679；而小牛原尿D405 nm/D630 nm普遍較低，最高值為1.394，最低值為0.393，經配對t檢驗表明2組差異極顯著（t=3.722，P=0.003 3）。空白試劑中雌激素活性更低，說明小牛原尿中僅含極微量的雌激素。

5.2 重組基因酵母細胞對β-雌二醇的反應分析

根據試驗所得數據和研究分析，重組基因酵母細胞對加入β-雌二醇的小牛原尿的反應明顯，所有加標尿樣中的雌激素水平很高，均高于不加標樣，說明剛出生的小牛性器官還處于原始狀態，雌激素分泌極少。小牛原尿和空白試劑（蒸餾水）反應差別不大，但稍高于空白試劑，說明小牛原尿中含極微量的雌激素，可能是小牛攝入母乳所致。因為小牛畢竟是生物活體，所產生的體液中還具有其他的生物活性物質，因此與空白試劑相比，所測結果也可能是其他生物活性物質的干擾性反應。通過比較分析，小牛原尿組成的雌激素類化合物和蒸餾水無明顯差別。

這次檢測的尿液樣本的過程相對簡單，利用酵母檢測雌激素生物活性方法靈敏、快速、方便。不過該驗證方法只是定性篩選方法，所以如果篩選出可疑樣品需要做進一步證實。選擇10日齡小牛尿作為試驗對象是真實物質載體，可以更好地說明酵母細胞檢測方法準確方便的優異性。

5.3 問題與展望

雌激素的種類繁多，廣泛存在于生活和生產環境中，對人體可產生多方面的作用。隨著工業的發展，雌激素的污染進一步加重，威脅著人類的健康、生存與繁衍。而隨著污染的日益嚴重，將會有越來越多的物質被懷疑具有雌激素效應。但是就目前而言，對于環境雌激素的研究還處于起步階段，其種類還在增加，很多問題有待進一步揭示。因此，建立快速經濟、簡單有效的生物檢測方法就顯得尤為重要。發展出快速、簡便的方法是國內外許多專家、學者致力的研究目標，并且已經取得了一些進步，但有效監控雌激素還需廣大科技工作者做出更多的努力。

參考文獻：

[1]王一梅，王 洋，唐 非. 環境雌激素的研究現狀（二）——環境雌激素的測定[J]. 公共衛生與預防醫學，2009（2）：47-49.

[2]郁 倩. 動物性食品和水中雌激素殘留污染檢測的研究[D]. 無錫：江南大學，2008.

[3]李湘鳴， 羅方妮， 劉桂霞，等.基因重組酵母細胞檢測養殖場污水中環境雌激素[J]. 農業環境科學學報，2007，26（6）：2200-2205.