污泥發(fā)酵液對A2O脫氮除磷和微生物的影響

劉亞利，袁一星，李 欣，詹技靈，康曉榮，董林沛

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)市政環(huán)境工程學(xué)院，150090哈爾濱；2.大連邁克環(huán)境科技有限公司，遼寧大連116000）

污泥發(fā)酵液對A2O脫氮除磷和微生物的影響

劉亞利1，袁一星1，李 欣1，詹技靈2，康曉榮1，董林沛1

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)市政環(huán)境工程學(xué)院，150090哈爾濱；2.大連邁克環(huán)境科技有限公司，遼寧大連116000）

為研究剩余污泥發(fā)酵液作碳源對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，將發(fā)酵液與市政污水按流量比1∶35回用于厭氧-缺氧-好氧反應(yīng)器，在室溫下運(yùn)行90 d.聚類分析表明，發(fā)酵液明顯改變了微生物群落結(jié)構(gòu)，5～30 d和45～90 d的微生物屬于不同的聚集區(qū)；微生物多樣性分析表明，發(fā)酵液使Shannon-Wiener指數(shù)從2.6升高到3.1，系統(tǒng)運(yùn)行穩(wěn)定性增強(qiáng)；PCR-DGGE分析表明，發(fā)酵液對微生物群落具有一定的選擇性，氨氧化菌Nitrosomonas sp.、硝化菌Betaproteobacteria和Nitrospira sp.、反硝化菌Comamonas sp.和聚磷菌Gammaproteobacteria得到富集，TN和TP去除率從64.5%和52.4%提高到84.7%和94.3%.

剩余污泥；脫氮除磷；碳源；生物群落；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳技術(shù)

最近的研究表明，剩余污泥厭氧發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)酸是脫氮除磷的良好碳源［1-2］，且剩余污泥發(fā)酵液比乙酸鹽更適合作為脫氮除磷的碳源［3］. Gao等［4］發(fā)現(xiàn)將剩余污泥發(fā)酵液應(yīng)用于厭氧-缺氧-好氧（A2O）工藝后，TN和TP的去除率達(dá)80.1%和90.0%；Tong等［5］的研究表明，剩余污泥堿發(fā)酵液與市政污水按1∶35投入SBR反應(yīng)器后，總氮（TN）和磷酸鹽（PO43--P）的去除率分別由63.3%和44.0%提高到83.2%和92.9%.為進(jìn)一步研究污泥發(fā)酵液提高污水脫氮除磷效果的機(jī)理，Ji等［6］采用熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)研究污泥發(fā)酵液和乙酸鹽對SBR中脫氮除磷功能菌的影響，發(fā)現(xiàn)污泥發(fā)酵液能夠促進(jìn)短程硝化-反硝化和反硝化除磷反應(yīng)發(fā)生，節(jié)省碳源，提高合成廢水的脫氮除磷效果.Zhu等［7］通過FISH技術(shù)研究發(fā)現(xiàn):在厭氧-低溶解氧工藝中，剩余污泥堿發(fā)酵液能夠增加將氧化二氮（N2O）直接還原為氮?dú)猓∟2）的微生物量，減少N2O和一氧化氮（NO）產(chǎn)生，提高TP和TN去除效率，降低氧氣消耗.

本實(shí)驗(yàn)從實(shí)際應(yīng)用的角度出發(fā)，將剩余污泥發(fā)酵液作為內(nèi)碳源與市政污水按比例混合后，回用于A2O反應(yīng)器.考察投加發(fā)酵液對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，分析微生物群落結(jié)構(gòu)與工藝脫氮除磷效能之間的關(guān)系.同時(shí)采用PCR-DGGE技術(shù)分析投加發(fā)酵液前后脫氮除磷功能菌群的變化.

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

剩余活性污泥取自哈爾濱某污水廠二沉池，經(jīng)超聲（0.6 W／mL；5 min）和堿（pH=12）聯(lián)合預(yù)處理后厭氧發(fā)酵5 d，所得發(fā)酵液于10 000 r／min離心10 min，再通過鳥糞石法去除氮和磷［8］.所得污泥發(fā)酵液的性質(zhì)如下:COD 8 120 mg／L；TN 256.3 mg／L；氨氮（-N）38.1 mg／L；總磷（TP）47.2 mg／L；28.7 mg／L；揮發(fā)酸（VFAs）5 061 mg／L；溶解性蛋白279 mg／L；溶解性多糖91 mg／L.其中VFAs中乙酸、丙酸所占的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為38.2%和30.6%.

1.2 實(shí)驗(yàn)裝置

污水處理工藝流程如圖1所示.A2O反應(yīng)器的厭氧、缺氧和好氧池的水力停留時(shí)間分別為2，2和6 h.缺氧和好氧池的溶解氧分別控制在0.5～1.0和3.0～3.5 mg／L.混合液懸浮固體質(zhì)量濃度（MLSS）為（4 000±500）mg／L，污泥停留時(shí)間為15 d.反應(yīng)器在室溫下連續(xù)運(yùn)行90 d.從第20天開始將污泥發(fā)酵液與市政污水按1∶35［5］投加到反應(yīng)器中，投加前后進(jìn)水水質(zhì)見表1.

圖1 A2O處理工藝流程

表1 投加污泥發(fā)酵液前后進(jìn)水水質(zhì)

1.3 檢測方法

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 工藝運(yùn)行穩(wěn)定性分析

采用出水COD、TN和TP的標(biāo)準(zhǔn)差（Ds）來衡量不同階段出水的波動，進(jìn)而對工藝運(yùn)行穩(wěn)定性進(jìn)行評價(jià).Ds的計(jì)算式為

式中:Ds為COD、TN或TP標(biāo)準(zhǔn)差，mg／L；xi為第i個(gè)出水樣品的COD、TN或TP質(zhì)量濃度，mg／L；ˉx為出水COD、TN或TP質(zhì)量濃度平均值，mg／L；n為數(shù)據(jù)個(gè)數(shù).

1.4.2 生物信息學(xué)分析

微生物種群多樣性采用Shannon指數(shù)（Shannon-Wiener index，H）［12］表示，用來評價(jià)系統(tǒng)內(nèi)微生物種群的豐富程度及分配均勻性，即

式中:Pi為條帶i所占比例；t為條帶數(shù)．

2 結(jié)果和討論

2.1 工藝運(yùn)行效果分析

投加發(fā)酵液前后，COD、TN和TP去除率隨時(shí)間的變化如圖2所示.與市政污水相比，投加發(fā)酵液使進(jìn)水COD升高了220.4 mg／L，但COD去除率仍由86.7%提高到89.2%.這是因?yàn)樵黾拥腃OD以VFAs、溶解性蛋白和多糖為主，能夠在A2O反應(yīng)器中得到完全降解.該結(jié)果與發(fā)酵液作為SBR反應(yīng)器碳源所得的結(jié)論一致［5］.在進(jìn)水TN和TP質(zhì)量濃度略有升高的條件下，發(fā)酵液使TN和TP去除率由64.5%和52.4%提高到84.7%和94.3%.這是因?yàn)?發(fā)酵液中富含的VFAs為聚磷菌提供了最佳碳源［14］；發(fā)酵液使碳氮比由4.1升高到9.0，削弱了反硝化菌和聚磷菌對有限碳源的競爭［3］.

圖2 COD、TN和TP去除率隨時(shí)間的變化

投加發(fā)酵液前后，反應(yīng)器出水COD、TN和TP的標(biāo)準(zhǔn)差如表2所示.發(fā)酵液使出水COD、TN和TP的標(biāo)準(zhǔn)差均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，表明工藝的運(yùn)行穩(wěn)定性先降低后提高.這是因?yàn)榘l(fā)酵液改變了進(jìn)水水質(zhì)，進(jìn)而影響了微生物群落結(jié)構(gòu)，經(jīng)過25 d的馴化期后，適應(yīng)新水質(zhì)的微生物群落結(jié)構(gòu)達(dá)到穩(wěn)定，工藝運(yùn)行穩(wěn)定性提高.

表2 出水COD、TN和TP標(biāo)準(zhǔn)差隨發(fā)酵液的變化mg·L-1

2.2 微生物相似性分析

投加發(fā)酵液前后，反應(yīng)器內(nèi)活性污泥樣品的DGGE圖譜如圖3所示.可以看出，發(fā)酵液導(dǎo)致條帶數(shù)量和強(qiáng)度均發(fā)生了明顯改變.20～45 d時(shí)條帶數(shù)減少，45～90 d時(shí)條帶數(shù)增加.同時(shí)，隨著發(fā)酵液的投加，條帶11，12，14，15，16，17，18和19明顯增強(qiáng)；條帶4和8逐漸減弱，直至消失.

圖3 PCR產(chǎn)物變性梯度凝膠電泳

為進(jìn)一步研究微生物群落之間的關(guān)系，采用聚類分析對污泥樣品中的微生物相似性進(jìn)行分析.由圖4可見，不同進(jìn)水條件的微生物大致分為3類:接種污泥樣本（1 d）聚為一類；市政污水作為進(jìn)水時(shí)的污泥樣本（5～30 d）聚為一類；發(fā)酵液和市政污水混合液作為進(jìn)水時(shí)的污泥樣本（45～90 d）聚為一類.這說明進(jìn)水水質(zhì)對微生物群落具有一定的選擇性，進(jìn)水水質(zhì)發(fā)生改變，種群相似性明顯降低.

圖4 污泥樣品的DGGE圖譜的聚類分析

2.3 微生物多樣性分析

投加發(fā)酵液前后，微生物Shannon-Wiener指數(shù)的變化如圖5所示.可以看出，投加發(fā)酵液后，Shannon-Wiener指數(shù)呈先降低后升高的趨勢，這是進(jìn)水水質(zhì)對細(xì)菌種群篩選的結(jié)果.一方面，不能適應(yīng)水質(zhì)變化的種群被淘汰，Shannon-Wiener指數(shù)降低；另一方面，投加發(fā)酵液前未檢出的部分種群（＜1%）逐漸適應(yīng)水質(zhì)變化，隨工藝運(yùn)行得到積累，Shannon-Wiener指數(shù)升高.

圖5 Shannon-Wiener指數(shù)隨發(fā)酵液的變化

結(jié)合圖2、表2和圖5發(fā)現(xiàn)，微生物多樣性影響工藝的脫氮除磷效能和運(yùn)行穩(wěn)定性［14］.與0～20 d相比，45～90 d時(shí)Shannon-Wiener指數(shù)從2.6升高至3.1，TN和TP去除率由64.5%和52.4%提高到84.7%和94.3%.同時(shí)，45～90 d時(shí)Shannon-Wiener指數(shù)的變化幅度僅為0.06，TN和TP的標(biāo)準(zhǔn)差降至0.61和0.05，工藝運(yùn)行穩(wěn)定性提高.

2.4 測序結(jié)果分析

對19條主要條帶進(jìn)行提取、擴(kuò)增、克隆和測序，將所得的基因序列與NCBI中已鑒定同源性最接近的序列進(jìn)行比對，其同源性達(dá)97%～100%，如表3所示.結(jié)合圖3和表3發(fā)現(xiàn)，條帶8對應(yīng)的氨氧化菌Nitrosospira sp.不能適應(yīng)進(jìn)水水質(zhì)變化而被淘汰，而條帶15對應(yīng)的氨氧化菌Nitrosomonas sp.則隨污泥發(fā)酵液投加而增強(qiáng)，這與前人的研究結(jié)果一致［6］.據(jù)報(bào)道，當(dāng)污泥發(fā)酵液使SBR反應(yīng)器中腐殖酸達(dá)70.5 mg／g時(shí)，會造成亞硝酸鹽積累，抑制硝化菌Nitrospira sp.生長［6］，而本實(shí)驗(yàn)中條帶12和17所對應(yīng)的硝化菌Betaproteobacteria和Nitrospira sp.逐漸增加，表明反應(yīng)器中未發(fā)生明顯的亞硝酸鹽積累.隨著進(jìn)水被轉(zhuǎn)化為硝酸鹽，條帶11所對應(yīng)的反硝化菌Comamonas sp.［15］得以生長，提高了TN的去除效率.投加發(fā)酵液后，條帶18所對應(yīng)的聚磷菌Gammaproteobacteria［16］發(fā)生積累，而條帶4所對應(yīng)的聚糖菌CandidatusCompetibacter phosphatis則逐漸消失，表明除磷效果增強(qiáng).這可能是因?yàn)檫M(jìn)水中含有乙酸和丙酸，且其比例為5∶4，更有利于促進(jìn)聚磷菌積累［17］；另外，聚糖菌因缺少充足的亞硝酸鹽而失去與聚磷菌的競爭力［18］，與Ji等［6］的研究不同的是:條帶1所對應(yīng)的聚磷菌Candidatus Accumulibacter sp.在反應(yīng)器運(yùn)行穩(wěn)定時(shí)消失，這一方面是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)進(jìn)水為市政污水而非合成廢水，水質(zhì)復(fù)雜、波動大［19］；另一方面是因?yàn)樵摷?xì)菌更易以亞硝酸鹽而非硝酸鹽作為電子受體進(jìn)行代謝［20］.同時(shí)，條帶16和19的相似菌Actinobacteria和Trichococcus sp.能夠在厭氧條件下分別將蛋白和多糖降解為乙酸和丙酸，有利于強(qiáng)化生物除磷過程［21］.在本實(shí)驗(yàn)中，條帶14對應(yīng)的Sphingobacteriaceae隨發(fā)酵液的應(yīng)用而逐漸增強(qiáng).該細(xì)菌已被鑒定為生物強(qiáng)化除磷工藝（EBPR）中的反硝化聚磷菌［22］，但其在本實(shí)驗(yàn)中的代謝機(jī)理和功能需要通過FISH等更精確的分子生物學(xué)手段來探索.

表3 細(xì)菌克隆在NCBI庫最為相似的細(xì)菌種類

3 結(jié) 論

1）發(fā)酵液明顯改變了微生物群落結(jié)構(gòu)，5～30 d和45～90 d的微生物屬于不同的類群.

2）發(fā)酵液使Shannon-Wiener指數(shù)從2.6升至3.1，出水TN和TP的標(biāo)準(zhǔn)差降至0.61和0.05，工藝運(yùn)行穩(wěn)定性提高.

3）發(fā)酵液對微生物群落具有一定的選擇性，氨氧化菌Nitrosomonassp.、硝化菌Betaproteobacteria和Nitrospira sp.、反硝化菌Comamonas sp.和聚磷菌Gamma proteobacteria得到富集，TN和TP去除率從64.5%和52.4%提高到84.7%和94.3%.

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（編輯 劉 彤）

The effect of sludge fermentation liquid on nutrient removal performances and microbial community structure in A2O process

LIU Yali1，YUAN Yixing1，LI Xin1，ZHAN Jiling2，KANG Xiaorong1，DONG Linpei1
（1.School of Municipal and Environmental Engineering，Harbin Institute of Technology，150090 Harbin，China；2.Dalian MEC Environmental Technology＆Engineering Co.，Ltd，116000 Dalian，Liaoning，China）

To analyze the effect of sludge fermentation liquid，using as internal carbon source，on microbial community structure in anaerobic-anoxic-aerobic process，three-month-long operational experiment was conducted at flow ratio of fermentation liquid and domestic wastewater 1∶35 at room temperature.The clustering analysis indicated that the microbial community structure was changed significantly by fermentation liquid，and the microbes of 5-30 d and 45-90 d had quite different homology.The microbial diversity analysis demonstrated that the Shannon-Wiener index increased from 2.6 to 3.1，resulting in the enhancement of operational stability.Meanwhile，fermentation liquid appeared to be selective for ammonia-oxidizing bacteria Nitrosomonas sp.，nitrifying bacteria Betaproteobacteria and Nitrospira sp.，denitrifying bacteria Comamonas sp.and phosphorus-accumulating bacteria Gammaproteobacteria，which led to the TN and TP removal efficiency improved from 64.5%and 52.4%to 84.7%and 94.3%，respectively.

waste activated sludge；nutrient removal；carbon source；bacterial community；PCR-DGGE

TU992.3

A

0367-6234（2014）10-0042-05

2013-09-12.

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）資助項(xiàng)目（2012AA063503-02）.

劉亞利（1982—），女，博士研究生；

袁一星（1957—），男，教授，博士生導(dǎo)師.

袁一星，yyx1957＠163.com；

李 欣，lixinwindows＠163.com.