肝移植并FK506聯合用藥后人血清蛋白質組的二維凝膠電泳分析

李 彥，王鴻麗， 趙永強，劉 煜，梁 艷

肝移植并FK506聯合用藥后人血清蛋白質組的二維凝膠電泳分析

李 彥1，王鴻麗2， 趙永強2，劉 煜3，梁 艷1

目的探索肝臟移植并FK506聯合用藥后人血清中蛋白質組的變化，研究免疫排斥反應的機制及FK506聯合用藥的作用。方法取5例肝癌患者移植前和移植后24 h、10 d、30 d、90 d、180 d的血清樣品，用Aurum Serum Protein Mini Kit除高峰度蛋白，進行雙向電泳(2-DE)分離，ImageMaster 2D Platinum圖像分析軟件分析電泳圖譜。結果建立移植前和移植后并FK506聯合用藥的人血清雙向電泳差異圖譜，蛋白斑點數在(877±59)～(897±61)，移植前、后不同組之間的匹配均>70%。共篩選出重復性好且表達顯著差異的蛋白質斑點7個。結論初步建立了肝移植并FK506聯合用藥后人血清蛋白質組的2-DE分析方法。

肝移植；免疫排斥；免疫抑制藥；FK506；血清；雙向電泳

普樂可復(tacrolimus, FK506) 是大環內酯類免疫抑制藥[1]，目前已成為臨床抗排斥反應的首選藥物，用于肝臟或腎臟移植術后其他免疫抑制藥物無法控制的移植物排斥反應[2,3]，其體內作用機制還在深入研究中。免疫抑制藥驍悉可改善肝移植術后服用FK506造成的腎損傷，常和激素一起與FK506聯合用藥[4,5]。由于蛋白質不僅是多種致病因子對機體作用最重要的靶分子，而且也是大多數藥物的靶標，應用蛋白質組學等生物技術在發現新的藥物靶標、論證藥理作用及不良反應等方面已發揮了有效作用[6,7]。筆者采用蛋白質組學技術中的雙向凝膠電泳(2-DE)技術，通過比較移植前和移植后蛋白質組的電泳圖譜差異，尋找表達差異蛋白質，旨在從蛋白質組學角度探索肝移植后的免疫排斥機制，以及FK506聯合用藥的作用機制，為合理選擇和使用免疫抑制藥，以及探索免疫抑制藥治療方案提供線索。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 取5例武警總醫院肝移植研究所肝癌移植患者(年齡27～65歲)移植前和移植后24 h、10 d、30 d、90 d、180 d的血清樣品，共6組30個樣品。移植后采用三聯用藥: FK506+驍悉+激素，3個月時停用激素，3個月內FK506濃度為8～10 ng/ml，3～6個月為6～8 ng/ml。

1.2 試劑 血清樣品處理試劑盒(Aurum Serum Protein Mini Kit)購自BIO-RAD公司，3000 MW超濾管購自Sartorius公司，IPG膠條(ImmobilineTM DryStrip，pH3-10，NL,18cm)、IEF buffer ( pH3～10，NL)。CHAPS、十二烷基硫酸鈉(SDS)、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷(Tris)購自GE公司。硝酸銀、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺等購自Sigma公司。

1.3 設備 PROTEAN等電聚焦電泳儀、垂直板電泳儀(PROTEAN Ⅱxi Cell)購自Bio-Rad公司。ImageMaster 2D platinum圖像分析軟件購自Amersham Pharmacia公司。UV160紫外分光光度計購自日本SHIMADSU公司，MIKRO 22R冷凍離心機購自德國Hettich公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 樣品制備 血清中高豐度白蛋白和IgG的去除按照Aurum Serum Protein Mini Kit的操作方法，處理后的血清用3000 MW超濾管4 ℃、8000 r/min離心40 min，取上清。按Bradford法進行蛋白定量[8]。

1.4.2 雙向電泳

1.4.2.1 第一向等電點聚焦 分別取180 μg處理后的血清，加入重泡脹液(8 M Urea、8%CHAPS、0.5% IEF buffer、微量溴酚藍)至總體積350 μl，震蕩混勻，均勻加入IEF聚焦槽中，膠條膠面朝下貼在混合液上，用礦物油覆蓋膠條。聚焦參數：水化1 h；30 V 10 h；500 V 30 min；1000 V 30 min；2000 V 30 min；5000 V 30 min；8000 V 30 min；10 000 V至80 000 VHrs。

1.4.2.2 平衡 聚焦后的IPG膠條在含20 mM的DTT和碘乙酰胺平衡液(50 mM, 1.5 M Tris-Cl,pH8.8、6 M Urea、30%Glycerol、20%SDS、微量溴酚藍)中分別平衡15 min。

1.4.2.3 第二向SDS-PAGE電泳及染色 用13%(T為13%，C為2. 6%)的SDS-PAGE凝膠分離，恒流20 mA/膠，40 min，30 mA/膠至溴酚藍前沿至凝膠底部。應用硝酸銀染色法染色[9]。

1.4.3 凝膠分析 應用Labscan掃描軟件獲取圖像，用圖像分析軟件對2D凝膠圖像進行點檢測、校準、定量蛋白質點、匹配、比較等分析。差異蛋白質點的篩選使用圖像分析軟件和人工驗證的方法，對比移植前后所有分離蛋白質斑點的%Vol值(包含在n個蛋白質點的一張凝膠中，蛋白質點X在所有點體積之和中所占的相對體積)。

2 結 果

獲得免疫抑制藥FK506+驍悉+激素聯合用藥在肝移植后人血清蛋白質的雙向電泳差異表達譜(圖1)。肝移植前后樣本的生物學重復性為3次，由圖像分析軟件分析各電泳圖譜，得到肝移植前和肝移植后24 h、10 d、30 d、90 d、180 d圖譜的蛋白斑點數分別為(898±23)、(934±43)、(919±62)、(877±59)、(976±61)和(932±45)個，肝移植前和肝移植后的平均匹配率>70%以上。共篩選出表達量差異>2倍且在不同患者之間重復性好的蛋白質斑點7個(表1)。其中蛋白質斑點624移植后蛋白斑點顯著上調(>3倍)且在移植后的不同階段表達穩定；蛋白點785的表達量在移植前和移植后的不同時間段呈現逐漸上調變化；斑點793在移植后24 h表達量明顯升高，且在隨后的時間段表達量保持穩定；斑點576在移植后24 h后表達下調，在移植10 d后的不同階段呈現出持續上調的變化。

表1 肝移植前后FK506聯合用藥的人血清顯著蛋白差異表達 (%Vol)

圖1 FK506聯合用藥在肝移植后人血清雙向電泳的差異表達圖譜

3 討 論

近些年，蛋白質組學技術在發現藥物靶點、闡明藥物作用機制等方面的研究中發揮了極大的作用[10,11]，但還未有免疫抑制藥在人肝移植后抗排斥作用的蛋白質組學方面的報道。本研究將5例乙型肝炎肝硬化、肝癌移植前和移植后服用免疫抑制藥FK506+驍悉+激素聯合用藥不同時間段的血清樣品進行比較。樣品采用BIO-RAD公司Aurum Serum Protein Mini Kit試劑盒特異性吸附白蛋白和IgG，用分子量3000 ku超濾管進行除鹽和濃縮。經處理后樣品的凝膠圖譜蛋白質斑點數顯著提高。初步建立了肝移植前和肝移植并FK506聯合用藥后24 h、10 d、30 d、90 d、180 d的2-DE差異表達圖譜。筆者將進一步利用質譜技術鑒定差異蛋白質，以期從蛋白質組學角度深入探索肝移植后FK506+驍悉+激素聯合用藥的作用機制， 為進一步開展肝臟移植和藥物治療奠定基礎。

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(2014-02-18收稿 2014-05-06修回)

(責任編輯 尤偉杰)

Two-dimensionalgelelectrophoresisanalysisofhumanserumproteomeafterlivertransplantationandFK506combinationtherapy

LI Yan1,WANG Hongli2,ZHAO Yongqiang2，Liu Yu3,and LIANG Yan1.1. Department of Pharmacy, 3. Institute of Liver Transplantation, General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Beijing 100039, China;2. National Center of Biomedical Analysis,Beijing 100850, China

ObjectiveTo analyze the serum proteome change after liver transplantation and FK506 combination in human serum by two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) and to study the mechanism of immune rejection and the mechanism of action of FK506 combination.MethodsThe serum samples of 5 liver transplantation patients pre- and post transplantation at 24 hours,10 days,30 days,90 days 180 days were treated using Aurum Serum Protein Mini Kit, and than analyzed by 2-DE. The electrophoresis images were analyzed by using ImageMaster 2D platirum imaging analysis software.ResultsThe differential maps of 2-DE of serum proteome before and after liver transplantation and FK506 combination were established. Protein spots between (877±59.65)-(897.6±61.01),the matching rate before transplantation and different groups after transplantation>70%. Among them 7 protein spots were selected with good repeatability and significant differential expression.ConclusionsThe 2-DE analytical method of serum proteome after liver transplantation and FK506 combination was preliminarily established. The differential expression protein spots found in the study have laid a foundation for the further study .

liver transplantation; immune rejection; immunosuppressant; FK506; serum; 2-DE

武警總醫院二類課題(WZ2011019)

李 彥，本科學歷，副主任藥師，E-mail：lyanbjing@126.com

100039北京，武警總醫院：1.藥劑科，3.肝臟移植研究所；2.100850北京，國家生物醫學分析中心

梁 艷，E-mail：ly.w.j@163.com

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