大鼠血清網(wǎng)膜素-1水平與胰島素抵抗的相關(guān)性*

王楠楠， 趙曉娟△， 陳 薇， 白淑亭， 楊博文

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1內(nèi)分泌科， 2流行病科，遼寧 沈陽 110001)

大鼠血清網(wǎng)膜素-1水平與胰島素抵抗的相關(guān)性*

王楠楠1， 趙曉娟1△， 陳 薇1， 白淑亭1， 楊博文2

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1內(nèi)分泌科，2流行病科，遼寧 沈陽 110001)

目的： 建立胰島素抵抗大鼠模型，探討血清網(wǎng)膜素-1水平與胰島素抵抗的相關(guān)性。方法：30只SPF級雄性Wistar大鼠隨機分為正常對照組(NC，n=15)、高脂飲食組(HF，n=15)，自由攝食、飲水，NC組給予普通飼料，HF組給予高脂飼料誘導(dǎo)胰島素抵抗模型。10周后2組各取5只行高胰島素正葡萄糖鉗夾實驗評估模型，ELISA法檢測血清網(wǎng)膜素-1，放射免疫法檢測血清基礎(chǔ)胰島素。結(jié)果：(1)各組大鼠基礎(chǔ)血糖比較無顯著差異(P>0.05)。(2)HF組血清基礎(chǔ)胰島素水平較NC組明顯升高(P<0.05)，但血清網(wǎng)膜素-1水平較NC組明顯降低(P<0.01)。(3)Pearson相關(guān)性分析示血清網(wǎng)膜素-1分別與胰島素(r=-0.654，P<0.01)和游離脂肪酸(r=-0.446，P<0.05)呈負相關(guān)。結(jié)論：在大鼠胰島素抵抗階段，血清網(wǎng)膜素-1水平已經(jīng)開始降低；基礎(chǔ)胰島素水平隨著血清網(wǎng)膜素-1水平的降低而升高，推測血清網(wǎng)膜素-1水平降低可能成為胰島素抵抗、糖尿病及心血管疾病的早期提示因子。

胰島素抵抗； 高胰島素正葡萄糖鉗夾； 網(wǎng)膜素-1

胰島素抵抗(insulin resistance，IR)不僅是糖尿病的病因之一，也是高血壓、血脂異常及動脈粥樣硬化的共同危險因素。近期研究表明，脂肪組織通過多種脂肪內(nèi)分泌激素，參與能量代謝、胰島素抵抗、炎癥反應(yīng)、動脈粥樣硬化等病理生理過程。網(wǎng)膜素-1(omentin-1)是特異性表達于網(wǎng)膜脂肪組織的細胞因子，可改善胰島素敏感性，參與胰島素抵抗相關(guān)的糖代謝調(diào)節(jié)[1]。在肥胖、糖尿病及多囊卵巢綜合征等患者體內(nèi)呈低表達水平[2-3]。隨著研究的進展，發(fā)現(xiàn)網(wǎng)膜素-1還具有抗炎、舒張血管作用[4]。本文旨在探討大鼠血清網(wǎng)膜素-1水平與胰島素抵抗相關(guān)性。

材 料 和 方 法

1 實驗動物、主要試劑與儀器

SPF級雄性Wistar大鼠30只(遼寧長生生物技術(shù)有限公司)，體重(230±20)g，飼養(yǎng)于中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心屏障系統(tǒng)中，室溫21～25 ℃，濕度60%左右，明暗交替周期12 h，自由攝食、飲水。以基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

胰島素放射免疫分析藥盒購于原子高科股份有限公司；大鼠血清網(wǎng)膜素-1 ELISA試劑盒(R&D)檢測范圍為1.5 ng/L～400 ng/L；微量輸液泵；全波長酶標儀；紫外分光光度儀。

2 實驗方法

2.1 建立胰島素抵抗大鼠模型 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常對照組(NC，n=15)和高脂飲食組(HF，n=15)。正常對照組給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，高脂飲食組給予高脂飼料喂養(yǎng)，誘導(dǎo)胰島素抵抗模型。基礎(chǔ)飼料熱量比：蛋白質(zhì)28.58%，脂肪9.59%，碳水化合物61.83%。高脂飼料配方如下：基礎(chǔ)飼料+豬油+奶粉，熱量比為蛋白質(zhì)14%，脂肪59%，碳水化合物27%。

2.2 高胰島素正葡萄糖鉗夾實驗 動物喂養(yǎng)10周以后，NC組、HF組隨機各抽取5只大鼠，采用高胰島素正葡萄糖鉗夾實驗，評估胰島素抵抗模型，具體方法參照文獻[5]實施。首先輸注胰島素，輸注率1.67 mU·kg-1·min-1，每5 min在頸動脈取1滴血測血糖。當血糖<基礎(chǔ)值±0.5 mmol/L時開始輸注葡萄糖。葡萄糖輸注率(glucose infusion rate，GIR)從4～6 kg/min開始，每5 min測血糖1次，調(diào)整GIR，使血糖保持在基礎(chǔ)值±0.5 mmol/L。連續(xù)3次血糖都在上述范圍內(nèi)，鉗夾形成。實驗共計約2 h，計算60～120 min的平均GIR，以評價胰島素的敏感性。

2.3 標本采集 在大鼠禁食14 h后，測定空腹血糖；予10%水合氯醛麻醉(腹腔注射)，內(nèi)眥靜脈采血，分離血清，應(yīng)用胰島素放免藥盒檢測血清胰島素水平，ELISA法測定血清網(wǎng)膜素-1和游離脂肪酸(free fatty acid, FFA)水平。鉗夾實驗結(jié)束后剖殺動物，心臟穿刺取血，分離血清，-70 ℃冰箱保存；完整剝離大鼠附睪脂肪，稱重，計算附睪脂肪質(zhì)量占體質(zhì)量的比例(g/g)，即附睪脂肪質(zhì)量指數(shù)。

2.4 ELISA法測定血清網(wǎng)膜素-1和FFA水平 實驗前將試劑盒及血清樣品平衡至室溫，確定所需的酶標包被板的數(shù)目，標準品孔、空白孔及樣品孔均做復(fù)孔，嚴格按照說明書操作，以空白孔調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度(A值)。根據(jù)標準品的濃度及對應(yīng)的A值計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的A值在回歸方程上計算出相應(yīng)的樣品濃度。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0軟件進行分析，所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，兩組間各指標均數(shù)的比較用t檢驗，正態(tài)分布資料的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠體重及附睪脂肪質(zhì)量指數(shù)

附睪脂肪質(zhì)量指數(shù)常用于評估內(nèi)臟脂肪含量，本實驗大鼠喂養(yǎng)10周后，HF組較NC組體重、附睪脂肪質(zhì)量指數(shù)明顯升高(P<0.01)，提示長期高脂飲食導(dǎo)致的大鼠肥胖為內(nèi)臟脂肪性肥胖，見表1。

表1 高脂飲食對大鼠體重和附睪脂肪質(zhì)量指數(shù)的影響

Table 1.Weight and epididymal fat mass index in NC group and HF group (Mean±SD.n=10)

GroupWeight(g)Epididymalfatmassindex(%)NC513.41±46.500.75±0.12HF585.23±32.64**1.12±0.10**

NC: normal control; HF: high-fat diet.**P<0.01vsNC.

2 高胰島素正葡萄糖鉗夾實驗

喂養(yǎng)10周后行鉗夾實驗，HF組大鼠平均GIR為(1.19±0.32) mg·kg-1·min-1，顯著低于NC組(3.95±0.31) mg·kg-1·min-1(P<0.01)，提示胰島素抵抗大鼠模型建立成功。

3 空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、血清基礎(chǔ)胰島素(insulin,INS)和血清網(wǎng)膜素-1水平的變化

各組大鼠基礎(chǔ)血糖比較無顯著差異(P>0.05)。HF組的血清基礎(chǔ)胰島素較NC組明顯升高(P<0.05)，血清網(wǎng)膜素-1明顯降低(P<0.01)，見表2。

4 部分指標的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示：血清網(wǎng)膜素-1分別與INS (r=-0.654,P<0.01)和FFA (r=-0.446,P<0.05)呈負相關(guān)，但血清網(wǎng)膜素-1與體重和附睪脂肪質(zhì)量指數(shù)無明顯相關(guān)性，見圖1。

表2 高脂飲食對大鼠FBG、INS、omentin-1 和FFA水平的影響

NC: normal control; HF: high-fat diet; FBG: fasting blood glucose; INS: insulin; FFA: free fatty acids.*P<0.05,**P<0.01vsNC.

Figure 1.The result of correlation analysis between omentin-1 with INS (A) and FFA (B).

圖1 Omentin-1與胰島素及FFA的相關(guān)分析

討 論

附睪脂肪質(zhì)量指數(shù)常用于評估內(nèi)臟脂肪含量，本實驗結(jié)果表明高脂飲食組明顯高于正常飲食組，提示長期高脂飲食導(dǎo)致的大鼠肥胖為內(nèi)臟脂肪性肥胖。相關(guān)研究表明，肥胖者葡萄糖利用障礙，胰島素抑制肝糖產(chǎn)生作用降低，游離脂肪酸代謝增高可影響葡萄糖的利用。上述均可導(dǎo)致胰島素抵抗，為滿足機體糖代謝需求，需分泌更多的胰島素造成高胰島素血癥，而高胰島素血癥可以使脂肪細胞合成增加，分解減少。因此，高胰島素血癥和高游離脂肪酸是肥胖者胰島素抵抗的重要特征，本研究測得IR大鼠的血清基礎(chǔ)胰島素、游離脂肪酸水平均明顯高于NC組，與這一特征一致。

網(wǎng)膜素的基因位于染色體1q22～23，這一區(qū)域是糖尿病致病基因的候選區(qū)[1]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，其調(diào)節(jié)糖代謝的主要機制為促進脂肪細胞胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取作用，并促進胰島素受體后信號通路中的Akt磷酸化，即可增加脂肪細胞的胰島素敏感性。因此隨著網(wǎng)膜素-1水平的降低胰島素敏感性下降，導(dǎo)致高胰島素血癥，進而發(fā)生胰島素抵抗，促進糖尿病及心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。

研究發(fā)現(xiàn)，在肥胖、多囊卵巢綜合征、糖耐量減低、1型糖尿病和2型糖尿病患者中，血清網(wǎng)膜素-1水平、網(wǎng)膜脂肪組織中網(wǎng)膜素-1的mRNA表達水平和蛋白含量均明顯降低，且網(wǎng)膜組織網(wǎng)膜素-1基因的表達和分泌受到胰島素和葡萄糖的抑制，并呈劑量依賴性[2-3, 6]。Wurm等[7]對12例正常體重、胰島素敏感的正常人進行嚴格的OGTT試驗，發(fā)現(xiàn)網(wǎng)膜素-1與空腹和餐后的血糖水平?jīng)]有明顯的相關(guān)性。上述研究表明，短時的葡萄糖攝取增多并未引起血清網(wǎng)膜素-1發(fā)生明顯波動，但是持續(xù)的高血糖狀態(tài)及高胰島素水平對其基因表達與蛋白合成有下調(diào)作用[2-3, 6-7]。

在人群調(diào)查中，發(fā)現(xiàn)網(wǎng)膜素-1有比較一致的結(jié)果，我們期望進一步研究這一現(xiàn)象的功能及機制，因此動物模型的建立及實驗相當重要。本研究采用高脂飼料喂養(yǎng)大鼠10周后成功建立胰島素抵抗模型，測得IR組大鼠血清網(wǎng)膜素-1水平較NC組明顯減低，Pearson相關(guān)性分析結(jié)果示血清網(wǎng)膜素-1與基礎(chǔ)胰島素呈明顯負相關(guān)，表明在大鼠胰島素抵抗階段，血清網(wǎng)膜素-1水平已經(jīng)開始降低；胰島素水平越高，血清網(wǎng)膜素-1水平就越低，即胰島素敏感性隨著血清網(wǎng)膜素-1水平的降低而降低，這與人群研究一致[2-3]。當血清網(wǎng)膜素-1水平降低時，提示高血糖狀態(tài)或高胰島素水平已經(jīng)維持了相當長的時間，推測血清網(wǎng)膜素-1水平降低可能成為IR、糖尿病及心血管疾病的早期提示因子。由于2型糖尿病患者早期可能沒有明顯的不適感覺，因此檢測網(wǎng)膜素-1水平，以期為早期診斷及臨床治療提供新思路。但也有相關(guān)研究認為大鼠血清網(wǎng)膜素-1與胰島素抵抗呈正相關(guān)[8]，該實驗同樣采取高脂飼料喂養(yǎng)，但可能由于高脂飼養(yǎng)配方不同、大鼠周齡不同、體重不同或?qū)嶒炚`差等原因出現(xiàn)結(jié)果的差異，因此需要更多的研究和探討。

綜上所述，血清網(wǎng)膜素-1作為目前已知的4個可增加胰島素敏感性的“有益”脂肪因子(脂聯(lián)素、內(nèi)脂素、vaspin和網(wǎng)膜素)之一[9]，可能通過調(diào)節(jié)代謝、改善胰島素抵抗、發(fā)揮抗炎作用及保護血管內(nèi)皮功能等機制參與肥胖、糖尿病、心腦血管疾病的發(fā)生與發(fā)展。網(wǎng)膜素-1在體內(nèi)調(diào)控及細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)機制尚未完全闡明，深入研究其生物學(xué)功能及其機制，可為肥胖、糖尿病、心血管疾病及其并發(fā)癥等提供新的早期診斷指標。

[1] Yang RZ, Lee MJ, Hu H, et al. Identification of omentin as a novel depot-specific adipokine in human adipose tissue: possible role in modulating insulin action[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2006, 290(6):E1253-E1261．

[2] Tan Bk, Adya R, Farhatullah S, et al. Omemin-1, a novel adipokine, is decreased in overweight insulin-resistant women with polycystie ovary syndrome：exvivoandinvivoregulation of omentin-1 by insulin and glucose[J]. Diabetes, 2008, 57(4):801- 808．

[3] Tan BK, Pua S, Syed F, et al. Decreased plasma omentin-1 levels in type 1 diabetes mellitug[J]. Diabet Med, 2008, 25(10):1254-1255．

[4] Moreno-Navarrete JM, Ortega F, Castro A, et al. Circulating omentin as a novel biomarker of endothelial dysfunction[J]. Obesity, 2011, 19(8):1552-1559.

[5] 李蘭芳,郭 玉,唐國濤,等.高脂飲食導(dǎo)致大鼠肝臟胰島素抵抗的作用機制研究[J].中國病理生理雜志,2011,27(2):310-314.

[6] Akbarzadeh S, Ghasemi S, Kalantarhormozi M, et al. Relationship among plasma adipokines, insulin and androgens level as well as biochemical glycemic and lipidemic markers with incidence of PCOS in women with normal BMI[J]. Gynecol Endocrinol, 2012, 28(7):521-524.

[7] Wurm S, Neumeier M, Weigert J, et al. Plasma levels of leptin, omentin, collagenous repeat-containing sequence of 26-kDa protein (CORS-26) and adiponectin before and after oral glucose uptake in slim adults[J]. Cardiovasc Diabetol, 2007, 6:7.

[8] 呂攀攀，瞿 平，畢 楊，等. 高脂飼料誘導(dǎo)的肥胖大鼠網(wǎng)膜素水平的實驗研究[J]. 生命科學(xué)研究，2012, 16(2):144-148.

[9] Campos DB, Palin MF, Bordignon V, et al. The ‘beneficial’ adipokines in reproduction and fertility[J]. Int J Obes (Lond), 2008, 32(2):223- 231.

Correlation of serum omentin-1 level and insulin resistance in rats

WANG Nan-nan1, ZHAO Xiao-juan1, CHEN Wei1, BAI Shu-ting1, YANG Bo-wen2

(1DepartmentofEndocrinology,2DepartmentofEpidemic,TheFirstHospital,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China.E-mail:zhaoxiaojuan@medmail.com.cn)

AIM: To establish the insulin resistance rat model for evaluating the correlation of omentin-1 level and insulin resistance. METHODS: SPF male Wistar rats (n=30) were randomly divided into normal control group (NC,n=15) and high-fat diet group (HF,n=15). The rats in NC group were fed with basic diet. The insulin resistant model was established by feeding the rats with high-fat diet in HF group. After 10 weeks, 5 rats in each group were assessed by the technique of hyperinsulinaemic-euglycaemic clamp. After the insulin resistant model was successfully established, the body weight and fasting blood glucose were detected. The concentration of fasting serum omentin-1 was analyzed by ELISA. Fasting serum insulin was measured by radioimmunoassay. RESULTS: No difference of fasting blood glucose between the 2 groups was observed. The level of fasting serum insulin in HF group was significantly higher than that in NC group (P<0.05). The level of serum omentin-1 in HF group were significantly decreased compared with NC group (P<0.01). Pearson’s correlation analysis showed that negative correlations between serum omentin-1 and fasting serum insulin (r=-0.654，P<0.01), serum omentin-1 and free fatty acid (r=-0.446，P<0.05) was found. CONCLUSION: In rats, serum omentin-1 level began to decrease at insulin resistance stage. As serum omentin-1 level decreased, the basal insulin level increased, indicating that decreased serum omentin-1 level may be an early factor of IR, diabetes and cardiovascular diseases.

Insulin resistance; Hyperinsulinaemic-euglycaemic clamp; Omentin-1

1000- 4718(2014)12- 2276- 04

2014- 05- 26

2014- 10- 31

遼寧省科學(xué)技術(shù)計劃資助項目(No. 2009225010-10)

R587

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.029

△通訊作者 Tel: 024-83283135; E-mail: zhaoxiaojuan@medmail.com.cn