響應(yīng)面法優(yōu)化香菇液體發(fā)酵條件

張安寧　劉連成

摘要：在香菇液態(tài)發(fā)酵單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，依據(jù)Box-Benhnken（BBD）設(shè)計(jì)預(yù)測(cè)發(fā)酵的最佳條件為：接種量12.42%、pH值4.96、培養(yǎng)溫度24.11 ℃。在轉(zhuǎn)速為160 r/min條件下按照最佳條件培養(yǎng)，菌絲生物量實(shí)測(cè)值為17.76 g/L，與理論值17.58 g/L相差1.02%。

關(guān)鍵詞：響應(yīng)面法；液態(tài)發(fā)酵；條件優(yōu)化；生物量

中圖分類(lèi)號(hào)： TQ920.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）03-0200-04

香菇（Lentinula edodes）別稱(chēng)香蕈、香菌等，分類(lèi)上屬擔(dān)子菌門(mén)層菌綱傘菌目側(cè)耳科香菇屬[1]，是世界著名食用菌之一。它不僅肉質(zhì)肥厚脆嫩，香氣獨(dú)特，而且具有很高的藥用和保健價(jià)值[2-4]。我國(guó)是世界上香菇人工栽培最早的國(guó)家，也是最大的生產(chǎn)國(guó)。我國(guó)對(duì)香菇液態(tài)發(fā)酵工藝的研究雖有報(bào)道，但對(duì)其發(fā)酵條件的研究大多停留在單因素試驗(yàn)方面[5-7]，很少研究香菇液態(tài)發(fā)酵過(guò)程中各因素之間的交互作用。響應(yīng)面法已被廣泛應(yīng)用于生物過(guò)程的優(yōu)化[8-9]，但在香菇液態(tài)發(fā)酵條件研究方面報(bào)道較少。前期研究利用意楊下腳料作為主要碳源培養(yǎng)獲得高產(chǎn)香菇菌種（香菇933），并研究出該香菇菌種液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的適宜配方，在此基礎(chǔ)上為進(jìn)一步提高香菇產(chǎn)量和質(zhì)量，本試驗(yàn)利用響應(yīng)面法對(duì)其液態(tài)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，找出適合香菇菌絲生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)條件，為香菇液體菌種培養(yǎng)和規(guī)模液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 香菇933菌種，由江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院省級(jí)食品微生物工程實(shí)驗(yàn)室篩選提供。

1.1.2 主要儀器 ZQZY-HB型全溫振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器公司生產(chǎn)；LDZ5-2型高速離心機(jī)，北京京立離心機(jī)有限公司生產(chǎn)，JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎儀，廈門(mén)精密儀器有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 培養(yǎng)基 （1）母種和活化培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L（煮汁）、瓊脂20 g/L、葡萄糖15 g/L、KH2PO4 3 g/L、MgSO4 1 g/L、KCl 0.5 g/L、pH值自然。（2）液體種子和發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖20 g/L、酵母膏10 g/L、MgSO4 1 g/L、KH2PO4 3 g/L、KCl 0.5 g/L、初始pH值5～6。

1.2 方法

1.2.1 種子液的培養(yǎng) 取500 mL的三角瓶，加入100 mL液體種子培養(yǎng)基，經(jīng)121 ℃高壓蒸汽滅菌25 min，冷卻后接入蠶豆大活化后的斜面香菇菌種塊，在轉(zhuǎn)速為160 r/min的條件下24 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)5 d，得到帶有細(xì)密菌絲球的種子液。

1.2.2 菌絲體生物量的測(cè)定 將待測(cè)香菇菌絲發(fā)酵液放于離心機(jī)中，設(shè)定轉(zhuǎn)速為4 000 r/min，離心15 min，上清液用于多糖提取。用去離子水洗滌沉淀4次，置于60 ℃干燥至恒重，即得菌絲體生物量。

1.2.3 發(fā)酵液及香菇菌絲體總粗多糖的測(cè)定[10-11] 取上述發(fā)酵上清液加4倍體積95%乙醇，于4 ℃下靜置24 h，在 5 000 r/min 下離心15 min，沉淀用無(wú)水乙醇洗滌、低溫干燥，得到發(fā)酵液粗多糖。將上述“1.2.2”稱(chēng)重后的香菇菌絲體超聲波粉碎，加入約20倍體積的蒸餾水，98 ℃抽提3 h，過(guò)濾并將濾液濃縮，用4倍體積95%乙醇靜置24 h，在5 000 r/min下離心15 min，去上清液，沉淀用無(wú)水乙醇洗2次，低溫干燥，即為香菇菌絲粗多糖。發(fā)酵液粗多糖和香菇菌絲粗多糖混合后稱(chēng)重即得總粗多糖。

1.2.4 香菇液體發(fā)酵單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) （1）接種量處理：將裝有100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的 500 mL 三角瓶，經(jīng)121 ℃高壓蒸汽滅菌25 min，按不同接種量（體積比）將培養(yǎng)好的液體菌種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速為160 r/min的條件下 24 ℃ 振蕩培養(yǎng)3 d，每處理做3次平行試驗(yàn)，計(jì)算發(fā)酵液生物量和總粗多糖的平均值，下同。（2）pH值處理：用NaOH或HCl調(diào)節(jié)初始發(fā)酵液的pH值，設(shè)置不同的pH值，取100 mL裝入500 mL的三角瓶中，滅菌方法同（1），按12%（體積比）的接種量將培養(yǎng)好的液體菌種接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速為 160 r/min 的條件下24 ℃振蕩培養(yǎng)3 d。（3）溫度處理：按（1）的方法量取液體發(fā)酵培養(yǎng)基并滅菌，將液體菌種按12%（體積比）的接種量接種，設(shè)置不同溫度，在轉(zhuǎn)速160 r/min條件下恒溫培養(yǎng)3 d。（4）轉(zhuǎn)速的處理：按（1）的方法量取液體發(fā)酵培養(yǎng)基并滅菌，將液體菌種按12%（體積比）的接種量接種，設(shè)置不同轉(zhuǎn)速（r/min）進(jìn)行培養(yǎng)，24 ℃恒溫培養(yǎng)3 d。

1.2.5 香菇液態(tài)發(fā)酵工藝的優(yōu)化設(shè)計(jì) 選擇接種量、接種溫度、轉(zhuǎn)速3個(gè)因素對(duì)生物量和總多糖有顯著影響的因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過(guò)Design Expert軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，預(yù)測(cè)香菇液態(tài)發(fā)酵最優(yōu)工藝參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種量對(duì)香菇液態(tài)發(fā)酵的影響

接種量的大小與該菌在發(fā)酵液中生長(zhǎng)繁殖的速度有關(guān)。接種量大，種子進(jìn)入發(fā)酵液后適應(yīng)快，可以縮短發(fā)酵繁殖至高峰所需時(shí)間，種子液中含有大量的水解酶，使產(chǎn)物合成速度加快。大接種量往往使菌種生長(zhǎng)過(guò)快，造成營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)缺乏或溶解氧不足而不利于發(fā)酵；接種量不足，則會(huì)引起發(fā)酵前期菌絲量少、菌體生長(zhǎng)緩慢，使發(fā)酵周期延長(zhǎng)，還可能產(chǎn)生菌絲團(tuán)，導(dǎo)致發(fā)酵異常等。不同的接種量（3%～24%）對(duì)香菇液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)的生物量及粗多糖產(chǎn)量的綜合影響結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，在接種量3%～12%范圍內(nèi)，香菇生物量與總粗多糖產(chǎn)量均隨著接種量的增加而增加，增長(zhǎng)趨勢(shì)顯著，而在接種量大于12%以后，生物量及粗多糖產(chǎn)量增幅不大，在產(chǎn)物不增加情況下增加接種量意味著增加發(fā)酵成本，因此初步確定香菇液態(tài)發(fā)酵適宜接種量為12%。

2.2 初始pH 值對(duì)香菇液態(tài)發(fā)酵的影響

pH值的高低直接影響菌絲體的新陳代謝，導(dǎo)致微生物細(xì)胞膜的電荷變化，影響代謝過(guò)程中酶的活性，從而影響生物量和多糖代謝產(chǎn)物。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)初始發(fā)酵液不同的pH值3～7.5對(duì)香菇生物量及粗多糖產(chǎn)量的影響（圖2），結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵初始pH值為5.0時(shí)，香菇菌絲體生物量與粗多糖產(chǎn)量均達(dá)到最大值，分別為17.58、1.76 g/L。當(dāng)pH值高于5.0時(shí)生物量與粗多糖產(chǎn)量下降明顯，表明香菇菌絲適宜生長(zhǎng)在偏酸性環(huán)境，pH值5.0是香菇液態(tài)發(fā)酵較適pH值。

2.3 發(fā)酵溫度對(duì)香菇液態(tài)發(fā)酵的影響

試驗(yàn)以不同發(fā)酵溫度9～36 ℃進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定對(duì)香菇生物量及粗多糖產(chǎn)量的影響（圖3），結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵溫度從 9 ℃ 升至24 ℃時(shí)，香菇生物量與粗多糖產(chǎn)量均隨著溫度升高而增加，在24 ℃時(shí)粗多糖產(chǎn)量最高，為1.77 g/L。當(dāng)發(fā)酵溫度超過(guò)24 ℃時(shí)，粗多糖產(chǎn)量有下降趨勢(shì)；當(dāng)發(fā)酵溫度為27 ℃時(shí)，生物量最高，為17.57 g/L。溫度高于27 ℃，生物量開(kāi)始下降，因溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致微生物代謝加快，自身物質(zhì)消耗過(guò)快，生物量、粗多糖產(chǎn)量呈下降趨勢(shì)；高溫發(fā)酵生物熱增速較快，可促進(jìn)菌種老化，從而影響生物量增加和粗多糖的生物合成。初步選定香菇菌液體培養(yǎng)適宜發(fā)酵溫度為24 ℃。

2.4 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)香菇液態(tài)發(fā)酵的影響

不同轉(zhuǎn)速（120～200 r/min）條件下，液態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果（圖4）表明，當(dāng)轉(zhuǎn)速?gòu)?20 r/min升至160 r/min時(shí)，香菇生物量及香菇粗多糖產(chǎn)量呈上升趨勢(shì)；當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到160 r/min時(shí)菌絲體生物量和粗多糖產(chǎn)量均達(dá)最高，分別為17.45、1.73 g/L。轉(zhuǎn)速超過(guò)160 r/min時(shí)，菌絲生物量及粗多糖產(chǎn)量略有下降趨勢(shì)，因增加轉(zhuǎn)速雖然有利于增加溶氧和通氣效果，但增加了菌絲球相互間的摩擦和剪切作用，加大對(duì)菌絲球的機(jī)械刺激，從而影響生物量的增加。初步確定適合香菇菌絲生長(zhǎng)的搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min。

2.5 香菇液體發(fā)酵條件響應(yīng)面法分析

從單因素試驗(yàn)結(jié)果看出，香菇粗多糖產(chǎn)量與菌絲生物量變化趨勢(shì)較為一致，因此優(yōu)化液態(tài)發(fā)酵條件時(shí)選擇菌絲生物量作為量化指標(biāo)，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)，選取對(duì)生物量影響較大的接種量、pH值和培養(yǎng)溫度3個(gè)因素作為響應(yīng)面法的試驗(yàn)因素，分別以A、B、C表示，每個(gè)因素的低、中、高試驗(yàn)水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼，試驗(yàn)因素水平編碼如表1所示，Box-Behnken 設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。為研究影響因素間的曲面效應(yīng)，利用Design Expert軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，所得到的二次回歸方程的等高線及響應(yīng)曲面見(jiàn)圖5至圖7。結(jié)果表明，在所選因素水平范圍內(nèi)，均有最大響應(yīng)值出現(xiàn)。

圖5結(jié)果表明，接種量和pH值對(duì)生物量的影響，響應(yīng)面圖可以看出接種量曲面和pH值曲面變化幅度均較明顯，說(shuō)明接種量和pH值對(duì)生物量的影響較為顯著，與二次回歸擬合方差分析結(jié)果一致，響應(yīng)面的最高點(diǎn)同時(shí)也是等高線中的最小圖形的中心點(diǎn)。從等高線圖可以看出，圖形接近圓形，說(shuō)明pH值和接種量交互作用不顯著。

圖6結(jié)果表明，培養(yǎng)溫度和pH 值對(duì)生物量的影響，可以看出培養(yǎng)溫度曲面變化幅度不大，pH 值曲面變化幅度較大，說(shuō)明pH 值對(duì)生物量的影響較為顯著，當(dāng)pH 值和培養(yǎng)溫度較低或較高時(shí)，都會(huì)降低香菇菌絲的生物量。從等高線圖可以看出，培養(yǎng)溫度和pH 值交互作用相對(duì)顯著。響應(yīng)面的最高點(diǎn)同時(shí)也是等高線中的最小橢圓的中心點(diǎn)。

接種量和培養(yǎng)溫度對(duì)菌絲生物量的影響見(jiàn)圖7。從圖7可見(jiàn)，培養(yǎng)溫度曲面變化幅度不大，接種量曲面變化幅度較大，說(shuō)明接種量對(duì)生物量的影響較為顯著，對(duì)同一等高線橢圓曲線分析，接種量變化很小區(qū)域需要培養(yǎng)溫度較大區(qū)域的變化，培養(yǎng)溫度和接種量對(duì)菌絲生物量的交互影響相對(duì)顯著。

2.6 最佳培養(yǎng)條件的預(yù)測(cè)和試驗(yàn)驗(yàn)證

根據(jù)Design Expert建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行參數(shù)的最優(yōu)化分析，得出香菇液態(tài)發(fā)酵的優(yōu)化條件為接種量12.42%、pH 值4.96、發(fā)酵溫度24.11 ℃。在此條件下，香菇生物量理論上可達(dá)17.58 g/L。為驗(yàn)證該法的可行性，采用上述優(yōu)化發(fā)酵條件進(jìn)行香菇液態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)，為方便試驗(yàn)操作，將上述優(yōu)化發(fā)酵溫度調(diào)整為24 ℃，在單因素試驗(yàn)測(cè)得的最適轉(zhuǎn)速 160 r/min 條件下，按照優(yōu)化條件做3組平行試驗(yàn)，測(cè)得香菇菌絲生物量實(shí)際平均值為17.76 g/L，試驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測(cè)相差1.02%。

3 討論與結(jié)論

以菌絲生物量和粗多糖產(chǎn)量為量化指標(biāo)，對(duì)香菇液態(tài)發(fā)酵的接種量、培養(yǎng)溫度、pH值、轉(zhuǎn)速進(jìn)行單因素試驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵試驗(yàn)，建立了接種量、pH值、培養(yǎng)溫度3個(gè)因素和響應(yīng)值菌體生物量之間的數(shù)學(xué)模型，研究用響應(yīng)面法確定香菇液態(tài)發(fā)酵條件的可行性。結(jié)果表明，建立的模型的回歸效果顯著，能很好地預(yù)測(cè)菌絲體的生物量。確定優(yōu)化發(fā)酵條件接種量為12.42%、pH 值為4.96、發(fā)酵溫度為 24.11 ℃，按照此優(yōu)化條件實(shí)測(cè)菌絲體生物量為17.76 g/L，與理論值相差1.02%。表明采用響應(yīng)面法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析和條件優(yōu)化能很好地預(yù)測(cè)香菇液態(tài)發(fā)酵條件，具有一定的可行性和實(shí)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1]常明昌. 食用菌栽培[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2009：86-87.

[2]徐錦堂.中國(guó)藥用真菌學(xué)[M]. 北京：北京醫(yī)科大學(xué)、中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1997：3-16.

[3]Kodama，N. Murata，Y. Asakawa.A. Maitake D-fraction enhances antitumor efects and reduces immunosuppression by milomycin-C in tumor-bearing mice[J]. Nutrition，2005，21：624-629.

[4]盛劍秋，楊淑英，段芳齡. 香菇多糖的免疫調(diào)節(jié)作用研究進(jìn)展[J]. 胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，1998（1）：92-97.

[5]邵晨光，王宇萍，趙立勛. 香菇菌富硒液體發(fā)酵條件的優(yōu)選試驗(yàn)[J]. 中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2008，5（26）：23-24.

[6]吳 定，劉常金. 香菇液態(tài)深層發(fā)酵工藝研究[J]. 食品科學(xué)，1996，（6）：46-47.

[7]袁彤光，凌德全，林汝湘. 香菇液體種深層發(fā)酵工藝及菌液接蔗渣生料栽培試驗(yàn)[J]. 中國(guó)食用菌，2004，14（2）：41-43.

[8]吳有煒. 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理[M]. 蘇州：蘇州大學(xué)出版社，2002：135-142.

[9]王永菲，王成國(guó). 響應(yīng)面法的理論與應(yīng)用[J]. 中央民族大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2005，14（3）：236-239.

[10]張 佳. 香菇多糖提取與純化新工藝[D]. 北京：北京化工大學(xué)，2007：27-30.

[11]蔣家新，黃光榮. 香菇多糖提取工藝的研究[J]. 糧油食品科技，2003（3）：15-17.

2.2 初始pH 值對(duì)香菇液態(tài)發(fā)酵的影響

pH值的高低直接影響菌絲體的新陳代謝，導(dǎo)致微生物細(xì)胞膜的電荷變化，影響代謝過(guò)程中酶的活性，從而影響生物量和多糖代謝產(chǎn)物。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)初始發(fā)酵液不同的pH值3～7.5對(duì)香菇生物量及粗多糖產(chǎn)量的影響（圖2），結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵初始pH值為5.0時(shí)，香菇菌絲體生物量與粗多糖產(chǎn)量均達(dá)到最大值，分別為17.58、1.76 g/L。當(dāng)pH值高于5.0時(shí)生物量與粗多糖產(chǎn)量下降明顯，表明香菇菌絲適宜生長(zhǎng)在偏酸性環(huán)境，pH值5.0是香菇液態(tài)發(fā)酵較適pH值。

2.3 發(fā)酵溫度對(duì)香菇液態(tài)發(fā)酵的影響

試驗(yàn)以不同發(fā)酵溫度9～36 ℃進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定對(duì)香菇生物量及粗多糖產(chǎn)量的影響（圖3），結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵溫度從 9 ℃ 升至24 ℃時(shí)，香菇生物量與粗多糖產(chǎn)量均隨著溫度升高而增加，在24 ℃時(shí)粗多糖產(chǎn)量最高，為1.77 g/L。當(dāng)發(fā)酵溫度超過(guò)24 ℃時(shí)，粗多糖產(chǎn)量有下降趨勢(shì)；當(dāng)發(fā)酵溫度為27 ℃時(shí)，生物量最高，為17.57 g/L。溫度高于27 ℃，生物量開(kāi)始下降，因溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致微生物代謝加快，自身物質(zhì)消耗過(guò)快，生物量、粗多糖產(chǎn)量呈下降趨勢(shì)；高溫發(fā)酵生物熱增速較快，可促進(jìn)菌種老化，從而影響生物量增加和粗多糖的生物合成。初步選定香菇菌液體培養(yǎng)適宜發(fā)酵溫度為24 ℃。

2.4 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)香菇液態(tài)發(fā)酵的影響

不同轉(zhuǎn)速（120～200 r/min）條件下，液態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果（圖4）表明，當(dāng)轉(zhuǎn)速?gòu)?20 r/min升至160 r/min時(shí)，香菇生物量及香菇粗多糖產(chǎn)量呈上升趨勢(shì)；當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到160 r/min時(shí)菌絲體生物量和粗多糖產(chǎn)量均達(dá)最高，分別為17.45、1.73 g/L。轉(zhuǎn)速超過(guò)160 r/min時(shí)，菌絲生物量及粗多糖產(chǎn)量略有下降趨勢(shì)，因增加轉(zhuǎn)速雖然有利于增加溶氧和通氣效果，但增加了菌絲球相互間的摩擦和剪切作用，加大對(duì)菌絲球的機(jī)械刺激，從而影響生物量的增加。初步確定適合香菇菌絲生長(zhǎng)的搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min。

2.5 香菇液體發(fā)酵條件響應(yīng)面法分析

從單因素試驗(yàn)結(jié)果看出，香菇粗多糖產(chǎn)量與菌絲生物量變化趨勢(shì)較為一致，因此優(yōu)化液態(tài)發(fā)酵條件時(shí)選擇菌絲生物量作為量化指標(biāo)，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)，選取對(duì)生物量影響較大的接種量、pH值和培養(yǎng)溫度3個(gè)因素作為響應(yīng)面法的試驗(yàn)因素，分別以A、B、C表示，每個(gè)因素的低、中、高試驗(yàn)水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼，試驗(yàn)因素水平編碼如表1所示，Box-Behnken 設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。為研究影響因素間的曲面效應(yīng)，利用Design Expert軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，所得到的二次回歸方程的等高線及響應(yīng)曲面見(jiàn)圖5至圖7。結(jié)果表明，在所選因素水平范圍內(nèi)，均有最大響應(yīng)值出現(xiàn)。

圖5結(jié)果表明，接種量和pH值對(duì)生物量的影響，響應(yīng)面圖可以看出接種量曲面和pH值曲面變化幅度均較明顯，說(shuō)明接種量和pH值對(duì)生物量的影響較為顯著，與二次回歸擬合方差分析結(jié)果一致，響應(yīng)面的最高點(diǎn)同時(shí)也是等高線中的最小圖形的中心點(diǎn)。從等高線圖可以看出，圖形接近圓形，說(shuō)明pH值和接種量交互作用不顯著。

圖6結(jié)果表明，培養(yǎng)溫度和pH 值對(duì)生物量的影響，可以看出培養(yǎng)溫度曲面變化幅度不大，pH 值曲面變化幅度較大，說(shuō)明pH 值對(duì)生物量的影響較為顯著，當(dāng)pH 值和培養(yǎng)溫度較低或較高時(shí)，都會(huì)降低香菇菌絲的生物量。從等高線圖可以看出，培養(yǎng)溫度和pH 值交互作用相對(duì)顯著。響應(yīng)面的最高點(diǎn)同時(shí)也是等高線中的最小橢圓的中心點(diǎn)。

接種量和培養(yǎng)溫度對(duì)菌絲生物量的影響見(jiàn)圖7。從圖7可見(jiàn)，培養(yǎng)溫度曲面變化幅度不大，接種量曲面變化幅度較大，說(shuō)明接種量對(duì)生物量的影響較為顯著，對(duì)同一等高線橢圓曲線分析，接種量變化很小區(qū)域需要培養(yǎng)溫度較大區(qū)域的變化，培養(yǎng)溫度和接種量對(duì)菌絲生物量的交互影響相對(duì)顯著。

2.6 最佳培養(yǎng)條件的預(yù)測(cè)和試驗(yàn)驗(yàn)證

根據(jù)Design Expert建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行參數(shù)的最優(yōu)化分析，得出香菇液態(tài)發(fā)酵的優(yōu)化條件為接種量12.42%、pH 值4.96、發(fā)酵溫度24.11 ℃。在此條件下，香菇生物量理論上可達(dá)17.58 g/L。為驗(yàn)證該法的可行性，采用上述優(yōu)化發(fā)酵條件進(jìn)行香菇液態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)，為方便試驗(yàn)操作，將上述優(yōu)化發(fā)酵溫度調(diào)整為24 ℃，在單因素試驗(yàn)測(cè)得的最適轉(zhuǎn)速 160 r/min 條件下，按照優(yōu)化條件做3組平行試驗(yàn)，測(cè)得香菇菌絲生物量實(shí)際平均值為17.76 g/L，試驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測(cè)相差1.02%。

3 討論與結(jié)論

以菌絲生物量和粗多糖產(chǎn)量為量化指標(biāo)，對(duì)香菇液態(tài)發(fā)酵的接種量、培養(yǎng)溫度、pH值、轉(zhuǎn)速進(jìn)行單因素試驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵試驗(yàn)，建立了接種量、pH值、培養(yǎng)溫度3個(gè)因素和響應(yīng)值菌體生物量之間的數(shù)學(xué)模型，研究用響應(yīng)面法確定香菇液態(tài)發(fā)酵條件的可行性。結(jié)果表明，建立的模型的回歸效果顯著，能很好地預(yù)測(cè)菌絲體的生物量。確定優(yōu)化發(fā)酵條件接種量為12.42%、pH 值為4.96、發(fā)酵溫度為 24.11 ℃，按照此優(yōu)化條件實(shí)測(cè)菌絲體生物量為17.76 g/L，與理論值相差1.02%。表明采用響應(yīng)面法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析和條件優(yōu)化能很好地預(yù)測(cè)香菇液態(tài)發(fā)酵條件，具有一定的可行性和實(shí)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1]常明昌. 食用菌栽培[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2009：86-87.

[2]徐錦堂.中國(guó)藥用真菌學(xué)[M]. 北京：北京醫(yī)科大學(xué)、中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1997：3-16.

[3]Kodama，N. Murata，Y. Asakawa.A. Maitake D-fraction enhances antitumor efects and reduces immunosuppression by milomycin-C in tumor-bearing mice[J]. Nutrition，2005，21：624-629.

[4]盛劍秋，楊淑英，段芳齡. 香菇多糖的免疫調(diào)節(jié)作用研究進(jìn)展[J]. 胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，1998（1）：92-97.

[5]邵晨光，王宇萍，趙立勛. 香菇菌富硒液體發(fā)酵條件的優(yōu)選試驗(yàn)[J]. 中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2008，5（26）：23-24.

[6]吳 定，劉常金. 香菇液態(tài)深層發(fā)酵工藝研究[J]. 食品科學(xué)，1996，（6）：46-47.

[7]袁彤光，凌德全，林汝湘. 香菇液體種深層發(fā)酵工藝及菌液接蔗渣生料栽培試驗(yàn)[J]. 中國(guó)食用菌，2004，14（2）：41-43.

[8]吳有煒. 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理[M]. 蘇州：蘇州大學(xué)出版社，2002：135-142.

[9]王永菲，王成國(guó). 響應(yīng)面法的理論與應(yīng)用[J]. 中央民族大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2005，14（3）：236-239.

[10]張 佳. 香菇多糖提取與純化新工藝[D]. 北京：北京化工大學(xué)，2007：27-30.

[11]蔣家新，黃光榮. 香菇多糖提取工藝的研究[J]. 糧油食品科技，2003（3）：15-17.

2.2 初始pH 值對(duì)香菇液態(tài)發(fā)酵的影響

pH值的高低直接影響菌絲體的新陳代謝，導(dǎo)致微生物細(xì)胞膜的電荷變化，影響代謝過(guò)程中酶的活性，從而影響生物量和多糖代謝產(chǎn)物。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)初始發(fā)酵液不同的pH值3～7.5對(duì)香菇生物量及粗多糖產(chǎn)量的影響（圖2），結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵初始pH值為5.0時(shí)，香菇菌絲體生物量與粗多糖產(chǎn)量均達(dá)到最大值，分別為17.58、1.76 g/L。當(dāng)pH值高于5.0時(shí)生物量與粗多糖產(chǎn)量下降明顯，表明香菇菌絲適宜生長(zhǎng)在偏酸性環(huán)境，pH值5.0是香菇液態(tài)發(fā)酵較適pH值。

2.3 發(fā)酵溫度對(duì)香菇液態(tài)發(fā)酵的影響

試驗(yàn)以不同發(fā)酵溫度9～36 ℃進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定對(duì)香菇生物量及粗多糖產(chǎn)量的影響（圖3），結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵溫度從 9 ℃ 升至24 ℃時(shí)，香菇生物量與粗多糖產(chǎn)量均隨著溫度升高而增加，在24 ℃時(shí)粗多糖產(chǎn)量最高，為1.77 g/L。當(dāng)發(fā)酵溫度超過(guò)24 ℃時(shí)，粗多糖產(chǎn)量有下降趨勢(shì)；當(dāng)發(fā)酵溫度為27 ℃時(shí)，生物量最高，為17.57 g/L。溫度高于27 ℃，生物量開(kāi)始下降，因溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致微生物代謝加快，自身物質(zhì)消耗過(guò)快，生物量、粗多糖產(chǎn)量呈下降趨勢(shì)；高溫發(fā)酵生物熱增速較快，可促進(jìn)菌種老化，從而影響生物量增加和粗多糖的生物合成。初步選定香菇菌液體培養(yǎng)適宜發(fā)酵溫度為24 ℃。

2.4 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)香菇液態(tài)發(fā)酵的影響

不同轉(zhuǎn)速（120～200 r/min）條件下，液態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果（圖4）表明，當(dāng)轉(zhuǎn)速?gòu)?20 r/min升至160 r/min時(shí)，香菇生物量及香菇粗多糖產(chǎn)量呈上升趨勢(shì)；當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到160 r/min時(shí)菌絲體生物量和粗多糖產(chǎn)量均達(dá)最高，分別為17.45、1.73 g/L。轉(zhuǎn)速超過(guò)160 r/min時(shí)，菌絲生物量及粗多糖產(chǎn)量略有下降趨勢(shì)，因增加轉(zhuǎn)速雖然有利于增加溶氧和通氣效果，但增加了菌絲球相互間的摩擦和剪切作用，加大對(duì)菌絲球的機(jī)械刺激，從而影響生物量的增加。初步確定適合香菇菌絲生長(zhǎng)的搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min。

2.5 香菇液體發(fā)酵條件響應(yīng)面法分析

從單因素試驗(yàn)結(jié)果看出，香菇粗多糖產(chǎn)量與菌絲生物量變化趨勢(shì)較為一致，因此優(yōu)化液態(tài)發(fā)酵條件時(shí)選擇菌絲生物量作為量化指標(biāo)，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)，選取對(duì)生物量影響較大的接種量、pH值和培養(yǎng)溫度3個(gè)因素作為響應(yīng)面法的試驗(yàn)因素，分別以A、B、C表示，每個(gè)因素的低、中、高試驗(yàn)水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼，試驗(yàn)因素水平編碼如表1所示，Box-Behnken 設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。為研究影響因素間的曲面效應(yīng)，利用Design Expert軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，所得到的二次回歸方程的等高線及響應(yīng)曲面見(jiàn)圖5至圖7。結(jié)果表明，在所選因素水平范圍內(nèi)，均有最大響應(yīng)值出現(xiàn)。

圖5結(jié)果表明，接種量和pH值對(duì)生物量的影響，響應(yīng)面圖可以看出接種量曲面和pH值曲面變化幅度均較明顯，說(shuō)明接種量和pH值對(duì)生物量的影響較為顯著，與二次回歸擬合方差分析結(jié)果一致，響應(yīng)面的最高點(diǎn)同時(shí)也是等高線中的最小圖形的中心點(diǎn)。從等高線圖可以看出，圖形接近圓形，說(shuō)明pH值和接種量交互作用不顯著。

圖6結(jié)果表明，培養(yǎng)溫度和pH 值對(duì)生物量的影響，可以看出培養(yǎng)溫度曲面變化幅度不大，pH 值曲面變化幅度較大，說(shuō)明pH 值對(duì)生物量的影響較為顯著，當(dāng)pH 值和培養(yǎng)溫度較低或較高時(shí)，都會(huì)降低香菇菌絲的生物量。從等高線圖可以看出，培養(yǎng)溫度和pH 值交互作用相對(duì)顯著。響應(yīng)面的最高點(diǎn)同時(shí)也是等高線中的最小橢圓的中心點(diǎn)。

接種量和培養(yǎng)溫度對(duì)菌絲生物量的影響見(jiàn)圖7。從圖7可見(jiàn)，培養(yǎng)溫度曲面變化幅度不大，接種量曲面變化幅度較大，說(shuō)明接種量對(duì)生物量的影響較為顯著，對(duì)同一等高線橢圓曲線分析，接種量變化很小區(qū)域需要培養(yǎng)溫度較大區(qū)域的變化，培養(yǎng)溫度和接種量對(duì)菌絲生物量的交互影響相對(duì)顯著。

2.6 最佳培養(yǎng)條件的預(yù)測(cè)和試驗(yàn)驗(yàn)證

根據(jù)Design Expert建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行參數(shù)的最優(yōu)化分析，得出香菇液態(tài)發(fā)酵的優(yōu)化條件為接種量12.42%、pH 值4.96、發(fā)酵溫度24.11 ℃。在此條件下，香菇生物量理論上可達(dá)17.58 g/L。為驗(yàn)證該法的可行性，采用上述優(yōu)化發(fā)酵條件進(jìn)行香菇液態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)，為方便試驗(yàn)操作，將上述優(yōu)化發(fā)酵溫度調(diào)整為24 ℃，在單因素試驗(yàn)測(cè)得的最適轉(zhuǎn)速 160 r/min 條件下，按照優(yōu)化條件做3組平行試驗(yàn)，測(cè)得香菇菌絲生物量實(shí)際平均值為17.76 g/L，試驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測(cè)相差1.02%。

3 討論與結(jié)論

以菌絲生物量和粗多糖產(chǎn)量為量化指標(biāo)，對(duì)香菇液態(tài)發(fā)酵的接種量、培養(yǎng)溫度、pH值、轉(zhuǎn)速進(jìn)行單因素試驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵試驗(yàn)，建立了接種量、pH值、培養(yǎng)溫度3個(gè)因素和響應(yīng)值菌體生物量之間的數(shù)學(xué)模型，研究用響應(yīng)面法確定香菇液態(tài)發(fā)酵條件的可行性。結(jié)果表明，建立的模型的回歸效果顯著，能很好地預(yù)測(cè)菌絲體的生物量。確定優(yōu)化發(fā)酵條件接種量為12.42%、pH 值為4.96、發(fā)酵溫度為 24.11 ℃，按照此優(yōu)化條件實(shí)測(cè)菌絲體生物量為17.76 g/L，與理論值相差1.02%。表明采用響應(yīng)面法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析和條件優(yōu)化能很好地預(yù)測(cè)香菇液態(tài)發(fā)酵條件，具有一定的可行性和實(shí)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1]常明昌. 食用菌栽培[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2009：86-87.

[2]徐錦堂.中國(guó)藥用真菌學(xué)[M]. 北京：北京醫(yī)科大學(xué)、中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1997：3-16.

[3]Kodama，N. Murata，Y. Asakawa.A. Maitake D-fraction enhances antitumor efects and reduces immunosuppression by milomycin-C in tumor-bearing mice[J]. Nutrition，2005，21：624-629.

[4]盛劍秋，楊淑英，段芳齡. 香菇多糖的免疫調(diào)節(jié)作用研究進(jìn)展[J]. 胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，1998（1）：92-97.

[5]邵晨光，王宇萍，趙立勛. 香菇菌富硒液體發(fā)酵條件的優(yōu)選試驗(yàn)[J]. 中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2008，5（26）：23-24.

[6]吳 定，劉常金. 香菇液態(tài)深層發(fā)酵工藝研究[J]. 食品科學(xué)，1996，（6）：46-47.

[7]袁彤光，凌德全，林汝湘. 香菇液體種深層發(fā)酵工藝及菌液接蔗渣生料栽培試驗(yàn)[J]. 中國(guó)食用菌，2004，14（2）：41-43.

[8]吳有煒. 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理[M]. 蘇州：蘇州大學(xué)出版社，2002：135-142.

[9]王永菲，王成國(guó). 響應(yīng)面法的理論與應(yīng)用[J]. 中央民族大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2005，14（3）：236-239.

[10]張 佳. 香菇多糖提取與純化新工藝[D]. 北京：北京化工大學(xué)，2007：27-30.

[11]蔣家新，黃光榮. 香菇多糖提取工藝的研究[J]. 糧油食品科技，2003（3）：15-17.