重樓皂苷促成骨樣細胞MC3T3-E1增殖作用及其機制

許曉蓮，李 勃

重樓皂苷促成骨樣細胞MC3T3-E1增殖作用及其機制

許曉蓮，李 勃

目的 研究重樓皂苷對成骨樣細胞MC3T3-E1細胞增殖的作用及其機制。方法 培養(yǎng)成骨樣細胞MC3T3-E1，加入不同濃度的重樓皂苷(3、10、30、100 μg/ml)，采用MTT比色試驗法、EdU試劑盒、堿性磷酸酶(ALP)活性檢測法觀察MC3T3-E1的增殖情況，以Western blot方法觀察重樓皂苷 (30、100 μg/ml)對成骨樣細胞中β-連環(huán)素(β-catenin)和骨形成蛋白-2 (BMP-2)表達的影響。結(jié)果 重樓皂苷可有效促進成骨樣細胞MC3T3-E1的增殖(增殖率117.67～153.33)， 濃度依賴性地升高β-catenin與BMP-2的表達。結(jié)論 重樓皂苷可能通過調(diào)節(jié)β-catenin與BMP-2信號通路促進MC3T3-E1細胞增殖與分化。

重樓皂苷；成骨樣細胞MC3T3-E1；增殖；骨形態(tài)發(fā)生蛋白2；β-連環(huán)素

重樓又名“七葉一枝花”，為百合科植物，以根莖入藥；主要分布于廣西、貴州、四川、廣東、浙江、江西等省，具有敗毒抗癌、消腫止痛、清熱定驚、鎮(zhèn)咳平喘的功效。重樓主要針對癰腫肺癆久咳、跌打損傷、蛇蟲咬傷、淋巴結(jié)核、骨髓炎等癥，是云南白藥的主要成分之一，其具生物活性的主要成分是多種甾體皂苷。目前中藥重樓的研究主要集中于其抗腫瘤作用機制的研究[1,2]，鑒于其在消腫止痛與抗跌打損傷方面有良好的療效，筆者推測重樓皂苷對運動系統(tǒng)(肌肉、骨骼)損傷修復(fù)具有積極的影響，并且具有防治骨質(zhì)疏松癥的可能。因此，本研究擬通過觀察重樓皂苷對成骨樣細胞MC3T3-E1增殖作用及對β-catenin與BMP-2表達的影響，初步闡明其在運動系統(tǒng)損傷治療中的機制，并探討重樓皂苷防治骨質(zhì)疏松癥的可能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 所用重樓為秦嶺太白山野生藥材，經(jīng)鑒定為百合科(Liliaeeae) 重樓屬 (Paris) 植物Paris polyphylla Smith var yunnanensis (Franch) Hand-Mazz的干燥根莖。小鼠MC3T3-E1成骨樣細胞株 (中國科學院上海生化細胞所細胞庫)，DMEM培養(yǎng)液(美國Hyclone公司)，胎牛血清(美國Hyclone公司)，胰蛋白酶、EDTA、二甲基亞砜(DMSO)、MTT(美國Sigma公司)，EdU試劑盒 (廣州瑞博公司)，ALP試劑盒 (南京建成生物公司)，β-catenin ，BMP-2及β-actin抗體均購自美國Santa Cruz公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及藥物處理MC3T3-E1 成骨細胞 MC3T3-E1細胞置于37 ℃、5% CO2細胞孵箱，在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。重樓皂苷以DMSO配置為1 g /L的母液， 置4 ℃冰箱保存，臨用前稀釋成工作濃度。MC3T3-E1 成骨細胞分為對照組及給藥處理組(細胞增殖實驗設(shè)置3、10、30、100 μg/ml 4個濃度；其他實驗選擇30、100 μg/ml 2個濃度)。

1.3 方法

1.3.1 重樓總皂苷的制備 參考蔣雪等[3]及孫治國等[4]的方法制備。簡述如下：將重樓干燥粗粉(0.45 mm粒徑)用30% 的乙醇溶液[粗粉質(zhì)量與(浸泡)乙醇的體積比1∶15]浸泡36 h后，用頻率為59 kHz的超聲處理浸泡液，抽濾，洗滌30 min。合并濾液；藥渣再重復(fù)一次前述過程，合并濾液，棄去藥渣。減壓蒸餾濾液得粗皂苷濃縮液，并上AB-8大孔樹脂吸附柱，用水洗除雜，醇洗得純化皂苷醇溶液，減壓濃縮。濃縮液冷凍干燥，即為重樓總皂苷。

1.3.2 MTT法檢測細胞增殖率 取生長良好、處于對數(shù)增生期的MC3T3-E1細胞以2×103/孔的密度接種于96孔板內(nèi)，置于37 ℃ 、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，使細胞充分貼壁后隨機分組，每組設(shè)3個平行孔。對照組僅加入200 μl含0.54‰ DMSO的培養(yǎng)液，給藥處理組則分別加入含各種濃度的重樓皂苷培養(yǎng)液 (3、10、30、100 μg/ml) 200 μl。繼續(xù)培養(yǎng)24 h或48 h。取出培養(yǎng)板，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μl，再繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)。棄去孵育液，每孔加入150 μl DMSO，于微量振蕩儀上低速振蕩10 min，待結(jié)晶物充分溶解后，在Bio-Rad酶標儀上檢測各孔在490 nm波長處的吸光度。計算細胞增殖率：細胞增殖率(%)=(試驗組OD值-對照組OD值)/對照組OD值 × 100%。實驗重復(fù)3次。

1.3.3 EdU試劑盒檢測MC3T3-E1成骨細胞的增殖 細胞接種及給藥流程與MTT法相同 (根據(jù)MTT結(jié)果，選擇30、100 μg/ml兩個促進細胞增殖最為明顯的濃度)，待MC3T3-E1細胞與不同濃度的重樓皂苷 (30、100 μg/ml) 孵育48 h后，按照EdU試劑盒說明進行操作，使用尼康熒光顯微鏡采集圖像，image軟件進行分析。

1.3.4 堿性磷酸酶(ALP)活性測定 以2×104/孔的密度將MC3T3-E1細胞接種于24孔板內(nèi)。待細胞貼壁(12 h)后，換用含不同濃度重樓皂苷(30、100 μg/ml) 的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h或72 h。按照堿性磷酸酶試劑盒說明進行操作[5]。使用DU800型紫外分光光度計(美國Beckman公司)測定各組在520 nm處吸光度，計算ALP活力單位，同時測定每個樣品的蛋白含量，結(jié)果用U/mg蛋白表示。

1.3.5 Western blot 法測定β-catenin與BMP-2的表達 細胞培養(yǎng)48 h后，以細胞刮刮取對照組和重樓皂苷各組 (30、100 μg/ml) 的細胞，加入RIPA(含PMSF蛋白酶抑制劑，碧云天公司)細胞裂解液提取總蛋白，用Bradford 法檢測蛋白濃度。以30 μg/孔的量加入蛋白，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜。NC膜用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后，加入β-catenin(1∶200)、BMP-2(1∶500)及β-actin(1∶500) 一抗,4℃過夜。洗膜3次后加入1∶6000稀釋的相應(yīng)HRP標記二抗，室溫孵育1 h，充分洗膜后，ECL 法顯影。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件中的方差分析(ANOVA)進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 對MC3T3-E1成骨樣細胞增殖的促進效應(yīng) 與對照組相比，3、10、30、100 μg/ml的重樓皂苷作用于細胞24 h、48 h后均能促進成骨樣細胞增殖(P<0.01，表1)。加入重樓皂苷(30、100 μg/ml)24 h后，MC3T3-E1細胞的增殖率分別為(137.33±3.79)%，(149. 67±6.51)% ；48 h后，分別為(147.33±7.64)%，(153.33±4.93)%。 EdU實驗結(jié)果(圖1)也表明重樓皂苷可以有效刺激成骨樣細胞MC3T3-E1的增殖，Image J軟件掃描結(jié)果表明：與對照組相比，重樓皂苷(30、100 μg/ml)處理組的增殖率升高(36.23±3.79 )%和(48.34±4.16)% (P<0.01)。

2.2 對成骨樣細胞MC3T3-E1 ALP活性的促進效應(yīng) 重樓皂苷 (30、100 μg/ml) 作用于細胞48 h或72 h后，細胞的ALP活性均顯著升高。在48 h或72 h時，對照組細胞的ALP活性分別為：(0.22±0.05)，(0.23±0.04) U/mg蛋白。而加入重樓皂苷(30、100 μg/ml)48 h后，ALP活性分別為(0.33±0.06)，(0.40±0.02) U/mg蛋白；72 h后，分別為(0.34±0.05)，(0.48±0.06) U/mg蛋白。與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義。

2.3 對上調(diào)MC3T3-E1細胞中β-catenin和BMP-2的蛋白表達的作用 Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，重樓皂苷(30、100 μg/ml) 作用于MC3T3-E1細胞48 h后，使得細胞中β-catenin和BMP-2的表達明顯升高 (P<0.01)，呈現(xiàn)一定的濃度依賴性(圖2)。

表1 重樓皂苷對成骨樣細胞MC3T3-E1增殖的影響 (n=3;%)

注：與對照組比較,①P<0.01

圖1 EdU檢測重樓皂苷對成骨樣細胞MC3T3-E1增殖的影響(Edu熒光染色，×200)

圖2 重樓皂苷對成骨樣細胞MC3T3-E1的β-catenin與BMP-2的蛋白表達水平的影響

3 討 論

重樓為百合科植物云南重樓或七葉一枝花的干燥根莖，味苦、微寒、有小毒、歸肝經(jīng)；具有清熱解毒，消腫止痛，涼肝定驚等功效。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)本品提取物具有止血、抗炎、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛等作用[6]。重樓在消腫止痛與抗跌打損傷方面有良效，是云南白藥的主要成分之一，其主要化學成分為甾體皂苷，約占總化合物數(shù)目的80%。本研究表明：重樓皂苷通過上調(diào)β-catenin和BMP-2的蛋白表達，促進成骨樣細胞MC3T3-E1的增殖，并上調(diào)其成骨活性，提示重樓皂苷在重樓促進運動系統(tǒng)(肌肉、骨骼)損傷恢復(fù)及防治骨質(zhì)疏松中發(fā)揮了重要作用。

本研究中，MTT試驗結(jié)果顯示：重樓皂苷(3、10、30、100 μg/ml)對成骨樣細胞MC3T3-E1增殖具有明顯的促進作用，且該作用呈現(xiàn)時間、劑量依賴性關(guān)系。由于在30、100 μg/ml濃度時，重樓皂苷的促增殖作用尤為明顯，所以后續(xù)實驗均采用這兩個濃度。EdU試驗結(jié)果再次表明重樓皂苷可有效促進MC3T3-E1細胞增殖。隨后，筆者選擇ALP (ALP為成骨細胞分化時所分泌的一種酶，其活性與成骨細胞的成骨活性成正相關(guān)[5])考察重樓皂苷對MC3T3-E1成骨活性的影響，發(fā)現(xiàn)重樓皂苷顯著上調(diào)了細胞中ALP活性。成骨細胞是骨形成的主要功能細胞，負責骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化，在骨骼損傷修復(fù)以及骨質(zhì)發(fā)育中起到了關(guān)鍵作用。因此，上述結(jié)果提示：重樓皂苷促進成骨樣細胞增殖可能在重樓促進運動系統(tǒng)(肌肉、骨骼)損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。另外，成骨細胞的增殖在抗骨質(zhì)疏松中扮演了重要角色，故本實驗從分子水平對重樓皂苷促進MC3T3-E1細胞增殖的機制作進一步的探討，以期初步闡明其作用機制并為重樓在促進運動系統(tǒng)損傷恢復(fù)及防治骨質(zhì)疏松中的應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)與線索。

Wnt/β-catenin通路在骨形成與骨代謝過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。該通路中的核心分子β-catenin，可在細胞質(zhì)與細胞核間自由穿梭。當β-catenin在胞質(zhì)中積聚并穿梭進入核內(nèi)，可激活Wnt通路下游的一系列靶基因，進而發(fā)揮調(diào)控細胞生長，促進成骨細胞發(fā)育及骨形成的作用[7,8]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)能夠誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細胞分化為成骨細胞。它參與調(diào)節(jié)成骨細胞的增殖、分化和凋亡，在成骨細胞的分化過程中發(fā)揮的作用尤為重要[9]。本研究中，Western blot結(jié)果表明：重樓皂苷能夠有效地上調(diào)MC3T3-E1細胞中β-catenin和BMP-2的蛋白表達。提示：重樓皂苷可能通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin與BMP-2的通路活性促進成骨樣細胞MC3T3-E1的增殖。具體的調(diào)節(jié)機制尚需進一步觀察這兩條通路中的其他分子變化進行闡明。

綜上所述，本實驗觀察到重樓皂苷能促進成骨樣細胞MC3T3-E1的增殖，并上調(diào)其成骨活性。鑒于成骨細胞在運動系統(tǒng)損傷修復(fù)中發(fā)揮的重要作用，筆者推測重樓中的皂苷部分可能通過促進成骨細胞的增殖與活性，促進損傷修復(fù)。此外，重樓皂苷上調(diào)了β-catenin和BMP-2的蛋白表達，這兩個蛋白的增高表達在抗骨質(zhì)疏松中發(fā)揮了重要作用。雖然重樓皂苷的骨保護作用仍需進一步闡明，但本實驗結(jié)果為重樓皂苷在跌打損傷修復(fù)以及抗骨質(zhì)疏松中的應(yīng)用提供了一定實驗依據(jù)。

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(2013-08-26收稿 2013-12-15修回)

(責任編輯 梁秋野)

Effect of polyphyllins on proliferation of osteoblast-like cells MC3T3-E1 and its possible mechanisms

XU Xiaolian and LI Bo.

Department of Pharmacy, Shanxi Provincial Corps Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Xi’an 710054, China

Objective To investigate the effect of polyphyllin on the proliferation of osteoblast-like cells MC3T3-E1 and possible mechanisms. Methods The osteoblast-like cells MC3T3-E1, were administered with different concentrations of polyphyllin (3, 10, 30, and 100 μg/ml). Then, MTT colorimetric test, EdU kit, and alkaline phosphatase (ALP) activity detection kit were used to observe the proliferation of MC3T3-E1. Western blot analysis was employed to observe the expression of β-catenin and bone morphogenetic protein -2 (BMP-2) in MC3T3-E1 cells treated with 30, and 100 μg/ml of polyphyllin. Results Polyphyllin could effectively promote proliferation of MC3T3-E1 cells and upregulate the expression of β-catenin and BMP-2 expression. Conclusions Polyphyllin may promote MC3T3-E1 cell proliferation and differentiation via regulating β-catenin and BMP-2 signaling pathway.

polyphyllin; osteoblast-like cells MC3T3-E1; proliferation; bone morphogenetic protein 2; β-catenin

許曉蓮, 本科學歷，副主任藥師，E-mail: xuxiaolian1017@163.com

710054西安，武警陜西總隊醫(yī)院藥劑科

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