Folin—Ciocalteu法檢測菜籽多酚含量的優化研究

熊俐等

摘要：為了建立快速、準確地測定菜籽多酚含量的方法，以單寧酸為標準品，研究了Folin-Ciocalteu比色法測定菜籽多酚含量的適宜條件。結果表明，在顯色試劑2.5 mL、飽和Na2CO3溶液4 mL、反應溫度40 ℃、反應時間50 min、比色波長757 nm的條件下，菜籽多酚濃度在 2～20 mg/L 范圍內與吸光度呈良好的線性關系；Folin-Ciocalteu法的穩定性試驗、精密度試驗、重現性試驗、回收率試驗的相對標準偏差（RSD）分別為0.419%、1.295%、2.30%、1.49%，表明該法能夠快速、準確地測定菜籽多酚含量。

關鍵詞：菜籽；多酚；Folin-Ciocalteu比色法；檢測條件

中圖分類號：TS201.2；O657.32 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2014）03-0255-03

多酚廣泛存在于植物體中，是一類復雜的酚類次生代謝產物，具有多元酚結構，對活性氧等自由基有較強的捕捉能力，因此具有很強的抗氧化性和清除自由基的能力[1]。菜籽中含有1.5%～3%的多酚類物質，其多酚含量是其他油料種子中的10～30倍。研究證實，菜籽多酚具有抗腫瘤、降血糖、抑菌、抗氧化、清除自由基等生理功能和生物活性[2]，具有廣闊的開發前景。測定多酚的常用方法有高錳酸鉀滴定法[3]、香草醛法[4]、Folin-酚法[2]和鐵氰化鉀分光光度法[5]等。其中，高錳酸鉀滴定法的滴定終點較難觀察，測定靈敏度較低；香草醛法和鐵氰化鉀分光光度法對測定條件要求嚴格，穩定性較差，干擾因素較多，易出現沉淀；而Folin-酚比色法在測定多酚化合物時能在很大程度上克服以上缺點。Folin-酚法包括Folin-Denis法（F-D法）和Folin- Ciocalteu法（F-C法）。F-C法是F-D法的改進方法，它在F-D法顯色劑中加入鋰鹽，克服了F-D法顯色劑的不穩定性，較之更為靈敏[6]。鄭仕宏等[7]、何志勇等[8]、劉麗香等[9]的研究結果表明，不同植物中Folin- Ciocalteu法比色條件的選擇差異較大，適宜的顯色劑、堿液含量及比例各不相同，顯色時間和溫度有很大差別，測定波長也不同。

國內常用F-D法測定菜籽及其加工品中的多酚含量，較少見用F-C法檢測菜籽多酚含量的報道，更沒有對其反應條件進行過探索。本試驗采用Folin-Ciocalteu法測定菜籽多酚的含量，探討最適顯色條件和比色條件，同時對其穩定性、精密度、重現性、回收率等展開研究，以期建立起一種簡便、快速、穩定、準確的檢測菜籽多酚含量的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料 菜籽購于四川省自貢市燈桿壩農貿市場，用面條壓片機將其碾壓破碎成片狀，60 ℃干燥2～3 h，備用。

1.1.2 藥品 乙醇、沒食子酸標準品、單寧酸標準品、鎢酸鈉、鉬酸鈉、濃磷酸、濃鹽酸、硫酸鋰、碳酸鈉等，均為分析純。

1.1.3 儀器 UV1000型紫外-可見分光光度計，DK-98-11A型數顯恒溫水浴鍋，AR1140型電子分析天平，MT-125C型面條壓片機，DHG-9070B型鼓風干燥箱等。

1.2 試驗方法

1.2.1 菜籽多酚提取液的制備 參考張曉麗等的研究[10]來制備菜籽多酚提取液。

1.2.2 Folin-Ciocalteu法顯色劑的配制 在回流裝置內加入50 g鎢酸鈉、12.5 g鉬酸鈉、350 mL蒸餾水、25 mL濃磷酸及50 mL濃鹽酸，充分混勻，以小火回流10 h，再加入75 g硫酸鋰、25 mL蒸餾水、數滴溴水，然后開口繼續沸騰15 min，至溴水完全揮發為止，冷卻后定容500 mL，過濾，濾液呈綠色，存于棕色瓶中。使用時加入1倍體積的蒸餾水，使酸的濃度為1 mol/L，置于冰箱中保存。

1.2.3 標準品溶液的配制 分別稱取25.0 mg沒食子酸和單寧酸，用70%乙醇完全溶解，定容至25 mL容量瓶中，配制成濃度為1.0 mg/mL的沒食子酸標液和單寧酸標液。

1.2.4 Folin-Ciocalteu法檢測流程 精確吸取一定量的待測樣品，放入25 mL容量瓶內，加10 mL 70%乙醇，搖勻，加入一定量的顯色劑和一定量的飽和Na2CO3溶液，并用70%乙醇定容至25 mL，在一定溫度下避光反應一定時間后，以70%乙醇為空白對照，在一定波長下測定吸光度。

1.2.5 Folin-Ciocalteu法檢測條件研究

1.2.5.1 比色波長和標準品的研究 取沒食子酸標液、單寧酸標液和菜籽提取液的稀釋液各0.5 mL，分別與2 mL顯色試劑和4.5 mL飽和Na2CO3溶液混合均勻，用70%乙醇定容，室溫避光放置1 h，用紫外-可見分光光度計在200～900 nm波長范圍內測定吸光度，得到沒食子酸、單寧酸和菜籽提取液的吸收光譜，以此確定最適宜的標準物和比色波長。

1.2.5.2 顯色時間的研究 取單寧酸標液0.5 mL，顯色試劑與飽和碳酸鈉溶液分別為2.0、4.5 mL，比色波長為 757 nm，35 ℃條件下研究反應時間（10、20、30、40、50、60、70、80 min）對吸光度的影響。

1.2.5.3 反應溫度的研究 研究不同反應溫度（20、25、30、35、40、45、50 ℃）對吸光度的影響，反應時間為50 min，其他條件同“1.2.5.2”節所述。

1.2.5.4 飽和Na2CO3溶液添加量的研究 研究飽和Na2CO3 溶液添加量（1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL）對吸光度的影響，反應溫度為40 ℃，其他條件同“1.2.5.3”節所述。

1.2.5.5 Folin-Ciocalteu顯色劑用量的研究 研究顯色劑用量（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL）對吸光度的影響，飽和Na2CO3溶液添加量為4 mL，其他條件同“1.2.5.4”節所述。endprint

1.2.6 標準曲線的繪制 精確吸取0、0.05、0.10、0.15、020、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mL單寧酸標準溶液，按照前期試驗確定的適宜條件進行顯色反應，檢測吸光度。以吸光度為縱坐標（y）、單寧酸濃度（mg/L）為橫坐標（x）繪制標準曲線。

1.2.7 Folin-Ciocalteu比色方法評價

1.2.7.1 穩定性試驗 取菜籽提取液進行顯色反應，反應完全（50 min）后在30 ℃下避光放置0、15、30、45、60、90、120 min 后測定吸光度，根據吸光度的變化評價該比色法在一段時間內的穩定性。

1.2.7.2 精密度試驗 從同一份菜籽提取液中取6份樣本進行Folin-Ciocalteu比色法檢測，計算各樣本中的多酚含量（mg/g），以分析結果的相對標準偏差評價該比色方法的精密度。

1.2.7.3 重現性試驗 從同一份菜籽原料中取5份樣品，分別進行多酚提取，然后利用Folin-Ciocalteu比色法檢測各提取液的多酚含量（mg/g），并計算結果的相對標準偏差，以評價該比色方法的重現性。

1.2.7.4 加標回收試驗 往菜籽提取液中加入不同量的單寧酸，分別測定其多酚含量，并計算其回收率和相對標準偏差，以評價該比色方法的準確度和可靠性。

2 結果與分析

2.1 Folin-Ciocalteu法檢測條件研究

2.1.1 比色波長和標準品 由圖1可知，沒食子酸、單寧酸和菜籽提取液與Folin-Ciocalteu試劑反應顯色后，均在 730～770 nm 范圍內有一明顯吸收峰。其中，沒食子酸在 736 nm 處吸收最強，單寧酸在762 nm處吸收最強，菜籽提取液在757 nm處吸收最強。因此本試驗以單寧酸為標準品，以 757 nm 為菜籽多酚比色測定的波長。

2.1.2 顯色時間 由圖2可知，10～40 min時，吸光度隨反應時間的延長而快速增加，50 min后顯色反應完全并趨于穩定，因此確定50 min為顯色反應時間。

2.1.3 反應溫度 由圖3可知，反應溫度在20～35 ℃時，吸光度快速增加，40 ℃時吸光度達到最高，為0.476，之后吸光度隨溫度升高而下降，因此確定顯色反應溫度為40 ℃。研究結果說明反應溫度能影響比色效果，溫度過低或過高均不利于多酚顯色。

2.1.4 飽和Na2CO3 溶液添加量 由圖4可知，飽和Na2CO3溶液添加量在1～4 mL時，隨著添加量增加，吸光度逐漸增加，4 mL時達到最大值，為0.496，之后吸光度隨Na2CO3溶液添加量的增加而降低，因此確定顯色反應體系中加入飽和Na2CO3溶液的體積為4 mL。研究結果說明Folin-Ciocalteu顯色劑與酚類化合物的反應必須在堿性條件下才可以顯色，顯色反應對Na2CO3用量有相當的依賴性。

2.1.5 Folin-Ciocalteu顯色劑用量 由圖5可知，當 Folin-Ciocalteu 試劑添加量在0.5～2.5 mL時，隨著顯色劑用量增加，吸光度逐漸增加至0.502，之后吸光度趨于穩定，因此確定Folin-Ciocalteu比色法顯色劑用量為2.5 mL。

2.2 標準曲線的繪制

以單寧酸為標準品制作標準曲線（圖6），回歸方程為y=0.081 4x+0.031 1，x表示單寧酸濃度（mg/L），y表示吸光度，相關系數r2為0.997 9，表明單寧酸質量濃度在2～20 mg/L 范圍內與其吸光度呈現良好的線性關系，符合朗伯比爾定律，該方程可用于多酚的定量測定。

2.3 Folin-Ciocalteu比色方法評價

2.3.1 穩定性試驗 對Folin-Ciocalteu法測定菜籽多酚進行穩定性試驗，顯色反應體系水浴50 min后，避光放置0、15、30、45、60、90、120 min，測定的吸光度分別為0.495、0.495、0493、0.493、0.492、0.492、0.489。研究發現，隨著時間延長，吸光度有下降趨勢，但幅度不大，其相對偏差（RSD）為0419%，表明120 min內溶液穩定性良好。

2.3.2 精密度試驗 從同一份菜籽提取液中取6份樣本進行Folin-Ciocalteu比色法檢測，計算各樣本中的多酚含量分別為22.78、23.56、22.99、22.76、23.2、23.0 mg/g，其相對偏差（RSD）為1.295%，表明該方法具有較高的精密度，能滿足樣菜籽多酚樣品分析的要求。

2.3.3 重現性試驗 從同一份菜籽原料中取5份樣品，分別提取其多酚，然后利用Folin-Ciocalteu比色法檢測各提取液的多酚含量，分別為23.20、23.56、22.78、23.31、22.45 mg/g，其相對偏差（RSD）為2.30%，表明該方法重現性較好。

2.3.4 加標回收試驗 由表1可知，6次加標回收試驗的最低回收率為97.7%，最高回收率為102.1%，平均回收率為99.55%，回收率相對標準偏差（RSD）為1.49%，表明本研究所建立的Folin-Ciocalteu檢測法準確可靠，完全可用于菜籽多酚含量的測定。

3 結論

本研究采用Folin- Ciocalteu比色法測菜籽多酚含量，以單寧酸為標準品，確定最佳的顯色條件為Folin- Ciocalteu顯色劑2.5 mL、飽和Na2CO3溶液4 mL、反應溫度40 ℃、反應時間50 min、比色測定波長757 nm。標準曲線的線性回歸方程為y=0.081 4x+0.031 1，相關系數r2為0.997 9，且單寧酸質量濃度在2～20 mg/L范圍內與其吸光度呈現良好的線性關系。該法的穩定性試驗、精密度試驗、重現性試驗、回收率試驗的相對標準偏差（RSD）分別為0.419%、1.295%、230%、1.49%，表明本研究建立起的Folin- Ciocalteu比色法能快速、準確地測定菜籽多酚含量。

參考文獻：

[1]張清安，范學輝. 多酚類物質抗氧化活性評價方法研究進展[J]. 食品與發酵工業，2011，37（11）：169-172.

[2]陳 萌，楊 湄，劉昌盛，等. 菜籽多酚的制備、檢測及其在加工過程中的變化研究進展[J]. 中國油料作物學報，2013，35（1）：102-103.

[3]王文杰. 高錳酸鉀滴定法測定茶多酚有關用劑的特性研究[J]. 福建茶葉，2002（1）：15-17.

[4]李春陽，許時嬰，王 璋. 低濃度香草醛-鹽酸法測定葡萄籽、梗中原花青素含量的研究[J]. 食品工業科技，2004（6）：128-130.

[5]肖 純，張凱農，陽長敏，等. 鐵氰化鉀分光光度法測定單寧的適用性[J]. 華北農學報，1996，11（2）：127-130.

[6]Singleton V L，Orthofer R，Lamuela-Raventos R M. Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent[J]. Methods in Enzymology，1999，299：152-178.

[7]鄭仕宏，張海德，何 雙，等. Folin-Ciocalteus法測定檳榔中多酚含量的研究[J]. 中南林業科技大學學報，2009，29（6）：165-169.

[8]何志勇，夏文水. Folin-Ciocalteu比色法測定橄欖中多酚含量的研究[J]. 林產化學與工業，2006，26（4）：15-18.

[9]劉麗香，Tanguy L，梁興飛，等. Folin-Ciocalteu比色法測定苦丁茶中多酚含量[J]. 茶葉科學，2008，28（2）：101-106.

[10]張曉麗，曾曉雄，李春陽. 菜籽多酚提取工藝的優化[J]. 食品與機械，2012，28（2）：142-146.endprint

1.2.6 標準曲線的繪制 精確吸取0、0.05、0.10、0.15、020、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mL單寧酸標準溶液，按照前期試驗確定的適宜條件進行顯色反應，檢測吸光度。以吸光度為縱坐標（y）、單寧酸濃度（mg/L）為橫坐標（x）繪制標準曲線。

1.2.7 Folin-Ciocalteu比色方法評價

1.2.7.1 穩定性試驗 取菜籽提取液進行顯色反應，反應完全（50 min）后在30 ℃下避光放置0、15、30、45、60、90、120 min 后測定吸光度，根據吸光度的變化評價該比色法在一段時間內的穩定性。

1.2.7.2 精密度試驗 從同一份菜籽提取液中取6份樣本進行Folin-Ciocalteu比色法檢測，計算各樣本中的多酚含量（mg/g），以分析結果的相對標準偏差評價該比色方法的精密度。

1.2.7.3 重現性試驗 從同一份菜籽原料中取5份樣品，分別進行多酚提取，然后利用Folin-Ciocalteu比色法檢測各提取液的多酚含量（mg/g），并計算結果的相對標準偏差，以評價該比色方法的重現性。

1.2.7.4 加標回收試驗 往菜籽提取液中加入不同量的單寧酸，分別測定其多酚含量，并計算其回收率和相對標準偏差，以評價該比色方法的準確度和可靠性。

2 結果與分析

2.1 Folin-Ciocalteu法檢測條件研究

2.1.1 比色波長和標準品 由圖1可知，沒食子酸、單寧酸和菜籽提取液與Folin-Ciocalteu試劑反應顯色后，均在 730～770 nm 范圍內有一明顯吸收峰。其中，沒食子酸在 736 nm 處吸收最強，單寧酸在762 nm處吸收最強，菜籽提取液在757 nm處吸收最強。因此本試驗以單寧酸為標準品，以 757 nm 為菜籽多酚比色測定的波長。

2.1.2 顯色時間 由圖2可知，10～40 min時，吸光度隨反應時間的延長而快速增加，50 min后顯色反應完全并趨于穩定，因此確定50 min為顯色反應時間。

2.1.3 反應溫度 由圖3可知，反應溫度在20～35 ℃時，吸光度快速增加，40 ℃時吸光度達到最高，為0.476，之后吸光度隨溫度升高而下降，因此確定顯色反應溫度為40 ℃。研究結果說明反應溫度能影響比色效果，溫度過低或過高均不利于多酚顯色。

2.1.4 飽和Na2CO3 溶液添加量 由圖4可知，飽和Na2CO3溶液添加量在1～4 mL時，隨著添加量增加，吸光度逐漸增加，4 mL時達到最大值，為0.496，之后吸光度隨Na2CO3溶液添加量的增加而降低，因此確定顯色反應體系中加入飽和Na2CO3溶液的體積為4 mL。研究結果說明Folin-Ciocalteu顯色劑與酚類化合物的反應必須在堿性條件下才可以顯色，顯色反應對Na2CO3用量有相當的依賴性。

2.1.5 Folin-Ciocalteu顯色劑用量 由圖5可知，當 Folin-Ciocalteu 試劑添加量在0.5～2.5 mL時，隨著顯色劑用量增加，吸光度逐漸增加至0.502，之后吸光度趨于穩定，因此確定Folin-Ciocalteu比色法顯色劑用量為2.5 mL。

2.2 標準曲線的繪制

以單寧酸為標準品制作標準曲線（圖6），回歸方程為y=0.081 4x+0.031 1，x表示單寧酸濃度（mg/L），y表示吸光度，相關系數r2為0.997 9，表明單寧酸質量濃度在2～20 mg/L 范圍內與其吸光度呈現良好的線性關系，符合朗伯比爾定律，該方程可用于多酚的定量測定。

2.3 Folin-Ciocalteu比色方法評價

2.3.1 穩定性試驗 對Folin-Ciocalteu法測定菜籽多酚進行穩定性試驗，顯色反應體系水浴50 min后，避光放置0、15、30、45、60、90、120 min，測定的吸光度分別為0.495、0.495、0493、0.493、0.492、0.492、0.489。研究發現，隨著時間延長，吸光度有下降趨勢，但幅度不大，其相對偏差（RSD）為0419%，表明120 min內溶液穩定性良好。

2.3.2 精密度試驗 從同一份菜籽提取液中取6份樣本進行Folin-Ciocalteu比色法檢測，計算各樣本中的多酚含量分別為22.78、23.56、22.99、22.76、23.2、23.0 mg/g，其相對偏差（RSD）為1.295%，表明該方法具有較高的精密度，能滿足樣菜籽多酚樣品分析的要求。

2.3.3 重現性試驗 從同一份菜籽原料中取5份樣品，分別提取其多酚，然后利用Folin-Ciocalteu比色法檢測各提取液的多酚含量，分別為23.20、23.56、22.78、23.31、22.45 mg/g，其相對偏差（RSD）為2.30%，表明該方法重現性較好。

2.3.4 加標回收試驗 由表1可知，6次加標回收試驗的最低回收率為97.7%，最高回收率為102.1%，平均回收率為99.55%，回收率相對標準偏差（RSD）為1.49%，表明本研究所建立的Folin-Ciocalteu檢測法準確可靠，完全可用于菜籽多酚含量的測定。

3 結論

本研究采用Folin- Ciocalteu比色法測菜籽多酚含量，以單寧酸為標準品，確定最佳的顯色條件為Folin- Ciocalteu顯色劑2.5 mL、飽和Na2CO3溶液4 mL、反應溫度40 ℃、反應時間50 min、比色測定波長757 nm。標準曲線的線性回歸方程為y=0.081 4x+0.031 1，相關系數r2為0.997 9，且單寧酸質量濃度在2～20 mg/L范圍內與其吸光度呈現良好的線性關系。該法的穩定性試驗、精密度試驗、重現性試驗、回收率試驗的相對標準偏差（RSD）分別為0.419%、1.295%、230%、1.49%，表明本研究建立起的Folin- Ciocalteu比色法能快速、準確地測定菜籽多酚含量。

參考文獻：

[1]張清安，范學輝. 多酚類物質抗氧化活性評價方法研究進展[J]. 食品與發酵工業，2011，37（11）：169-172.

[2]陳 萌，楊 湄，劉昌盛，等. 菜籽多酚的制備、檢測及其在加工過程中的變化研究進展[J]. 中國油料作物學報，2013，35（1）：102-103.

[3]王文杰. 高錳酸鉀滴定法測定茶多酚有關用劑的特性研究[J]. 福建茶葉，2002（1）：15-17.

[4]李春陽，許時嬰，王 璋. 低濃度香草醛-鹽酸法測定葡萄籽、梗中原花青素含量的研究[J]. 食品工業科技，2004（6）：128-130.

[5]肖 純，張凱農，陽長敏，等. 鐵氰化鉀分光光度法測定單寧的適用性[J]. 華北農學報，1996，11（2）：127-130.

[6]Singleton V L，Orthofer R，Lamuela-Raventos R M. Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent[J]. Methods in Enzymology，1999，299：152-178.

[7]鄭仕宏，張海德，何 雙，等. Folin-Ciocalteus法測定檳榔中多酚含量的研究[J]. 中南林業科技大學學報，2009，29（6）：165-169.

[8]何志勇，夏文水. Folin-Ciocalteu比色法測定橄欖中多酚含量的研究[J]. 林產化學與工業，2006，26（4）：15-18.

[9]劉麗香，Tanguy L，梁興飛，等. Folin-Ciocalteu比色法測定苦丁茶中多酚含量[J]. 茶葉科學，2008，28（2）：101-106.

[10]張曉麗，曾曉雄，李春陽. 菜籽多酚提取工藝的優化[J]. 食品與機械，2012，28（2）：142-146.endprint

1.2.6 標準曲線的繪制 精確吸取0、0.05、0.10、0.15、020、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mL單寧酸標準溶液，按照前期試驗確定的適宜條件進行顯色反應，檢測吸光度。以吸光度為縱坐標（y）、單寧酸濃度（mg/L）為橫坐標（x）繪制標準曲線。

1.2.7 Folin-Ciocalteu比色方法評價

1.2.7.1 穩定性試驗 取菜籽提取液進行顯色反應，反應完全（50 min）后在30 ℃下避光放置0、15、30、45、60、90、120 min 后測定吸光度，根據吸光度的變化評價該比色法在一段時間內的穩定性。

1.2.7.2 精密度試驗 從同一份菜籽提取液中取6份樣本進行Folin-Ciocalteu比色法檢測，計算各樣本中的多酚含量（mg/g），以分析結果的相對標準偏差評價該比色方法的精密度。

1.2.7.3 重現性試驗 從同一份菜籽原料中取5份樣品，分別進行多酚提取，然后利用Folin-Ciocalteu比色法檢測各提取液的多酚含量（mg/g），并計算結果的相對標準偏差，以評價該比色方法的重現性。

1.2.7.4 加標回收試驗 往菜籽提取液中加入不同量的單寧酸，分別測定其多酚含量，并計算其回收率和相對標準偏差，以評價該比色方法的準確度和可靠性。

2 結果與分析

2.1 Folin-Ciocalteu法檢測條件研究

2.1.1 比色波長和標準品 由圖1可知，沒食子酸、單寧酸和菜籽提取液與Folin-Ciocalteu試劑反應顯色后，均在 730～770 nm 范圍內有一明顯吸收峰。其中，沒食子酸在 736 nm 處吸收最強，單寧酸在762 nm處吸收最強，菜籽提取液在757 nm處吸收最強。因此本試驗以單寧酸為標準品，以 757 nm 為菜籽多酚比色測定的波長。

2.1.2 顯色時間 由圖2可知，10～40 min時，吸光度隨反應時間的延長而快速增加，50 min后顯色反應完全并趨于穩定，因此確定50 min為顯色反應時間。

2.1.3 反應溫度 由圖3可知，反應溫度在20～35 ℃時，吸光度快速增加，40 ℃時吸光度達到最高，為0.476，之后吸光度隨溫度升高而下降，因此確定顯色反應溫度為40 ℃。研究結果說明反應溫度能影響比色效果，溫度過低或過高均不利于多酚顯色。

2.1.4 飽和Na2CO3 溶液添加量 由圖4可知，飽和Na2CO3溶液添加量在1～4 mL時，隨著添加量增加，吸光度逐漸增加，4 mL時達到最大值，為0.496，之后吸光度隨Na2CO3溶液添加量的增加而降低，因此確定顯色反應體系中加入飽和Na2CO3溶液的體積為4 mL。研究結果說明Folin-Ciocalteu顯色劑與酚類化合物的反應必須在堿性條件下才可以顯色，顯色反應對Na2CO3用量有相當的依賴性。

2.1.5 Folin-Ciocalteu顯色劑用量 由圖5可知，當 Folin-Ciocalteu 試劑添加量在0.5～2.5 mL時，隨著顯色劑用量增加，吸光度逐漸增加至0.502，之后吸光度趨于穩定，因此確定Folin-Ciocalteu比色法顯色劑用量為2.5 mL。

2.2 標準曲線的繪制

以單寧酸為標準品制作標準曲線（圖6），回歸方程為y=0.081 4x+0.031 1，x表示單寧酸濃度（mg/L），y表示吸光度，相關系數r2為0.997 9，表明單寧酸質量濃度在2～20 mg/L 范圍內與其吸光度呈現良好的線性關系，符合朗伯比爾定律，該方程可用于多酚的定量測定。

2.3 Folin-Ciocalteu比色方法評價

2.3.1 穩定性試驗 對Folin-Ciocalteu法測定菜籽多酚進行穩定性試驗，顯色反應體系水浴50 min后，避光放置0、15、30、45、60、90、120 min，測定的吸光度分別為0.495、0.495、0493、0.493、0.492、0.492、0.489。研究發現，隨著時間延長，吸光度有下降趨勢，但幅度不大，其相對偏差（RSD）為0419%，表明120 min內溶液穩定性良好。

2.3.2 精密度試驗 從同一份菜籽提取液中取6份樣本進行Folin-Ciocalteu比色法檢測，計算各樣本中的多酚含量分別為22.78、23.56、22.99、22.76、23.2、23.0 mg/g，其相對偏差（RSD）為1.295%，表明該方法具有較高的精密度，能滿足樣菜籽多酚樣品分析的要求。

2.3.3 重現性試驗 從同一份菜籽原料中取5份樣品，分別提取其多酚，然后利用Folin-Ciocalteu比色法檢測各提取液的多酚含量，分別為23.20、23.56、22.78、23.31、22.45 mg/g，其相對偏差（RSD）為2.30%，表明該方法重現性較好。

2.3.4 加標回收試驗 由表1可知，6次加標回收試驗的最低回收率為97.7%，最高回收率為102.1%，平均回收率為99.55%，回收率相對標準偏差（RSD）為1.49%，表明本研究所建立的Folin-Ciocalteu檢測法準確可靠，完全可用于菜籽多酚含量的測定。

3 結論

本研究采用Folin- Ciocalteu比色法測菜籽多酚含量，以單寧酸為標準品，確定最佳的顯色條件為Folin- Ciocalteu顯色劑2.5 mL、飽和Na2CO3溶液4 mL、反應溫度40 ℃、反應時間50 min、比色測定波長757 nm。標準曲線的線性回歸方程為y=0.081 4x+0.031 1，相關系數r2為0.997 9，且單寧酸質量濃度在2～20 mg/L范圍內與其吸光度呈現良好的線性關系。該法的穩定性試驗、精密度試驗、重現性試驗、回收率試驗的相對標準偏差（RSD）分別為0.419%、1.295%、230%、1.49%，表明本研究建立起的Folin- Ciocalteu比色法能快速、準確地測定菜籽多酚含量。

參考文獻：

[1]張清安，范學輝. 多酚類物質抗氧化活性評價方法研究進展[J]. 食品與發酵工業，2011，37（11）：169-172.

[2]陳 萌，楊 湄，劉昌盛，等. 菜籽多酚的制備、檢測及其在加工過程中的變化研究進展[J]. 中國油料作物學報，2013，35（1）：102-103.

[3]王文杰. 高錳酸鉀滴定法測定茶多酚有關用劑的特性研究[J]. 福建茶葉，2002（1）：15-17.

[4]李春陽，許時嬰，王 璋. 低濃度香草醛-鹽酸法測定葡萄籽、梗中原花青素含量的研究[J]. 食品工業科技，2004（6）：128-130.

[5]肖 純，張凱農，陽長敏，等. 鐵氰化鉀分光光度法測定單寧的適用性[J]. 華北農學報，1996，11（2）：127-130.

[6]Singleton V L，Orthofer R，Lamuela-Raventos R M. Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent[J]. Methods in Enzymology，1999，299：152-178.

[7]鄭仕宏，張海德，何 雙，等. Folin-Ciocalteus法測定檳榔中多酚含量的研究[J]. 中南林業科技大學學報，2009，29（6）：165-169.

[8]何志勇，夏文水. Folin-Ciocalteu比色法測定橄欖中多酚含量的研究[J]. 林產化學與工業，2006，26（4）：15-18.

[9]劉麗香，Tanguy L，梁興飛，等. Folin-Ciocalteu比色法測定苦丁茶中多酚含量[J]. 茶葉科學，2008，28（2）：101-106.

[10]張曉麗，曾曉雄，李春陽. 菜籽多酚提取工藝的優化[J]. 食品與機械，2012，28（2）：142-146.endprint