猴免疫缺陷病毒(SIVmac239)多次直腸暴露對機體細胞免疫的影響

王 衛，劉克劍，吳芳新，叢 喆，陳 霆，魏 強

(北京協和醫學院比較醫學中心，中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021)

研究報告

猴免疫缺陷病毒(SIVmac239)多次直腸暴露對機體細胞免疫的影響

王 衛，劉克劍，吳芳新，叢 喆，陳 霆，魏 強

(北京協和醫學院比較醫學中心，中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021)

目的 研究猴免疫缺陷病毒(SIVmac239)多次直腸粘膜暴露對機體細胞免疫的影響。方法 建立小劑量多次直腸粘膜暴露模型，測定實驗猴的血漿病毒載量了解病毒復制水平，測定外周CD4+T細胞絕對數了解疾病進展情況，測定T細胞亞群和外周單個核細胞IFN-γ分泌情況了解機體細胞免疫狀況。結果 小劑量SIVmac239病毒多次暴露能導致病毒通過直腸粘膜進入動物體內，誘導機體免疫系統出現變化，但未見SIVmac239典型感染。病毒多次直腸暴露誘導出特異性細胞免疫，但與普通病毒感染相比，水平較低。結論 本研究明確了猴免疫缺陷病毒小劑量暴露對機體細胞免疫的作用，為HIV疫苗研究提供了基礎信息。

SIVmac239；直腸；粘膜；暴露；細胞免疫

病毒具有致病性和免疫原性兩面性，致病性指病毒具有的破壞寄主并誘發病害的特性，這是人們研發病毒疫苗的主要原因。而免疫原性是指病毒能夠刺激宿主機體形成特異抗體或致敏淋巴細胞的能力，這也是病毒疫苗研發成功的理論基礎。前期研究表明，HIV病毒感染可產生抗HIV免疫應答，但卻不能預防重復感染，說明HIV的免疫原性較弱[1, 2]。多次HIV-1病毒的暴露將刺激機體免疫反應，使其達到較高的免疫水平，但具體能達到多高的水平尚未明確。由于HIV-1病毒主要通過性接觸傳播，而且粘膜損傷和粘膜免疫在艾滋病的疾病進程發揮重要作用，因此，了解HIV-1病毒多次粘膜暴露對機體免疫反應就顯得尤為重要。本研究使用SIVmac239感染恒河猴模型，研究艾滋病毒小劑量多次直腸粘膜暴露對機體的刺激作用，明確艾滋病毒暴露誘發細胞免疫情況，為HIV-1疫苗研究提供基礎信息。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

注：病毒攻擊，血樣采集。圖1 小劑量多次組恒河猴直腸粘膜多次病毒暴露示意圖Note.Virus inoculation；blood sample collection.Fig.1 The schematic diagram of multiple exposure with SIVmac239 to the Chinese rhesus by rectal inoculation

中國恒河猴8只，3～4歲，3～5 kg，雌雄各半，購自北京協爾鑫生物資源研究所(合格證編號：SCXK(京)2010-0007)。實驗前，經血清學間接免疫熒光抗體檢查法(IFA)檢查排除猴B病毒(BV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆轉錄D型病毒(SRV-1)和猴T淋巴細胞性I型病毒(STLV-1)等相關病原體的感染。本實驗經過本單位實驗動物管理和使用委員會(IACUC)的動物倫理審查，批準號為IACUC-MC-12-6005。恒河猴隨機分成兩組，分別為小劑量多次組和大劑量一次組，每組4只動物。

1.2 毒株及動物接種

SIVmac239病毒由美國Aaron Diamond艾滋病研究中心Marx博士惠贈，由本實驗室擴增和保存[3, 4]。具體的動物接種計劃：小劑量多次組四只動物通過直腸途徑接種1 mL含10 TCID50SIVmac239的病毒液，每周兩次，共接種12次(6周)，實驗前及每次病毒接種前采集動物靜脈血，見圖1。大劑量一次組四只動物使用5×104TCID50SIVmac239直腸接種，后按時采集動物靜脈血進行檢測。病毒具體接種方法為：動物保持俯臥位，緩慢將病毒液注入肛竇處，保持俯臥位半小時。

1.3 臨床觀察及樣品采集

每天觀察實驗動物臨床癥狀，包括精神狀態、活動情況、攝食量、皮毛以及糞便形態等。每3～4 d采集恒河猴外周血，監測其血漿病毒載量、CD4+T細胞數、T淋巴細胞亞群以及外周單個核細胞(PBMC)IFN-γ的分泌情況變化等。

1.4 血漿病毒載量測定

TRIzol法提取血漿中病毒RNA，使用ABI 7500實時定量PCR儀和TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit (ABI, Cat No. 4392938) 測定血漿病毒RNA載量。總反應體系為20 μL，靈敏度為102copies/mL。其中上游引物為gag91F(5′-GCA GAG GAG GAA ATT ACC CAG TAC-3′)，下游引物為gag91R(5′-CAA TTT TAC CCA GGC ATT TAA TGT T-3′)，探針為pSHIVgag91-1(5′-FAM ACC TGC CAT TAA GCC CGA-MGB-3′)[5, 6]。反應體系內含: TaqMan RT-PCR Mix (2×) 10 μL; TaqMan RT Enzyme Mix (40×) 0.3 μL; 引物gag91F和gag91R (10 μmol/L)各0.5 μL; 探針pSHIVgag91-1 (1 μmol/L) 0.3 μL; DEPC H2O 3.4 μL; 模板5 μL。反應條件為: 48℃ 30 min (× 1)，95℃10 min (×1)，94℃ 15 s (×40)，60℃ 60 s (×40)。

1.5 流式細胞術

取50 μL的EDTA抗凝血，依次加入待標記抗體PE-CY7-CD3、PERCP-CY5.5-CD4、APC-CY7-CD8、PE-CD28、APC-CD95，室溫避光作用15 min，全血檢測管加入終濃度10%的紅細胞裂解液，4℃作用10 min。洗滌2次，細胞重懸于500 μL的pH 7.2 PBS中，BD FACS-Canto儀上分類計數[6]。

PS: 陰影部分為病毒接種期圖2 血漿病毒載量結果 PS: Shadow area indicates viral inoculation period.Fig.2 The plasma viral load measurements

1.6 IFN-γ ELISPOT

IFN-γ ELISPOT方法使用的是商品化的試劑盒(U-Cytech Biosciences, CT1262T20, Monkey ELISPOT kit, Lot # 65220245)。預先用抗猴IFN-γ抗體包被96孔平板，4℃過夜，后用含0.05%吐溫20的PBS (PBST) 洗板。加入含1% BSA的PBS 200 μL 37℃封閉1 h。用Ficoll密度梯度離心法分離猴PBMCs，計數并用無血清培養液調整細胞濃度為3×106/mL，將PBMC加入封閉好的96孔板孔中，每孔加入細胞液100 μL，并加入5 ng/well 濃度的多肽刺激，37℃ 5 % CO2培養箱孵育24 h時。孵育結束后，把細胞液倒出，用200 μL的冰冷的去離子水處理，后用PBST洗板10次，之后，先后加入生物素化的檢測抗體和GABA結合的抗生物素抗體孵育37℃1 h。孵育結束后，用PBST洗板5次。后加入底物室溫顯色15～20 min，顯色完畢，用蒸餾水洗板兩次，干燥，避光保存。陰性對照孔有PBMCs不加入多肽，陽性對照孔用50 ng/mL PMA + 1 μg/mL ionomycin刺激。做好的ELISPOT板通過倒置顯微鏡和ELISPOT讀板儀讀板計數。最后，計算所做復孔的平均值[7]。

1.7 數據分析

流式數據使用Flowjo version 7.2進行分析，作圖及統計分析由Graphpad Prism 5.0完成。

2 結果

2.1 血漿病毒載量結果

8只動物分為小劑量多次組和大劑量單次組，分別接種SIVmac239病毒。實驗猴在接受病毒接種的同時，使用real-time RT-PCR方法檢測實驗動物外周血病毒載量，結果顯示：小劑量多次組動物在病毒接種期間出現血漿病毒載量，部分時間點出現病毒載量陽性，但多為一過性病毒血癥，而且病毒復制水平有限，最高接近106copies/mL，在病毒接種期后兩個月的觀察期內未檢測出病毒載量陽性，見圖2A；而大劑量單次組動物出現典型的SIVmac239病毒感染情況，病毒載量上升迅速到106copies/mL以上，而且維持較高的平臺載量(104～105copies/mL)，見圖2B。前病毒DNA檢測也驗證了病毒載量結果(數據未顯示)。

2.2 外周CD4+T細胞數

為了解小劑量病毒多次暴露對動物外周CD4+T細胞的影響，使用流式細胞術檢測動物外周血CD4+T細胞情況。結果顯示，在病毒刺激粘膜的同時，小劑量多次組動物外周CD4+T細胞數出現較為劇烈的變化，但未出現明顯下降，甚至部分動物出現上升情況；在病毒接種期后兩個月的觀察期內，外周CD4+T細胞數出現緩慢下降趨勢，見圖3A。而大量劑量一次組動物在病毒接種后迅速下降，并維持于較低水平(500～1 000個/μL)，見圖3B。說明，病毒小劑量刺激粘膜能進入動物體內，誘導CD4+T細胞的損耗，但可能由于免疫反應的存在，CD4+T細胞損耗的速度較慢。

2.3 記憶T細胞亞群動態分析

2.4 PBMC IFN-γ分泌情況

為了解病毒暴露對機體的影響，本研究使用IFN-γ ELISPOT方法檢測動物細胞免疫水平，總體來看動物細胞免疫都出現兩次峰值，小劑量多次組峰出現在28 dpi和56 dpi，而大劑量一次組出現在30 dpi和126 dpi，可見細胞免疫的開始誘導時間較為接近，但免疫成熟時間差異較大。此外，從免疫強度來看，每只動物均檢測出特異的細胞免疫反應，但每組動物的結果都顯示很大差異，小劑量多次組動物明顯小于大劑量一次組動物，包括初次誘導和成熟階段。說明，小劑量病毒粘膜暴露能刺激機體的細胞免疫反應，但強度較小(圖5)。

PS: 陰影部分為病毒接種期圖3 外周CD4+ T細胞計數結果 PS: Shadow area indicates viral inoculation period.Fig.3 The results of peripheral CD4+ T cell count

圖4 實驗猴記憶T細胞動態分析Fig.4 Dynamic analysis of the monkey memory T cells

圖5 實驗猴PBMC IFN-γ分泌情況Fig.5 Dynamic analysis of the IFN-γ secretion of PBMCs

圖6 IFN-γ ELISPOT實驗結果Fig.6 Results of the IFN-γ ELISPOT assay

在此基礎上，本研究還對誘發小劑量多次組動物細胞免疫的多肽片段進行了分析。結果顯示，感染之初大部分時間點以針對Env的細胞免疫最強，這與Env位于病毒表面有關，但到后期針對Env的細胞免疫開始下降，可能與病毒包膜的高變異率有關；到12周之后，針對Gag的細胞免疫開始上升，這應該與Gag是病毒的保守核心有關。在這個過程中，針對Pol的細胞免疫均較弱，可能是由于病毒pol基因的變異程度較大有關(圖6)。

3 討論

在HIV研究中，艾滋病毒多次暴露能降低病毒感染的機率是肯定的，但艾滋病毒暴露抑制感染的保護機制陷入了爭議。研究表明，活化的免疫系統應該能夠通過中和抗體，抗體依賴細胞介導的細胞毒作用(ADCC)，尤其是抗病毒的CD8+T細胞(CTL)清除或抑制宿主病毒的感染。Haase等[8]人研究表明，宿主中產生的抗病毒抗體可能防止艾滋病毒的感染；Barker等[9]人研究表明，CD8+T細胞能建立PBMC的抵抗力以致阻止宿主的再次感染。Yeh等人研究表明，細胞免疫水平和體液免疫水平與重復感染沒有相關性，推測其他免疫作用可能參與了超感染的保護作用，天然免疫系統的作用也應該被考慮在內[10]。

由于HIV的種屬特異性，目前缺乏HIV感染動物模型，常用的艾滋病動物模型為SIV感染模型和猴-人免疫缺陷病毒(SHIV)感染模型。鑒于SHIV病毒為人工改造病毒，本研究選擇SIV病毒進行動物免疫接種。根據本實驗室前期工作經驗，選擇10 TCID50作為免疫劑量，一方面避免了大劑量病毒迅速感染動物，另一方面可確保有足夠的病毒影響動物，刺激機體反應。

本研究中，使用SIVmac239病毒小劑量多次直腸粘膜暴露，不斷刺激機體免疫，使其達到較高水平，并與正常感染猴進行比較。血漿病毒載量未見典型感染癥狀，說明病毒多次暴露刺激機體產生了部分保護作用，抑制后續病毒感染和復制。CD4+T細胞數也未見急性期的急劇下降，說明前期病毒暴露阻止了后期病毒的急性感染。但其具體作用機制不明。

T淋巴細胞是機體免疫系統的重要組成成分，根據其分化、歸巢、表面分子及功能的不同，可分為na?ve T細胞(TN)、中心記憶T細胞(TCM)和效應記憶T細胞(TEM)三種，其中CD4+TCM是艾滋病毒的主要靶細胞，其與艾滋病的疾病進程、病毒復制等密切相關，CD4+TN是CD4+TCM主要分化源泉；CD8+TEM是主要的效應殺傷細胞。在本研究中，為進一步探索是否這種隱匿性感染還能誘發疾病進展，本研究檢測了動物的CD4+TCM細胞，結果該細胞群逐漸下降，說明這種隱匿性感染仍存病毒和機體的相互斗爭，而且病毒仍占據上風，導致病毒靶細胞CD4+TCM和效應CD8+TEM細胞顯下降趨勢，但在一年的觀察期內動物均維持健康狀況，說明動物顯慢性進展型。

此外，為了解病毒多次粘膜暴露對細胞免疫狀態的影響，使用IFN-γ ELISPOT方法測定動物細胞免疫狀況，發現針對病毒核心Gag的細胞免疫最強，但整體而言，病毒多次暴露在病毒接種期間和之后的細胞免疫均較弱，這可能是由病毒復制水平低，免疫原不多導致，也可說明病毒抑制與細胞免疫的壓制關系不大。因此，需要進一步探索其他免疫機制對病毒復制抑制的作用。

[1] Blish CA, Dogan O C, Jaoko W，et al. Association between cellular immune activation, target cell frequency, and risk of human immunodeficiency virus type 1 superinfection [J]. J Virol. 2014, 88(10): 5894-5899.

[2] Redd AD, Quinn TC, Tobian AA. Frequency and implications of HIV superinfection [J]. Lancet Infect Dis. 2013, 13(7):622-628.

[3] 吳芳新, 王衛, 劉克劍, 等. 猴艾滋病急性期腸粘膜相關淋巴組織 NK 細胞表型及功能 [J]. 中國比較醫學雜志，2012, 22(6):37-42.

[4] 吳小閑, 張奉學, 何伏秋, 等. 猴免疫缺陷病毒 (SIV) 慢性感染猴模型的建立 [J]. 廣州中醫藥大學學報, 2000, 17(4): 355-357.

[5] Hofmann-Lehmann R, Swenerton RK, Liska V, et al. Sensitive and robust one-tube real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction to quantify SIV RNA load: comparison of one- versus two-enzyme systems [J]. AIDS Res Human Retroviruses，2000, 16(13):1247-1257.

[6] 王衛, 劉強, 許琰, 等. SHIV-KB9 感染中國恒河猴的實驗研究 [J]. 中國比較醫學雜志，2007, 17(2): 67-71.

[7] 王衛, 馮育芳, 許琰, 等. ELISPOT 方法檢測 SIVmac239 感染猴特異性細胞免疫水平 [J]. 中國比較醫學雜志，2008, 18(9):39-43.

[8] Haase AT, Henry K, Zupancic M, et al. Quantitative image analysis of HIV-1 infection in lymphoid tissue [J]. Science，1996, 274(5289):985-989.

[9] Barker E, Bossart KN, Locher CP, et al. CD8+cells from asymptomatic human immunodeficiency virus-infected individuals suppress superinfection of their peripheral blood mononuclear cells [J]. J Gen Virol，1996, 77(Pt 12):2953-2962.

[10] Yeh WW, Jaru-Ampornpan P, Nevidomskyte D, et al. Partial protection of simian immunodeficiency virus (SIV)-infected rhesus monkeys against superinfection with a heterologous SIV isolate [J]. J Virol，2009, 83(6):2686-2696.

Effect of repeated rectal exposure of low-dose simian immunodeficiency virus on the systemic cellular immunity in monkeys

WANG Wei, LIU Ke-jian, WU Fang-xin, CONG Zhe, CHEN Ting, WEI Qiang

(Comparative Medicine Center, Peking Union Medical College (PUMC) & Institute of Medical Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS); Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine, Ministry of Health; Key Laboratory of Human Diseases Animal Models,State administration of Traditional Chinese medicine, Beijing 100021, China)

Objective To study the effect of repeated rectal exposure of low-dose simian immunodeficiency virus on the systemic cellular immunity in monkeys. Methods Eight 3- to 4-year old rhesus macaques (Macacamulatta) (male:female 1:1) were used in this study. The monkeys were inoculated with 10 TCID50SIVmac239 virus through rectum twice a week for consecutive 6 weeks to establish a multiple rectal exposure model of SIVmac239 virus infection. Then, plasma viral load, CD4+T cell count, T cell subsets and IFN-γ secretion of the experiment monkeys were determined. Results Low-dose SIVmac239 virus induced some changes in the immune system through the rectal mucosa, but didn’t induce typical infection. Repeated rectal mucosal low-dose virus exposure can activate the cellular immune system. Conclusions This study defines the effect of repeated low-dose simian immunodeficiency virus exposure on the systemic cellular immunity, and provided basic information for HIV-1 vaccine research.

Simian immunodeficiency virus, SIVmac239; Exposure; Rectal mucosa; Cellular immunity; Monkey

國家科技重大專項課題(2012ZX10004501-001, 2013ZX10004608-003, 2012ZX10001006-003)。

王衛(1981- )，男，碩士，助理研究員，比較醫學專業。

魏強，教授，博士生導師，研究方向：實驗動物病毒學。Email: weiqiang0430@sohu.com。

R33

A

1671-7856(2014) 08-0001-06

10.3969.j.issn.1671.7856. 2014.008.001

2014-05-27