蛋白質谷氨酰胺酶發酵條件的初步優化

何燦等

摘要：蛋白質谷氨酰胺酶在食品行業中具有廣泛的應用前景，通過對蛋白質的脫酰胺基作用，可以促進植物蛋白的溶解、乳化和起泡等。對產吲哚金黃桿菌產生蛋白質谷氨酰胺酶的代謝曲線和發酵培養基配方進行研究，結果表明，發酵液氨濃度和pH值隨發酵時間延長而升高，發酵12 h酶活最高，發酵培養基初始pH值為5.2時酶活最高；通過單因素試驗，確定乳糖和蔗糖為最適碳源，大豆蛋白胨和多聚蛋白胨為最適氮源；正交試驗結果表明，大豆蛋白胨、乳糖和Tween 80最適濃度分別為1.2%、0.7%和0.15%，培養基優化后酶活最高為0.661 U/mL。

關鍵詞：產吲哚金黃桿菌；蛋白質谷氨酰胺酶；培養基；優化

中圖分類號： TS201.3 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）03-0218-03

植物蛋白（如大豆蛋白、小麥蛋白和玉米蛋白等）在食品工業中應用非常廣泛，但由于在弱酸性環境中（大多數食品系統的pH值范圍）存在溶解性差、穩定性低等問題，如在植物蛋白飲料產品中出現蛋白沉淀、脂肪上浮現象，使產品口感和外觀變差，產品保質期縮短[1]，造成植物蛋白在生產應用中受到限制。

植物蛋白含有大量的谷氨酰胺殘基，通過脫酰胺基作用可以改善植物蛋白的溶解性。Yong等通過酶法分別脫去部分玉米膠蛋白和小麥蛋白的氨基，使蛋白質溶解性得到提高[2-3]。通過蛋白質的脫氨基作用，不僅能夠提高蛋白質在酸性條件下的溶解性，而且可以提高其乳化性、發泡性和凝膠性等多種功能特性，這些都是食品蛋白質的必需性能。因此，催化蛋白質脫酰胺基酶在工業應用中具有很大潛力。目前，報道能催化蛋白質脫酰胺基作用的酶有谷氨酰胺轉胺酶、蛋白酶和肽谷氨酰胺酶[4-6]。蛋白酶和谷氨酰胺轉胺酶的主要酶促反應不是蛋白質殘基中谷氨酰胺的脫氨基作用，因此，用于植物蛋白脫氨時有副作用，會給食品帶來不利影響。肽谷氨酰胺酶雖然脫氨具有專一性，但是僅以多肽為底物進行反應，對大分子蛋白質沒有作用[6]。2000年，日本學者Yamaguchi等發現了1種由微生物產生的新的脫酰胺基酶——微生物蛋白質谷氨酰胺酶[7]，該酶是由從土壤中分離出的1株金黃桿菌（Chryseobacterium proteolyticum）產生，對酪氨酸和 Cbz-Gln-Gly（苯甲基氧化碳酰-L-谷氨酰胺甘氨酸）均有脫酰胺基活性，而沒有蛋白酶和谷氨酰胺轉胺酶活性，這是首次報道的微生物產蛋白質谷氨酰胺酶[3]。

筆者所在實驗室從土壤中篩選出了1株產吲哚金黃桿菌（Chryseobacterium indologenes），能夠產生微生物蛋白質谷氨酰胺酶。本研究對該產吲哚金黃桿菌發酵培養基配方進行初步優化，為其進一步工業化應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 產吲哚金黃桿菌由華東師范大學微生物實驗室分離并保存。

1.1.2 試劑 Cbz-Gln-Gly，購自Sigma公司；大豆蛋白胨、多聚蛋白胨生化純，購自上海生工生物科技有限公司；酵母提取物，購自安琪酵母有限公司；苯酚、硝普鈉等常規試劑分析純，購自上海化學試劑公司。

1.1.3 培養基 種子培養基（1 000 mL）：多聚蛋白胨10 g、酵母提取物2 g、MgSO4·7H2O 1 g，調節pH值至7.0；基礎發酵培養基（1 000 mL）：乳糖5 g、多聚蛋白胨10 g、NaH2PO4·H2O 1.7 g、 K2HPO4 0.25 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、FeSO4·7H2O 0.05 g，調節pH值至7.2。

1.2 方法

1.2.1 培養方法 種子培養：菌種活化后，以2%接種量接入種子培養基，200 r/min、25 ℃震蕩培養12 h。發酵培養：以1%接種量把種子培養液接種到發酵培養基，200 r/min、25 ℃震蕩培養。

1.2.2 酶活性測定方法[7] 100 μL含有10 mmol/L Cbz-Gln-Gly和175.6 mmol/L磷酸鈉緩沖液的底物溶液，與 10 μL 酶液混合均勻，37 ℃溫浴30 min，然后加入100 μL 12%三氯乙酸終止反應；對照反應是先加入三氯乙酸，后再加入酶液。18 000 r/min 離心5 min，上清液中釋放的氨用盧玉棋的方法[8]檢測。酶活性單位定義為：釋放氨1 μmol/min的酶量為1個酶活性單位。

2 結果與分析

2.1 產吲哚金黃桿菌代謝曲線

從圖1可以看出，產吲哚金黃桿菌延滯期較短，接種后 4 h 進入對數期，發酵12 h后逐漸進入穩定期，最終發酵液D600 nm可達到1.187；發酵液pH值隨著發酵時間的延長不斷升高，當進入穩定期時pH值達到8.7，這一變化趨勢和發酵液中氨濃度趨勢一樣，這是因為發酵液中蛋白質谷氨酰胺酶分解蛋白質產生氨，氨濃度不斷升高，導致pH值升高，與Yamaguchi等的研究結果[7]一致。蛋白質谷氨酰胺酶的活性隨著發酵時間延長而增加，12 h達到最大，為0.37 U/mL，隨后又略有下降。

2.2 初始發酵pH值

發酵液初始pH值分別設為5.2、6.2、7.2、8.2、9.2，發酵12 h時測定酶活性。由圖2可見，pH值5.2時酶活性最高，為0.514 U/mL，這可能是因為發酵后期大量產氨，導致pH值升高（圖1），初始pH值低可以延緩pH值升高，而較低的pH值有利于增加酶活性。

2.3 發酵培養基對蛋白質谷氨酰胺酶的影響

2.3.1 碳源 試驗選擇速效碳源葡萄糖、蔗糖、乳糖和緩效碳源糊精、淀粉作為常規發酵培養基碳源，分別在基礎培養基中添加5%濃度，發酵12 h后測定酶活性。由圖3可見，當碳源為5%乳糖和5%蔗糖時酶活性較高，分別為 0.390 U/mL

和 0.412 U/mL，表明速效碳源有利于產酶。

2.3.2 氮源 試驗選取有機氮源植物水解蛋白、多聚蛋白胨、大豆蛋白胨和無機氮源硫酸銨、氯化銨作為氮源，在基礎培養基中添加1%濃度，發酵12 h后測定酶活性。由圖4可以看出，以1%大豆蛋白胨和1%多聚蛋白胨為氮源時酶活性較高，分別為0.460 U/mL和0.480 U/mL，表明有機氮源適合產酶。

2.3.3 表面活性劑 不同表面活性劑對產酶有很大影響。由表1可見，0.15% Tween 80和0.15% Tween 40酶活性最高，均為0.530 U/mL，和對照相比，酶活性增加了26%；在試驗濃度范圍內，Tween 20和曲拉通比對照酶活性低。3 小結與討論

脫氨基是提高植物蛋白食品功能最有價值的方法之一。蛋白質谷氨酰胺殘基側鏈酰胺基中的氨基脫掉后生成羧基，導致蛋白質水合程度和負電荷增加，因此，蛋白質的溶解性增加[9]。Matsudomi等研究表明，即使少量的脫氨也會大幅度提高蛋白質的功能特性[10]。化學脫氨基法雖然可以提高植物蛋白（如小麥蛋白）的乳化性和起泡性，但是，該方法會引起蛋白質肽鏈斷裂，導致蛋白質水解而失去蛋白質的功能。與化學脫氨法相比，酶法脫氨更為理想，底物專一，如蛋白質谷氨酰胺酶僅作用于蛋白質中的谷氨酰胺，反應條件溫和，而且安全性高。

對蛋白質脫氨的酶目前報道比較多的主要有谷氨酰胺轉胺酶、蛋白酶、肽谷氨酰胺酶和蛋白質谷氨酰胺酶。蛋白質谷氨酰胺酶已經應用于α-玉米蛋白、小麥蛋白和大豆蛋白[2-3，11]，還有乳清蛋白、脫脂牛奶[12-13]。微生物蛋白質谷氨酰胺酶由Yamaguchi等2000年首次從Chryseobacterium proteolyticum發酵產生，并對土壤中分離的菌種進行了鑒定，對其發酵進行了初步研究，其發酵上清液以Cbz-Gln-Gly為底物的谷氨酰胺酶活性最高，為0.258 U/mL，且最高酶活性在發酵24 h出現[7]。本試驗通過單因素試驗和正交試驗，得到最優培養配方（1 000 mL）為大豆蛋白胨12 g、乳糖7 g、Tween 80 1.5 g、NaH2PO4·H2O 1.7 g、K2HPO4 0.25 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、FeSO4·7H2O 0.05 g，經過該優化培養基發酵，最高酶活性可達0.661 U/mL，遠遠高于Yamaguchi等的試驗結果，且最高酶活性在發酵12 h后即可出現。

參考文獻：

[1]李向紅，周小玲，劉永樂，等. 蛋白質谷氨酰胺酶對米谷蛋白功能性質的影響[J]. 食品科學，2010，31（17）：192-196.

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[3]Yong Y H，Yamaguchi S，Matsumura Y. Effects of enzymatic deamidation by protein-glutaminase on structure and functional properties of wheat gluten[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54（16）：6034-6040.

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[11]Suppavorasatit I，De Mejia E G，Cadwallader K R. Optimization of the enzymatic deamidation of soy protein by protein-glutaminase and its effect on the functional properties of the protein[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59（21）：11621-11628.

[12]Gu Y S，Matsumura Y，Yamaguchi S，et al. Action of protein-glutaminase on alpha-lactalbumin in the native and molten globule states[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2001，49（12）：5999-6005.

[13]Miwa N，Yokoyama K，Wakabayashi H，et al. Effect of deamidation by protein-glutaminase on physicochemical and functional properties of skim milk[J]. International Dairy Journal，2010，20（6）：393-399.

和 0.412 U/mL，表明速效碳源有利于產酶。

2.3.2 氮源 試驗選取有機氮源植物水解蛋白、多聚蛋白胨、大豆蛋白胨和無機氮源硫酸銨、氯化銨作為氮源，在基礎培養基中添加1%濃度，發酵12 h后測定酶活性。由圖4可以看出，以1%大豆蛋白胨和1%多聚蛋白胨為氮源時酶活性較高，分別為0.460 U/mL和0.480 U/mL，表明有機氮源適合產酶。

2.3.3 表面活性劑 不同表面活性劑對產酶有很大影響。由表1可見，0.15% Tween 80和0.15% Tween 40酶活性最高，均為0.530 U/mL，和對照相比，酶活性增加了26%；在試驗濃度范圍內，Tween 20和曲拉通比對照酶活性低。3 小結與討論

脫氨基是提高植物蛋白食品功能最有價值的方法之一。蛋白質谷氨酰胺殘基側鏈酰胺基中的氨基脫掉后生成羧基，導致蛋白質水合程度和負電荷增加，因此，蛋白質的溶解性增加[9]。Matsudomi等研究表明，即使少量的脫氨也會大幅度提高蛋白質的功能特性[10]。化學脫氨基法雖然可以提高植物蛋白（如小麥蛋白）的乳化性和起泡性，但是，該方法會引起蛋白質肽鏈斷裂，導致蛋白質水解而失去蛋白質的功能。與化學脫氨法相比，酶法脫氨更為理想，底物專一，如蛋白質谷氨酰胺酶僅作用于蛋白質中的谷氨酰胺，反應條件溫和，而且安全性高。

對蛋白質脫氨的酶目前報道比較多的主要有谷氨酰胺轉胺酶、蛋白酶、肽谷氨酰胺酶和蛋白質谷氨酰胺酶。蛋白質谷氨酰胺酶已經應用于α-玉米蛋白、小麥蛋白和大豆蛋白[2-3，11]，還有乳清蛋白、脫脂牛奶[12-13]。微生物蛋白質谷氨酰胺酶由Yamaguchi等2000年首次從Chryseobacterium proteolyticum發酵產生，并對土壤中分離的菌種進行了鑒定，對其發酵進行了初步研究，其發酵上清液以Cbz-Gln-Gly為底物的谷氨酰胺酶活性最高，為0.258 U/mL，且最高酶活性在發酵24 h出現[7]。本試驗通過單因素試驗和正交試驗，得到最優培養配方（1 000 mL）為大豆蛋白胨12 g、乳糖7 g、Tween 80 1.5 g、NaH2PO4·H2O 1.7 g、K2HPO4 0.25 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、FeSO4·7H2O 0.05 g，經過該優化培養基發酵，最高酶活性可達0.661 U/mL，遠遠高于Yamaguchi等的試驗結果，且最高酶活性在發酵12 h后即可出現。

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[13]Miwa N，Yokoyama K，Wakabayashi H，et al. Effect of deamidation by protein-glutaminase on physicochemical and functional properties of skim milk[J]. International Dairy Journal，2010，20（6）：393-399.

和 0.412 U/mL，表明速效碳源有利于產酶。

2.3.2 氮源 試驗選取有機氮源植物水解蛋白、多聚蛋白胨、大豆蛋白胨和無機氮源硫酸銨、氯化銨作為氮源，在基礎培養基中添加1%濃度，發酵12 h后測定酶活性。由圖4可以看出，以1%大豆蛋白胨和1%多聚蛋白胨為氮源時酶活性較高，分別為0.460 U/mL和0.480 U/mL，表明有機氮源適合產酶。

2.3.3 表面活性劑 不同表面活性劑對產酶有很大影響。由表1可見，0.15% Tween 80和0.15% Tween 40酶活性最高，均為0.530 U/mL，和對照相比，酶活性增加了26%；在試驗濃度范圍內，Tween 20和曲拉通比對照酶活性低。3 小結與討論

脫氨基是提高植物蛋白食品功能最有價值的方法之一。蛋白質谷氨酰胺殘基側鏈酰胺基中的氨基脫掉后生成羧基，導致蛋白質水合程度和負電荷增加，因此，蛋白質的溶解性增加[9]。Matsudomi等研究表明，即使少量的脫氨也會大幅度提高蛋白質的功能特性[10]。化學脫氨基法雖然可以提高植物蛋白（如小麥蛋白）的乳化性和起泡性，但是，該方法會引起蛋白質肽鏈斷裂，導致蛋白質水解而失去蛋白質的功能。與化學脫氨法相比，酶法脫氨更為理想，底物專一，如蛋白質谷氨酰胺酶僅作用于蛋白質中的谷氨酰胺，反應條件溫和，而且安全性高。

對蛋白質脫氨的酶目前報道比較多的主要有谷氨酰胺轉胺酶、蛋白酶、肽谷氨酰胺酶和蛋白質谷氨酰胺酶。蛋白質谷氨酰胺酶已經應用于α-玉米蛋白、小麥蛋白和大豆蛋白[2-3，11]，還有乳清蛋白、脫脂牛奶[12-13]。微生物蛋白質谷氨酰胺酶由Yamaguchi等2000年首次從Chryseobacterium proteolyticum發酵產生，并對土壤中分離的菌種進行了鑒定，對其發酵進行了初步研究，其發酵上清液以Cbz-Gln-Gly為底物的谷氨酰胺酶活性最高，為0.258 U/mL，且最高酶活性在發酵24 h出現[7]。本試驗通過單因素試驗和正交試驗，得到最優培養配方（1 000 mL）為大豆蛋白胨12 g、乳糖7 g、Tween 80 1.5 g、NaH2PO4·H2O 1.7 g、K2HPO4 0.25 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、FeSO4·7H2O 0.05 g，經過該優化培養基發酵，最高酶活性可達0.661 U/mL，遠遠高于Yamaguchi等的試驗結果，且最高酶活性在發酵12 h后即可出現。

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[12]Gu Y S，Matsumura Y，Yamaguchi S，et al. Action of protein-glutaminase on alpha-lactalbumin in the native and molten globule states[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2001，49（12）：5999-6005.

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