高效鎘吸附菌株的篩選及生物學特性

劉標等

摘要：為了獲得高效鎘吸附微生物，從重金屬污染土壤中分離篩選到4株耐鎘能力較強的細菌菌株2-1、2-2、4-1、7-1，并對這4株菌株的鎘吸附能力進行研究。結果表明，菌株4-1的吸附效果最好，達到90.0%，根據形態學觀察、生理生化特征鑒定及16S rDNA序列分析結果，將其鑒定為金黃桿菌。同時，本研究還分析了通氣量及其他常見重金屬離子對菌株4-1生長的影響，結果顯示，500 mL錐形瓶中裝液量為100～150 mL時，有利于菌株的生長，培養液中加入Zn2+、Cu2+對菌株生長無明顯影響，但加入100 mg/L Pb2+會抑制其生長。

關鍵詞：鎘；吸附能力；通氣量；金黃桿菌

中圖分類號： X172 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）03-0316-03

湖南省株洲市清水塘工業區是全國主要的重化工基地之一，自20世紀50年代以來，工業區的工業企業大多超標排放“三廢”（廢水、廢氣、廢渣），“三廢”中的重金屬對周圍土壤、地表水和地下水等環境造成了嚴重污染。2006年1月6日湘江鎘污染，造成湖南株洲、湘潭和長沙段湘江水質鎘超標，嚴重威脅人們的身體健康[1]。鎘是一種毒性很強的重金屬元素，鎘離子對生態環境和人類的毒害引起了世界各國的高度重視，1974年聯合國環境規劃署和國際勞動衛生重金屬委員會就將其定為重點污染物，美國毒物管理委員會（ATSDR）也將其列為第6位危及人類健康的毒害物質[2]，被國際癌癥研究機構確定為人類和試驗動物的肺癌和前列腺癌的確認致癌物[3]。隨著重金屬污染日趨嚴重，污染治理已成為備受關注的焦點。傳統重金屬污染土壤的治理方法主要是物理和化學法，如工程修復法（換土法）、活性炭吸附法、離子交換法、化學沉淀法、氧化還原法等。這些方法雖各有特點，但也有一定的局限性，或是不同程度地存在成本高、選擇性低、能耗高，并可能產生二次污染等問題[4-5]，現正逐漸被生物吸附法所代替。微生物特別是細菌數量多、比表面積大、代謝活性旺盛，可通過多種方式對重金屬進行生物吸附[6-8]。生物修復是頗具潛力的治理方法，從污染土壤中分離篩選的本土微生物能有效提高生物修復效率。因此，研究本土抗重金屬微生物對修復重金屬污染具有重要意義。本試驗從株洲市清水塘工業污染區采集土壤樣品，并從中篩選到1株鎘吸附能力強的細菌，對其進行了種屬鑒定，以期獲得修復重金屬鎘污染的高效菌株，為工業化生產應用提供重要的菌種。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 從株洲清水塘工業區采集土壤樣品。

1.1.2 培養基 牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 值7.0～7.2，121 ℃高溫滅菌20 min。

PDA培養基：20%馬鈴薯煮汁100 mL，葡萄糖2 g，瓊脂1.5～2.0 g，pH值自然，121 ℃高溫滅菌20 min。

1. 2 試驗方法

1.2.1 耐鎘微生物的分離及純化 取10 g采集的土樣加入到盛有90 mL無菌水的三角瓶中，振蕩混勻10 min，采用10倍系列梯度稀釋法進行稀釋，然后取0.1 mL 10-6 稀釋液加入到含100、200、400、600、800 mg/L鎘的牛肉膏蛋白胨平板（或PDA平板）中，涂布均勻，倒置于30 ℃培養箱中。以不加鎘的培養基為對照，將各培養基上獲得的單菌落利用平板劃線法獲得純培養。

1.2.2 耐鎘微生物對鎘的吸附能力 將所獲得的4株耐鎘菌株菌懸液1 mL（濃度約為1億CFU/mL）分別培養于含鎘[CdCl2·2.5H2O]濃度為100 mg/L的牛肉膏蛋白胨液體培養基中，30 ℃下振蕩培養72 h，設3個重復，以接種等量無菌水的處理為對照。培養后，各菌株菌懸液5 000 r/min離心 15 min，取上清液備用，對照采用同樣方法進行處理。利用電感耦合等離子體發射光譜法測定各處理上清液中鎘的濃度。各菌株對培養液中鎘的吸附率=（C0-Ct）/C0×100%。其中，C0為對照上清液中鎘的濃度（mg/L）；Ct為吸附后的上清液中鎘的濃度（mg/L）。

1.2.3 高效鎘吸附菌株4-1的菌種鑒定

1.2.3.1 菌株4-1的形態特征和生理生化試驗 觀察菌株4-1的菌落形態特征，并取對數生長期的細菌進行簡單染色、革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察細菌的形態特征。參照文獻[9]，對菌株進行生理生化試驗。

1.2.3.2 細菌16S rDNA序列鑒定 將細菌培養至對數期，用DNA提取試劑盒提取細菌的基因組DNA，PCR擴增采用16S rDNA通用引物：27F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R，5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應條件：95 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個循環；72 ℃ 10 min，4 ℃終止。將PCR產物利用回收試劑盒純化后交由上海生物工程有限公司測序。測得的序列通過美國國立生物技術信息中心（NCBI）比對分析，利用Clustal X 和Phylip軟件構建16S rDNA系統發育樹。

1.2.4 通氣量對菌株4-1生長的影響 在500 mL的搖瓶中分別裝入50、100、150、200、250 mL的牛肉膏蛋白胨培養基，按體積比為1%的接種量接入對數生長期的4-1菌液。30 ℃恒溫振蕩培養24 h后，測定菌液在600 nm處的吸光度。

1.2.5 其他重金屬離子對菌株4-1生長的影響 在牛肉膏蛋白胨培養基中分別加入Cu2+、Zn2+、Pb2+，使這些離子的終濃度為100 mg/L，按體積比為1%的接種量接入對數生長期的4-1菌液。于30 ℃下恒溫振蕩培養24 h，再測定菌液在 600 nm 處的吸光度。endprint

2 結果與分析

2.1 耐鎘微生物的分離純化

在30 ℃恒溫條件下培養2、7 d，在不含鎘的平板上共分離純化得到22株優勢菌株，其中細菌菌株21株，霉菌菌株1株。在含鎘濃度為100 mg/L的平板上有14株菌株生長較好；當鎘濃度提高到800 mg/L時，仍有4株菌株可以生長，結果如表1所示。

2.5 重金屬離子對菌株 4-1 生長的影響

在重金屬污染環境中，往往含有其他的重金屬離子，了解其他重金屬離子對菌株 4-1的影響，有助于掌握菌株的生物特性。從圖5可知，在培養液中加入100 mg/L Zn2+、Cu2+對菌株生長沒有明顯影響，但加入100 mg/L Pb2+，菌液的吸光度明顯下降，說明Pb2+能抑制菌株的生長。

3 結論與討論

本研究從重金屬污染環境中分離篩選到4株耐鎘微生物，鎘吸附試驗結果表明，菌株4-1對鎘吸附能力最強，吸附率達到90.0%。經過形態學、生理生化及16S rDNA序列分析，將菌株4-1鑒定為金黃桿菌。微生物在生長過程中受多種環境因素如溫度、pH值、溶氧量、營養物質等的影響。本試驗研究了通氣量及金屬離子對菌株4-1生長的影響，結果表明菌株4-1的生長受培養液中溶氧量的影響，且培養液中加入一定量的Pb2+后會明顯抑制菌株4-1的生長。

4株耐鎘微生物的鎘吸附試驗結果表明，耐鎘性較強的菌株2-1、2-2對鎘的吸附能力一般，而相對耐鎘能力弱的菌株4-1卻表現出較強的鎘吸附能力，造成這種現象可能與吸附試驗中培養液的pH值[8，10]、有效鎘濃度[8]、溶質類型[11]等因素有關。

利用吸附能力強的微生物修復重金屬污染的土壤，可以克服物理化學方法易造成二次污染的缺點，具有良好的應用前景。但在實際應用中，獲得的微生物要達到最大程度的生物修復作用，還必須考慮其他因素，如作物類型、土壤理化性質（有機質含量、堿解氮含量、速效氮含量、速效鉀含量、pH值）等。因此，菌株4-1對鎘的吸附機理及其影響因素等仍需進一步研究。

參考文獻：

[1]洪克非. 湘江鎘污染事件內幕追蹤[J]. 湖南安全與防災，2006，9（2）：18-21.

[2]葉寒青，楊祥良，周井炎，等. 環境污染物鎘毒性作用機理研究進展[J]. 廣東微量元素科學，2001，8（3）：9-12.

[3]裴秀叢，徐兆發. 鎘的慢性毒作用及其遠期效應[J]. 環境與職業醫學，2003，20（1）：58-59，61.

[4]陳 紅，葉兆杰，方 士，等. 不同狀態下MnO2對廢水中As（Ⅲ） 的吸附研究[J]. 中國環境科學，1998，18（2）：126-130.

[5]蘇海佳，賀小進，譚天偉.球形殼聚糖樹脂對含重金屬離子廢水的吸附性能研究[J]. 北京化工大學學報：自然科學版，2003，30（2）：19-22.

[6]周志峰，張進忠，魏世強，等. 1株芽孢桿菌吸附鎘和銅的研究[J]. 西南農業大學學報：自然科學版，2006，28（3）：396-401.

[7]Hassan S A，Kim S J，Jung A Y，et al. Biosorptive capacity of Cd（Ⅱ） and Cu（Ⅱ） by lyophilized cells of Pseudomonas stutzeri[J]. J Gen Appl Microbiol，2009，55（1）：27-34.

[8]劉愛民，黃為一. 抗Cd細菌J5的篩選和抗Cd2+特性[J]. 農業環境科學學報，2005，24（增刊）：223-227.

[9]東秀珠，蔡妙英. 常見細菌系統鑒定手冊[M]. 北京：科學出版社，2001：25-105.

[10]López A，Lázaro N，Priego J M，et al. Effect of pH on the biosorption of nickel and other heavy metals by Pseudomonas fluorescens 4F39[J]. J Ind Microbiol and Biotechonl，2000，24（2）：146-151.

[11]El-Helow E R，Sabry S A，Amer R M. cadmium biosorption by a cadmium resistant strain of Bacillus thuringiensis：regulation and optimization of cell surface affinity for metal cations[J]. Biometals，2000，13（4）：273-280.endprint

2 結果與分析

2.1 耐鎘微生物的分離純化

在30 ℃恒溫條件下培養2、7 d，在不含鎘的平板上共分離純化得到22株優勢菌株，其中細菌菌株21株，霉菌菌株1株。在含鎘濃度為100 mg/L的平板上有14株菌株生長較好；當鎘濃度提高到800 mg/L時，仍有4株菌株可以生長，結果如表1所示。

2.5 重金屬離子對菌株 4-1 生長的影響

在重金屬污染環境中，往往含有其他的重金屬離子，了解其他重金屬離子對菌株 4-1的影響，有助于掌握菌株的生物特性。從圖5可知，在培養液中加入100 mg/L Zn2+、Cu2+對菌株生長沒有明顯影響，但加入100 mg/L Pb2+，菌液的吸光度明顯下降，說明Pb2+能抑制菌株的生長。

3 結論與討論

本研究從重金屬污染環境中分離篩選到4株耐鎘微生物，鎘吸附試驗結果表明，菌株4-1對鎘吸附能力最強，吸附率達到90.0%。經過形態學、生理生化及16S rDNA序列分析，將菌株4-1鑒定為金黃桿菌。微生物在生長過程中受多種環境因素如溫度、pH值、溶氧量、營養物質等的影響。本試驗研究了通氣量及金屬離子對菌株4-1生長的影響，結果表明菌株4-1的生長受培養液中溶氧量的影響，且培養液中加入一定量的Pb2+后會明顯抑制菌株4-1的生長。

4株耐鎘微生物的鎘吸附試驗結果表明，耐鎘性較強的菌株2-1、2-2對鎘的吸附能力一般，而相對耐鎘能力弱的菌株4-1卻表現出較強的鎘吸附能力，造成這種現象可能與吸附試驗中培養液的pH值[8，10]、有效鎘濃度[8]、溶質類型[11]等因素有關。

利用吸附能力強的微生物修復重金屬污染的土壤，可以克服物理化學方法易造成二次污染的缺點，具有良好的應用前景。但在實際應用中，獲得的微生物要達到最大程度的生物修復作用，還必須考慮其他因素，如作物類型、土壤理化性質（有機質含量、堿解氮含量、速效氮含量、速效鉀含量、pH值）等。因此，菌株4-1對鎘的吸附機理及其影響因素等仍需進一步研究。

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[11]El-Helow E R，Sabry S A，Amer R M. cadmium biosorption by a cadmium resistant strain of Bacillus thuringiensis：regulation and optimization of cell surface affinity for metal cations[J]. Biometals，2000，13（4）：273-280.endprint

2 結果與分析

2.1 耐鎘微生物的分離純化

在30 ℃恒溫條件下培養2、7 d，在不含鎘的平板上共分離純化得到22株優勢菌株，其中細菌菌株21株，霉菌菌株1株。在含鎘濃度為100 mg/L的平板上有14株菌株生長較好；當鎘濃度提高到800 mg/L時，仍有4株菌株可以生長，結果如表1所示。

2.5 重金屬離子對菌株 4-1 生長的影響

在重金屬污染環境中，往往含有其他的重金屬離子，了解其他重金屬離子對菌株 4-1的影響，有助于掌握菌株的生物特性。從圖5可知，在培養液中加入100 mg/L Zn2+、Cu2+對菌株生長沒有明顯影響，但加入100 mg/L Pb2+，菌液的吸光度明顯下降，說明Pb2+能抑制菌株的生長。

3 結論與討論

本研究從重金屬污染環境中分離篩選到4株耐鎘微生物，鎘吸附試驗結果表明，菌株4-1對鎘吸附能力最強，吸附率達到90.0%。經過形態學、生理生化及16S rDNA序列分析，將菌株4-1鑒定為金黃桿菌。微生物在生長過程中受多種環境因素如溫度、pH值、溶氧量、營養物質等的影響。本試驗研究了通氣量及金屬離子對菌株4-1生長的影響，結果表明菌株4-1的生長受培養液中溶氧量的影響，且培養液中加入一定量的Pb2+后會明顯抑制菌株4-1的生長。

4株耐鎘微生物的鎘吸附試驗結果表明，耐鎘性較強的菌株2-1、2-2對鎘的吸附能力一般，而相對耐鎘能力弱的菌株4-1卻表現出較強的鎘吸附能力，造成這種現象可能與吸附試驗中培養液的pH值[8，10]、有效鎘濃度[8]、溶質類型[11]等因素有關。

利用吸附能力強的微生物修復重金屬污染的土壤，可以克服物理化學方法易造成二次污染的缺點，具有良好的應用前景。但在實際應用中，獲得的微生物要達到最大程度的生物修復作用，還必須考慮其他因素，如作物類型、土壤理化性質（有機質含量、堿解氮含量、速效氮含量、速效鉀含量、pH值）等。因此，菌株4-1對鎘的吸附機理及其影響因素等仍需進一步研究。

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[6]周志峰，張進忠，魏世強，等. 1株芽孢桿菌吸附鎘和銅的研究[J]. 西南農業大學學報：自然科學版，2006，28（3）：396-401.

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[8]劉愛民，黃為一. 抗Cd細菌J5的篩選和抗Cd2+特性[J]. 農業環境科學學報，2005，24（增刊）：223-227.

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[10]López A，Lázaro N，Priego J M，et al. Effect of pH on the biosorption of nickel and other heavy metals by Pseudomonas fluorescens 4F39[J]. J Ind Microbiol and Biotechonl，2000，24（2）：146-151.

[11]El-Helow E R，Sabry S A，Amer R M. cadmium biosorption by a cadmium resistant strain of Bacillus thuringiensis：regulation and optimization of cell surface affinity for metal cations[J]. Biometals，2000，13（4）：273-280.endprint