Lgr5在慢性淺表性胃炎中的表達*

周小嬪， 王佐妤， 劉彩紅， 謝立群

(武警后勤學院附屬醫院消化內科，天津 300162)

Lgr5在慢性淺表性胃炎中的表達*

周小嬪， 王佐妤， 劉彩紅， 謝立群△

(武警后勤學院附屬醫院消化內科，天津 300162)

目的： 探討富含亮氨酸重復序列的G蛋白偶聯受體5(Lgr5)在慢性淺表性胃炎中的表達及其臨床意義。方法: 將30只Wistar大鼠隨機分為空白組、模型組和對照組。采用0.02%氨水合并饑飽失常法對大鼠進行慢性淺表性胃炎造模，模型復制成功后，采用免疫組化、Western blotting和RT-PCR檢測各組中Lgr5的mRNA及蛋白的表達水平。結果: Lgr5主要在細胞的胞膜和胞漿中表達，模型組中Lgr5 mRNA和蛋白表達水平高于對照組和空白組大鼠(P<0.01)，對照組和空白組中Lgr5表達水平差異不顯著(P>0.05)。結論: 持續的炎癥刺激導致Lgr5表達增加，Lgr5可能是一種炎性的促腫瘤因子。

Lgr5蛋白； Wnt信號通路； 慢性淺表性胃炎

富含亮氨酸重復序列的G蛋白偶聯受體5(leucine-rich repeat-containing G-protein-coupled receptor 5, Lgr5)又名GPR49，是一種G蛋白偶聯受體，是Wnt信號通路的一種靶基因，還是一種潛在的人類腸干細胞標志物[1-3]。已有研究表明Lgr5在人類不同腫瘤的發生中起重要作用，包括肝癌、基底細胞癌、結腸癌、卵巢癌和食管癌等等[4-7]。近年來發現Lgr5與胃癌的發生發展也十分密切。慢性淺表性胃炎(chronic superficial gastritis, CSG)是多種誘因引起的慢性胃黏膜炎癥，由攻擊因子和/或防御因子失衡所導致部分淺表性胃炎，屬于消化系統的常見病、多發病之一[8]。其失于治療極易進展為慢性萎縮性胃炎繼而發生癌變。本研究主要觀察大鼠慢性淺表性胃炎胃組織中Lgr5表達的變化，從而在早期發現其與胃癌發展的相關性，起到早期發現并預防胃癌的進一步發展。

材 料 和 方 法

1 試劑

TRIzol試劑(Invitrogen)；RT-PCR試劑盒(TransGen)；β-actin抗體(中國博奧森公司)；Lgr5抗體(Epitomics)；II抗(Abgent)。

2 實驗動物及分組

將30只成年雄性7周齡Wistar大鼠編號，稱重，按隨機數字表順序分為3組、即空白(blank)組，對照(control)組和模型(model)組，每組10只。

3 主要方法

3.1 建立動物模型 參照王睿琦等[9]研究的慢性淺表性胃炎造模法，空白組的動物不做任何處理，正常飼養，自由飲水；對照組的大鼠正常飼養，并給予0.9%生理鹽水每日自由飲用；模型組的大鼠0.02%氨水自由飲用(現配)，饑飽失常(進食2 d，禁食1 d)。所有大鼠飼養6個月。

3.2 RT-PCR 模型復制成功后，每組取6只大鼠麻醉處死，無菌條件下取胃竇組織，用TRIzol法提取總RNA并逆轉錄為cDNA。利用Pubmed-blast設計目的基因引物(引物由北京鼎國生物科技公司合成)。Lgr5和內參照β-actin基因的引物序列見表1。RT-PCR反應條件為95 ℃5 min，94 ℃30 s、59 ℃30 s、72 ℃45 s，共35個循環。產物行2%瓊脂糖凝膠電泳，用捷達圖像分析系統捕獲圖像并用灰度掃描分析結果。

表1 RT-PCR引物序列

3.3 Western blotting檢測 模型復制成功后取材，每100 mg組織樣本加入100 μL裂解液，充分研磨后于冰上裂解10 min， 12 000 r/min離心10 min，取上清液。BCA試劑盒測定蛋白濃度后，取60 μg蛋白樣本，經SDS-PAGE分離后轉至硝酸纖維素膜，脫脂奶粉封閉1 h，加入Lgr5的 I 抗，4 ℃過夜，洗膜后加II抗，37 ℃孵育1 h。使用ECL液顯色，最后進行顯影、定影，用Bio-Rad凝膠成像系統掃描吸光度值，用Image-Pro Plus 6.0軟件進行分析。定量結果應用GraphPad Prism 6.0統計軟件作圖。

3.4 HE染色 造模成功后，將大鼠麻醉處死，取胃竇組織置于10%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片放在60 ℃烘箱中烘烤30 min，常規脫蠟，流水沖洗10 min后，蘇木素染色3 min。隨后用流水沖洗10 min，伊紅復染2 min，流水沖洗10 min，乙醇脫水，二甲苯2次透明，中性樹膠封固。每張切片在200倍顯微鏡下隨機選擇4個視野進行觀察。

3.5 免疫組織化學染色 造模成功后，應用兔超敏二步法免疫組化試劑盒行免疫組化染色，大鼠胃組織切片用3%的H2O2封閉10 min后，用pH 6.0的枸櫞酸溶液加熱孵育15 min行抗原修復。冷卻至室溫后用5 %的山羊血清37 ℃封閉30 min。滴加Lgr5的Ⅰ抗(工作濃度1∶150)，4 ℃過夜。PBS清洗后滴加II抗37 ℃孵育45 min。PBS清洗后DAB顯色劑顯色，沖洗，蘇木素復染，常規梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。在Nikon偏振光倒置顯微鏡下觀察免疫陽性反應物的分布與定位。隨機選取5個不重復視野，鏡下計數形態完整的Lgr5陽性細胞，計算各組的平均陽性細胞數。

4 統計學處理

用SPSS 16.0統計軟件進行分析。數據均采用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 Lgr5 mRNA表達的變化

與空白組相比，模型組Lgr5 mRNA表達量增加3.53倍，兩者差異顯著(P<0.01)，而空白組和對照組間差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1。

Figure 1.The mRNA expression of Lgr5 determined by RT-PCR. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsblank and control groups.

圖1 Lgr5 mRNA的 表達

2 Lgr5蛋白的表達變化

經Western blotting實驗進一步在蛋白水平驗證，發現模型組中的Lgr5蛋白表達(23.5±0.7)較空白組(12.5±0.6)明顯增高，兩者差異顯著(P<0.01)，但空白組和對照組間差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2。

Figure 2.The protein expression of Lgr5 determined by Western blotting. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsblank and control groups.

圖2 Lgr5 蛋白的表達

3 HE染色結果胃竇組織的病理變化

空白組和對照組胃組織未見異常改變，模型組胃竇黏膜固有膜、黏膜肌及黏膜下見炎細胞浸潤，見圖3。

4 Lgr5免疫陽性產物染色結果

Lgr5陽性產物主要定位于細胞的胞質和胞漿中，空白組和對照組免疫陽性產物表達量較低，模型組(224±11)較空白組(76±5)和對照組(81±3)表達量明顯增加(P<0.05)，見圖4。

討 論

Lgr5是具有18個富含亮氨酸的重復單位和7個跨膜區域組成的大分子蛋白,是G蛋白偶聯受體家族的成員之一，Lgr5在人體分布廣泛，在大腦、脊髓、乳腺、毛囊、眼睛、生殖器官及胃腸道等都有表達[1，10-13]。

Figure 3.The gastric pathological changes in the 3 groups.

圖3 各組大鼠胃組織的病理改變

Figure 4.The protein expression of Lgr5 in gastric tissues (immunohistochemistry staining).

圖4 各組大鼠胃組織的Lgr5表達

Wnt信號傳導通路可影響和調控干細胞的自我更新和分化，在細胞增殖、分化、運動及凋亡過程中發揮重要作用，其異常表達或激活能引起腫瘤。經典的Wnt轉導通路(Wnt/β-catenin)是Wnt蛋白與卷曲蛋白受體(Fizzled)結合，使活化的Fizzled作用于細胞漿的蓬亂蛋白，從而抑制由軸蛋白、腸腺瘤樣息肉蛋白和糖原合成激酶GSK-3β組成的復合物的活性，使β-catenin不能被GSK-3β磷酸化。由于非磷酸化的β-catenin不能被蛋白酶體降解，從而導致β-catenin在胞漿內積聚，并移向核內。與轉錄因子TCF/LEF結合，激活TCF轉錄活性，調節Wnt靶基因的表達[14-15]。

Wnt信號通路都對腫瘤的發生、發展和預后起著關鍵性的作用，而Lgr5 不僅是Wnt信號通路的靶基因，而且在多種腫瘤組織中高表達，Fan等[16]采用免疫組織化學法在結腸癌組織中發現 Lgr5與β-catenin在結腸癌組織中高表達并且呈正相關, 由此推斷Lgr5可能通過Wnt/β-catenin通路參與結腸癌的發生。近年來研究發現Lgr5在胃癌組織中也過度表達并伴有β-catenin核表達，Wnt通路異常激活引起靶基因Lgr5表達增高與胃癌的發生發展密切相關。Lgr5在各種腫瘤中過度表達，所以推測Lgr5是多種不同腫瘤干細胞標記物。Wnt通路不光與腫瘤相關，還參與一些炎癥反應。Sen等[17]和Polzer等[18]證實Wnt信號參與一些慢性炎癥疾病，如風濕樣關節炎、動脈粥樣硬化。有研究[19]表明損傷能驅動內源性Wnt通路, 激活Wnt信號參與損傷組織的修復、愈合和再生。慢性淺表性胃炎是慢性胃炎中的一種，消化系統多發病之一。部分淺表性胃炎不引起重視極易進展為慢性萎縮性胃炎而致胃癌發生，持續炎癥可導致細胞微環境改變，干細胞長期積累突變，使得生物學行為永久性改變，最終導致腫瘤發生，干細胞和炎癥均與胃癌的發生發展相關。我們主要想研究發現Lgr5在部分慢性淺表性胃炎中表達情況，在本研究中發現模型組大鼠胃組織中Lgr5蛋白及基因表達水平都高于正常組,且差異有統計學意義。長時間刺激藥物灌胃對大鼠胃組織造成持續的炎癥刺激,持續的炎癥可能激活Wnt經典信號通路,而Lgr5又是Wnt通路的靶基因,從而引起Lgr5表達增加。所以我們推測Lgr5也可能為一種炎性促腫瘤重要因子。

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Expression of Lgr5 in chronic superficial gastritis

ZHOU Xiao-pin, WANG Zuo-yu, LIU Cai-hong, XIE Li-qun

(DepartmentofGastroenterology,AffiliatedHospitalofLogisticsCollegeofChineseArmedPoliceForces,Tianjin300162,China.E-mail:xieliqun66@hotmail.com)

AIM: To investigate the expression and significance of Leucine-rich repeat-containing G-protein-coupled receptor 5 (Lgr5) in chronic superficial gastritis. METHODS: The Wistar rats (n=30) were randomly divided into blank group, model group and control group. The Wistar rat model of chronic superficial gastritis was established by intragastric administration of 0.02% ammonia and long-term irregular diet. All rats were sacrificed， and gastric tissues were harvested and stained with hematoxylin and eosin. The expression of Lgr5 at mRNA and protein levels was analyzed by reverse transcriptional polymerase chain reaction, Western blotting and immunohistochemistry. RESULTS: Lgr5 was mainly expressed in the cell membrane and cytoplasm. Lgr5 showed high expression in model group compared with blank group and control group. No obvious difference between blank group and control group was observed. CONCLUSION: Persistent inflammation leads to increased expression of Lgr5. Lgr5 may be a proinflammatory tumor promoting factor.

Lgr5 protein; Wnt signaling pathway; Chronic superficial gastritis

1000- 4718(2014)12- 2272- 04

2014- 06- 03

2014- 10- 15

武警后勤學院院級科學基金資助項目(No. WHM201311)

R573.3+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.028

△通訊作者Tel: 022-60578661; E-mail: xieliqun66@hotmail.com