響應面法優化香菇液體發酵條件

張安寧　劉連成

摘要：在香菇液態發酵單因素試驗基礎上，通過響應面法對發酵條件進行優化試驗，依據Box-Benhnken（BBD）設計預測發酵的最佳條件為：接種量12.42%、pH值4.96、培養溫度24.11 ℃。在轉速為160 r/min條件下按照最佳條件培養，菌絲生物量實測值為17.76 g/L，與理論值17.58 g/L相差1.02%。

關鍵詞：響應面法；液態發酵；條件優化；生物量

中圖分類號： TQ920.1 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）03-0200-04

香菇（Lentinula edodes）別稱香蕈、香菌等，分類上屬擔子菌門層菌綱傘菌目側耳科香菇屬[1]，是世界著名食用菌之一。它不僅肉質肥厚脆嫩，香氣獨特，而且具有很高的藥用和保健價值[2-4]。我國是世界上香菇人工栽培最早的國家，也是最大的生產國。我國對香菇液態發酵工藝的研究雖有報道，但對其發酵條件的研究大多停留在單因素試驗方面[5-7]，很少研究香菇液態發酵過程中各因素之間的交互作用。響應面法已被廣泛應用于生物過程的優化[8-9]，但在香菇液態發酵條件研究方面報道較少。前期研究利用意楊下腳料作為主要碳源培養獲得高產香菇菌種（香菇933），并研究出該香菇菌種液態發酵培養基的適宜配方，在此基礎上為進一步提高香菇產量和質量，本試驗利用響應面法對其液態發酵條件進行優化，找出適合香菇菌絲生長的最佳培養條件，為香菇液體菌種培養和規模液態發酵生產研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 香菇933菌種，由江蘇食品藥品職業技術學院省級食品微生物工程實驗室篩選提供。

1.1.2 主要儀器 ZQZY-HB型全溫振蕩培養箱，上海知楚儀器公司生產；LDZ5-2型高速離心機，北京京立離心機有限公司生產，JY92-Ⅱ超聲波細胞粉碎儀，廈門精密儀器有限公司生產。

1.1.3 培養基 （1）母種和活化培養基：馬鈴薯200 g/L（煮汁）、瓊脂20 g/L、葡萄糖15 g/L、KH2PO4 3 g/L、MgSO4 1 g/L、KCl 0.5 g/L、pH值自然。（2）液體種子和發酵培養基：蔗糖20 g/L、酵母膏10 g/L、MgSO4 1 g/L、KH2PO4 3 g/L、KCl 0.5 g/L、初始pH值5～6。

1.2 方法

1.2.1 種子液的培養 取500 mL的三角瓶，加入100 mL液體種子培養基，經121 ℃高壓蒸汽滅菌25 min，冷卻后接入蠶豆大活化后的斜面香菇菌種塊，在轉速為160 r/min的條件下24 ℃恒溫振蕩培養5 d，得到帶有細密菌絲球的種子液。

1.2.2 菌絲體生物量的測定 將待測香菇菌絲發酵液放于離心機中，設定轉速為4 000 r/min，離心15 min，上清液用于多糖提取。用去離子水洗滌沉淀4次，置于60 ℃干燥至恒重，即得菌絲體生物量。

1.2.3 發酵液及香菇菌絲體總粗多糖的測定[10-11] 取上述發酵上清液加4倍體積95%乙醇，于4 ℃下靜置24 h，在 5 000 r/min 下離心15 min，沉淀用無水乙醇洗滌、低溫干燥，得到發酵液粗多糖。將上述“1.2.2”稱重后的香菇菌絲體超聲波粉碎，加入約20倍體積的蒸餾水，98 ℃抽提3 h，過濾并將濾液濃縮，用4倍體積95%乙醇靜置24 h，在5 000 r/min下離心15 min，去上清液，沉淀用無水乙醇洗2次，低溫干燥，即為香菇菌絲粗多糖。發酵液粗多糖和香菇菌絲粗多糖混合后稱重即得總粗多糖。

1.2.4 香菇液體發酵單因素試驗設計 （1）接種量處理：將裝有100 mL液體發酵培養基的 500 mL 三角瓶，經121 ℃高壓蒸汽滅菌25 min，按不同接種量（體積比）將培養好的液體菌種接種到發酵培養基中，在轉速為160 r/min的條件下 24 ℃ 振蕩培養3 d，每處理做3次平行試驗，計算發酵液生物量和總粗多糖的平均值，下同。（2）pH值處理：用NaOH或HCl調節初始發酵液的pH值，設置不同的pH值，取100 mL裝入500 mL的三角瓶中，滅菌方法同（1），按12%（體積比）的接種量將培養好的液體菌種接到發酵培養基中，在轉速為 160 r/min 的條件下24 ℃振蕩培養3 d。（3）溫度處理：按（1）的方法量取液體發酵培養基并滅菌，將液體菌種按12%（體積比）的接種量接種，設置不同溫度，在轉速160 r/min條件下恒溫培養3 d。（4）轉速的處理：按（1）的方法量取液體發酵培養基并滅菌，將液體菌種按12%（體積比）的接種量接種，設置不同轉速（r/min）進行培養，24 ℃恒溫培養3 d。

1.2.5 香菇液態發酵工藝的優化設計 選擇接種量、接種溫度、轉速3個因素對生物量和總多糖有顯著影響的因素進行響應面試驗設計，通過Design Expert軟件對試驗數據進行回歸分析，預測香菇液態發酵最優工藝參數。

2 結果與分析

2.1 接種量對香菇液態發酵的影響

接種量的大小與該菌在發酵液中生長繁殖的速度有關。接種量大，種子進入發酵液后適應快，可以縮短發酵繁殖至高峰所需時間，種子液中含有大量的水解酶，使產物合成速度加快。大接種量往往使菌種生長過快，造成營養基質缺乏或溶解氧不足而不利于發酵；接種量不足，則會引起發酵前期菌絲量少、菌體生長緩慢，使發酵周期延長，還可能產生菌絲團，導致發酵異常等。不同的接種量（3%～24%）對香菇液態發酵培養的生物量及粗多糖產量的綜合影響結果見圖1。結果表明，在接種量3%～12%范圍內，香菇生物量與總粗多糖產量均隨著接種量的增加而增加，增長趨勢顯著，而在接種量大于12%以后，生物量及粗多糖產量增幅不大，在產物不增加情況下增加接種量意味著增加發酵成本，因此初步確定香菇液態發酵適宜接種量為12%。

2.2 初始pH 值對香菇液態發酵的影響

pH值的高低直接影響菌絲體的新陳代謝，導致微生物細胞膜的電荷變化，影響代謝過程中酶的活性，從而影響生物量和多糖代謝產物。本試驗設計初始發酵液不同的pH值3～7.5對香菇生物量及粗多糖產量的影響（圖2），結果表明，當發酵初始pH值為5.0時，香菇菌絲體生物量與粗多糖產量均達到最大值，分別為17.58、1.76 g/L。當pH值高于5.0時生物量與粗多糖產量下降明顯，表明香菇菌絲適宜生長在偏酸性環境，pH值5.0是香菇液態發酵較適pH值。

2.3 發酵溫度對香菇液態發酵的影響

試驗以不同發酵溫度9～36 ℃進行發酵培養，測定對香菇生物量及粗多糖產量的影響（圖3），結果表明，當發酵溫度從 9 ℃ 升至24 ℃時，香菇生物量與粗多糖產量均隨著溫度升高而增加，在24 ℃時粗多糖產量最高，為1.77 g/L。當發酵溫度超過24 ℃時，粗多糖產量有下降趨勢；當發酵溫度為27 ℃時，生物量最高，為17.57 g/L。溫度高于27 ℃，生物量開始下降，因溫度過高會導致微生物代謝加快，自身物質消耗過快，生物量、粗多糖產量呈下降趨勢；高溫發酵生物熱增速較快，可促進菌種老化，從而影響生物量增加和粗多糖的生物合成。初步選定香菇菌液體培養適宜發酵溫度為24 ℃。

2.4 搖床轉速對香菇液態發酵的影響

不同轉速（120～200 r/min）條件下，液態發酵試驗結果（圖4）表明，當轉速從120 r/min升至160 r/min時，香菇生物量及香菇粗多糖產量呈上升趨勢；當轉速達到160 r/min時菌絲體生物量和粗多糖產量均達最高，分別為17.45、1.73 g/L。轉速超過160 r/min時，菌絲生物量及粗多糖產量略有下降趨勢，因增加轉速雖然有利于增加溶氧和通氣效果，但增加了菌絲球相互間的摩擦和剪切作用，加大對菌絲球的機械刺激，從而影響生物量的增加。初步確定適合香菇菌絲生長的搖床轉速為160 r/min。

2.5 香菇液體發酵條件響應面法分析

從單因素試驗結果看出，香菇粗多糖產量與菌絲生物量變化趨勢較為一致，因此優化液態發酵條件時選擇菌絲生物量作為量化指標，根據Box-Benhnken的中心組合試驗設計原理，綜合單因素試驗，選取對生物量影響較大的接種量、pH值和培養溫度3個因素作為響應面法的試驗因素，分別以A、B、C表示，每個因素的低、中、高試驗水平分別以-1、0、1進行編碼，試驗因素水平編碼如表1所示，Box-Behnken 設計方案及試驗結果見表2。為研究影響因素間的曲面效應，利用Design Expert軟件對表2數據進行多元二次回歸擬合，所得到的二次回歸方程的等高線及響應曲面見圖5至圖7。結果表明，在所選因素水平范圍內，均有最大響應值出現。

圖5結果表明，接種量和pH值對生物量的影響，響應面圖可以看出接種量曲面和pH值曲面變化幅度均較明顯，說明接種量和pH值對生物量的影響較為顯著，與二次回歸擬合方差分析結果一致，響應面的最高點同時也是等高線中的最小圖形的中心點。從等高線圖可以看出，圖形接近圓形，說明pH值和接種量交互作用不顯著。

圖6結果表明，培養溫度和pH 值對生物量的影響，可以看出培養溫度曲面變化幅度不大，pH 值曲面變化幅度較大，說明pH 值對生物量的影響較為顯著，當pH 值和培養溫度較低或較高時，都會降低香菇菌絲的生物量。從等高線圖可以看出，培養溫度和pH 值交互作用相對顯著。響應面的最高點同時也是等高線中的最小橢圓的中心點。

接種量和培養溫度對菌絲生物量的影響見圖7。從圖7可見，培養溫度曲面變化幅度不大，接種量曲面變化幅度較大，說明接種量對生物量的影響較為顯著，對同一等高線橢圓曲線分析，接種量變化很小區域需要培養溫度較大區域的變化，培養溫度和接種量對菌絲生物量的交互影響相對顯著。

2.6 最佳培養條件的預測和試驗驗證

根據Design Expert建立的數學模型進行參數的最優化分析，得出香菇液態發酵的優化條件為接種量12.42%、pH 值4.96、發酵溫度24.11 ℃。在此條件下，香菇生物量理論上可達17.58 g/L。為驗證該法的可行性，采用上述優化發酵條件進行香菇液態發酵試驗，為方便試驗操作，將上述優化發酵溫度調整為24 ℃，在單因素試驗測得的最適轉速 160 r/min 條件下，按照優化條件做3組平行試驗，測得香菇菌絲生物量實際平均值為17.76 g/L，試驗結果與模型預測相差1.02%。

3 討論與結論

以菌絲生物量和粗多糖產量為量化指標，對香菇液態發酵的接種量、培養溫度、pH值、轉速進行單因素試驗，在此基礎上通過響應面優化發酵試驗，建立了接種量、pH值、培養溫度3個因素和響應值菌體生物量之間的數學模型，研究用響應面法確定香菇液態發酵條件的可行性。結果表明，建立的模型的回歸效果顯著，能很好地預測菌絲體的生物量。確定優化發酵條件接種量為12.42%、pH 值為4.96、發酵溫度為 24.11 ℃，按照此優化條件實測菌絲體生物量為17.76 g/L，與理論值相差1.02%。表明采用響應面法對試驗數據進行回歸分析和條件優化能很好地預測香菇液態發酵條件，具有一定的可行性和實用價值。

參考文獻：

[1]常明昌. 食用菌栽培[M]. 北京：中國農業出版社，2009：86-87.

[2]徐錦堂.中國藥用真菌學[M]. 北京：北京醫科大學、中國協和醫科大學聯合出版社，1997：3-16.

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[8]吳有煒. 試驗設計與數據處理[M]. 蘇州：蘇州大學出版社，2002：135-142.

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[10]張 佳. 香菇多糖提取與純化新工藝[D]. 北京：北京化工大學，2007：27-30.

[11]蔣家新，黃光榮. 香菇多糖提取工藝的研究[J]. 糧油食品科技，2003（3）：15-17.

2.2 初始pH 值對香菇液態發酵的影響

pH值的高低直接影響菌絲體的新陳代謝，導致微生物細胞膜的電荷變化，影響代謝過程中酶的活性，從而影響生物量和多糖代謝產物。本試驗設計初始發酵液不同的pH值3～7.5對香菇生物量及粗多糖產量的影響（圖2），結果表明，當發酵初始pH值為5.0時，香菇菌絲體生物量與粗多糖產量均達到最大值，分別為17.58、1.76 g/L。當pH值高于5.0時生物量與粗多糖產量下降明顯，表明香菇菌絲適宜生長在偏酸性環境，pH值5.0是香菇液態發酵較適pH值。

2.3 發酵溫度對香菇液態發酵的影響

試驗以不同發酵溫度9～36 ℃進行發酵培養，測定對香菇生物量及粗多糖產量的影響（圖3），結果表明，當發酵溫度從 9 ℃ 升至24 ℃時，香菇生物量與粗多糖產量均隨著溫度升高而增加，在24 ℃時粗多糖產量最高，為1.77 g/L。當發酵溫度超過24 ℃時，粗多糖產量有下降趨勢；當發酵溫度為27 ℃時，生物量最高，為17.57 g/L。溫度高于27 ℃，生物量開始下降，因溫度過高會導致微生物代謝加快，自身物質消耗過快，生物量、粗多糖產量呈下降趨勢；高溫發酵生物熱增速較快，可促進菌種老化，從而影響生物量增加和粗多糖的生物合成。初步選定香菇菌液體培養適宜發酵溫度為24 ℃。

2.4 搖床轉速對香菇液態發酵的影響

不同轉速（120～200 r/min）條件下，液態發酵試驗結果（圖4）表明，當轉速從120 r/min升至160 r/min時，香菇生物量及香菇粗多糖產量呈上升趨勢；當轉速達到160 r/min時菌絲體生物量和粗多糖產量均達最高，分別為17.45、1.73 g/L。轉速超過160 r/min時，菌絲生物量及粗多糖產量略有下降趨勢，因增加轉速雖然有利于增加溶氧和通氣效果，但增加了菌絲球相互間的摩擦和剪切作用，加大對菌絲球的機械刺激，從而影響生物量的增加。初步確定適合香菇菌絲生長的搖床轉速為160 r/min。

2.5 香菇液體發酵條件響應面法分析

從單因素試驗結果看出，香菇粗多糖產量與菌絲生物量變化趨勢較為一致，因此優化液態發酵條件時選擇菌絲生物量作為量化指標，根據Box-Benhnken的中心組合試驗設計原理，綜合單因素試驗，選取對生物量影響較大的接種量、pH值和培養溫度3個因素作為響應面法的試驗因素，分別以A、B、C表示，每個因素的低、中、高試驗水平分別以-1、0、1進行編碼，試驗因素水平編碼如表1所示，Box-Behnken 設計方案及試驗結果見表2。為研究影響因素間的曲面效應，利用Design Expert軟件對表2數據進行多元二次回歸擬合，所得到的二次回歸方程的等高線及響應曲面見圖5至圖7。結果表明，在所選因素水平范圍內，均有最大響應值出現。

圖5結果表明，接種量和pH值對生物量的影響，響應面圖可以看出接種量曲面和pH值曲面變化幅度均較明顯，說明接種量和pH值對生物量的影響較為顯著，與二次回歸擬合方差分析結果一致，響應面的最高點同時也是等高線中的最小圖形的中心點。從等高線圖可以看出，圖形接近圓形，說明pH值和接種量交互作用不顯著。

圖6結果表明，培養溫度和pH 值對生物量的影響，可以看出培養溫度曲面變化幅度不大，pH 值曲面變化幅度較大，說明pH 值對生物量的影響較為顯著，當pH 值和培養溫度較低或較高時，都會降低香菇菌絲的生物量。從等高線圖可以看出，培養溫度和pH 值交互作用相對顯著。響應面的最高點同時也是等高線中的最小橢圓的中心點。

接種量和培養溫度對菌絲生物量的影響見圖7。從圖7可見，培養溫度曲面變化幅度不大，接種量曲面變化幅度較大，說明接種量對生物量的影響較為顯著，對同一等高線橢圓曲線分析，接種量變化很小區域需要培養溫度較大區域的變化，培養溫度和接種量對菌絲生物量的交互影響相對顯著。

2.6 最佳培養條件的預測和試驗驗證

根據Design Expert建立的數學模型進行參數的最優化分析，得出香菇液態發酵的優化條件為接種量12.42%、pH 值4.96、發酵溫度24.11 ℃。在此條件下，香菇生物量理論上可達17.58 g/L。為驗證該法的可行性，采用上述優化發酵條件進行香菇液態發酵試驗，為方便試驗操作，將上述優化發酵溫度調整為24 ℃，在單因素試驗測得的最適轉速 160 r/min 條件下，按照優化條件做3組平行試驗，測得香菇菌絲生物量實際平均值為17.76 g/L，試驗結果與模型預測相差1.02%。

3 討論與結論

以菌絲生物量和粗多糖產量為量化指標，對香菇液態發酵的接種量、培養溫度、pH值、轉速進行單因素試驗，在此基礎上通過響應面優化發酵試驗，建立了接種量、pH值、培養溫度3個因素和響應值菌體生物量之間的數學模型，研究用響應面法確定香菇液態發酵條件的可行性。結果表明，建立的模型的回歸效果顯著，能很好地預測菌絲體的生物量。確定優化發酵條件接種量為12.42%、pH 值為4.96、發酵溫度為 24.11 ℃，按照此優化條件實測菌絲體生物量為17.76 g/L，與理論值相差1.02%。表明采用響應面法對試驗數據進行回歸分析和條件優化能很好地預測香菇液態發酵條件，具有一定的可行性和實用價值。

參考文獻：

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[3]Kodama，N. Murata，Y. Asakawa.A. Maitake D-fraction enhances antitumor efects and reduces immunosuppression by milomycin-C in tumor-bearing mice[J]. Nutrition，2005，21：624-629.

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[8]吳有煒. 試驗設計與數據處理[M]. 蘇州：蘇州大學出版社，2002：135-142.

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[11]蔣家新，黃光榮. 香菇多糖提取工藝的研究[J]. 糧油食品科技，2003（3）：15-17.

2.2 初始pH 值對香菇液態發酵的影響

pH值的高低直接影響菌絲體的新陳代謝，導致微生物細胞膜的電荷變化，影響代謝過程中酶的活性，從而影響生物量和多糖代謝產物。本試驗設計初始發酵液不同的pH值3～7.5對香菇生物量及粗多糖產量的影響（圖2），結果表明，當發酵初始pH值為5.0時，香菇菌絲體生物量與粗多糖產量均達到最大值，分別為17.58、1.76 g/L。當pH值高于5.0時生物量與粗多糖產量下降明顯，表明香菇菌絲適宜生長在偏酸性環境，pH值5.0是香菇液態發酵較適pH值。

2.3 發酵溫度對香菇液態發酵的影響

試驗以不同發酵溫度9～36 ℃進行發酵培養，測定對香菇生物量及粗多糖產量的影響（圖3），結果表明，當發酵溫度從 9 ℃ 升至24 ℃時，香菇生物量與粗多糖產量均隨著溫度升高而增加，在24 ℃時粗多糖產量最高，為1.77 g/L。當發酵溫度超過24 ℃時，粗多糖產量有下降趨勢；當發酵溫度為27 ℃時，生物量最高，為17.57 g/L。溫度高于27 ℃，生物量開始下降，因溫度過高會導致微生物代謝加快，自身物質消耗過快，生物量、粗多糖產量呈下降趨勢；高溫發酵生物熱增速較快，可促進菌種老化，從而影響生物量增加和粗多糖的生物合成。初步選定香菇菌液體培養適宜發酵溫度為24 ℃。

2.4 搖床轉速對香菇液態發酵的影響

不同轉速（120～200 r/min）條件下，液態發酵試驗結果（圖4）表明，當轉速從120 r/min升至160 r/min時，香菇生物量及香菇粗多糖產量呈上升趨勢；當轉速達到160 r/min時菌絲體生物量和粗多糖產量均達最高，分別為17.45、1.73 g/L。轉速超過160 r/min時，菌絲生物量及粗多糖產量略有下降趨勢，因增加轉速雖然有利于增加溶氧和通氣效果，但增加了菌絲球相互間的摩擦和剪切作用，加大對菌絲球的機械刺激，從而影響生物量的增加。初步確定適合香菇菌絲生長的搖床轉速為160 r/min。

2.5 香菇液體發酵條件響應面法分析

從單因素試驗結果看出，香菇粗多糖產量與菌絲生物量變化趨勢較為一致，因此優化液態發酵條件時選擇菌絲生物量作為量化指標，根據Box-Benhnken的中心組合試驗設計原理，綜合單因素試驗，選取對生物量影響較大的接種量、pH值和培養溫度3個因素作為響應面法的試驗因素，分別以A、B、C表示，每個因素的低、中、高試驗水平分別以-1、0、1進行編碼，試驗因素水平編碼如表1所示，Box-Behnken 設計方案及試驗結果見表2。為研究影響因素間的曲面效應，利用Design Expert軟件對表2數據進行多元二次回歸擬合，所得到的二次回歸方程的等高線及響應曲面見圖5至圖7。結果表明，在所選因素水平范圍內，均有最大響應值出現。

圖5結果表明，接種量和pH值對生物量的影響，響應面圖可以看出接種量曲面和pH值曲面變化幅度均較明顯，說明接種量和pH值對生物量的影響較為顯著，與二次回歸擬合方差分析結果一致，響應面的最高點同時也是等高線中的最小圖形的中心點。從等高線圖可以看出，圖形接近圓形，說明pH值和接種量交互作用不顯著。

圖6結果表明，培養溫度和pH 值對生物量的影響，可以看出培養溫度曲面變化幅度不大，pH 值曲面變化幅度較大，說明pH 值對生物量的影響較為顯著，當pH 值和培養溫度較低或較高時，都會降低香菇菌絲的生物量。從等高線圖可以看出，培養溫度和pH 值交互作用相對顯著。響應面的最高點同時也是等高線中的最小橢圓的中心點。

接種量和培養溫度對菌絲生物量的影響見圖7。從圖7可見，培養溫度曲面變化幅度不大，接種量曲面變化幅度較大，說明接種量對生物量的影響較為顯著，對同一等高線橢圓曲線分析，接種量變化很小區域需要培養溫度較大區域的變化，培養溫度和接種量對菌絲生物量的交互影響相對顯著。

2.6 最佳培養條件的預測和試驗驗證

根據Design Expert建立的數學模型進行參數的最優化分析，得出香菇液態發酵的優化條件為接種量12.42%、pH 值4.96、發酵溫度24.11 ℃。在此條件下，香菇生物量理論上可達17.58 g/L。為驗證該法的可行性，采用上述優化發酵條件進行香菇液態發酵試驗，為方便試驗操作，將上述優化發酵溫度調整為24 ℃，在單因素試驗測得的最適轉速 160 r/min 條件下，按照優化條件做3組平行試驗，測得香菇菌絲生物量實際平均值為17.76 g/L，試驗結果與模型預測相差1.02%。

3 討論與結論

以菌絲生物量和粗多糖產量為量化指標，對香菇液態發酵的接種量、培養溫度、pH值、轉速進行單因素試驗，在此基礎上通過響應面優化發酵試驗，建立了接種量、pH值、培養溫度3個因素和響應值菌體生物量之間的數學模型，研究用響應面法確定香菇液態發酵條件的可行性。結果表明，建立的模型的回歸效果顯著，能很好地預測菌絲體的生物量。確定優化發酵條件接種量為12.42%、pH 值為4.96、發酵溫度為 24.11 ℃，按照此優化條件實測菌絲體生物量為17.76 g/L，與理論值相差1.02%。表明采用響應面法對試驗數據進行回歸分析和條件優化能很好地預測香菇液態發酵條件，具有一定的可行性和實用價值。

參考文獻：

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