視網膜母細胞瘤小鼠模型的建立

伊世芹，李彥珊，苗麗霞，孫巖峰，王 軍，劉紅艷，楊新吉，劉秋玲

視網膜母細胞瘤小鼠模型的建立

伊世芹1，李彥珊2，苗麗霞2，孫巖峰2，王 軍2，劉紅艷2，楊新吉2，劉秋玲2

目的 建立視網膜母細胞瘤(retinoblastoma，RB)模型，為研究RB新療法提供實驗動物模型。方法 選取出生第1天的CD1小鼠40只，隨機分為A、B、C、D 4組，每組10只。設每組小鼠的右眼為實驗眼，左眼為對照眼，將RB-Y79細胞以4 μl/只注射至右眼玻璃體腔內，A、B、C、D組注射的RB-Y79濃度分別是2.0×107/ml、3.0×107/ml、3.5×107/ml、4.0×107/ml。4組小鼠左眼均注射等量重懸細胞的溶劑；觀察小鼠生長狀態及移植瘤生長情況，并與對照眼比較，選擇出最佳建模細胞濃度；取出的組織常規石蠟切片HE染色，觀察移植瘤組織細胞形態學特征。結果 注射RB-Y79細胞后，實驗小鼠右眼可形成腫瘤，而對照眼左眼無腫瘤形成；注射的RB-Y79細胞濃度不同，成瘤率和存活率不同，第10天A、B、C、D組的成瘤率分別為20%、80%、100%和100%，存活率分別為100%、80%、80%和50%。C組3.5×107/ml為最佳建模濃度；移植瘤組織病理檢查：右眼眼球結構被破壞。瘤細胞大小不等，形態為圓形、橢圓形、多邊形或不規則形；細胞質少；胞核大，圓形，卵圓形或不規則形，染色深，有1～2個以上核樣結構。結論 新生小鼠玻璃體腔內注射RB-Y79細胞可成功建立RB小鼠模型。

CD1新生小鼠；視網膜母細胞瘤；移植瘤模型

視網膜母細胞瘤(retinoblastoma，RB)是嬰幼兒最常見眼內原發惡性腫瘤[1]，致殘率、病死率高。我國每年新增RB病例約占全球新增病例的20%[2，3]。發達國家RB患兒的5年生存率已達90%以上[4]，但在我國RB患兒的病死率仍很高。因此，探索新的治療方法成為我國RB治療的重要研究方向。由于各種新的治療手段在進入臨床應用之前，必須先經體外實驗證實，為此，本研究選用出生第1天的新生小鼠，進行玻璃體腔內注射RB-Y9細胞，成功建立了RB移植瘤小鼠模型，為研究RB新的治療方法和新的藥物提供合適的動物模型。

1 材料與方法

1.1 材料 人RB-Y79細胞株，購自中國醫學科學院基礎醫學研究所基礎醫學細胞中心；新生CD1小鼠，飼養于北京生命科學研究所SPF級動物房。

1.2 方法

1.2.1 準備受孕母鼠 15只CD1成年母鼠，每盒3只置于5個鼠盒中，分別放入1只CD1成年雄鼠。每天早晚檢查1次母鼠陰道，觀察有無孕栓形成。將查到孕栓的母鼠從雌雄同盒中取出，單獨放于其他鼠盒，標記受孕日期。

1.2.2 受孕母鼠待產準備 根據受孕期，推算出小鼠出生日期(一般小鼠的孕期為18.5～19.5 d)。在查出孕栓后17.5 d時，將腹部膨隆的母鼠單獨放于鼠盒中，1個鼠盒放1只孕鼠，標記受孕日期，待產。

1.2.3 選取建模用新生CD1小鼠并進行分組 為保證實驗的可比性，選取同一天出生的小鼠進行建模，在本研究的15只母鼠中，同一天受孕最多的是5只，共產小鼠54只，死亡0只。在存活的54只出生第1天的新生小鼠中選取40只，隨機分為A、B、C、D 4組，每組10只，選擇每只小鼠的右眼為實驗眼，左眼為對照眼。

1.2.4 復蘇、培養RBY-79細胞 小鼠出生前2 d復蘇RBY-79細胞并傳代，使之生長狀態良好。待RBY-79細胞長到80%左右時消化細胞，計數、離心、重懸，然后接種于含10%胎牛血清、100 U/ml青鏈雙抗、15 mmol/L HEPES的RPMI1640培養液中，置于37 ℃、相對濕度95%、含5%CO2的培養箱中常規培養，當培養液顏色由紅色變為黃色時更換培養液，當細胞80%融合后即可按1∶3到1∶6傳代。收集對數生長期細胞進行實驗，用0.05%胰酶-EDTA混合消化液消化，計數、離心，用不含血清的培養液重懸細胞，調整細胞濃度分別為2.0×107/ml、3.0×107/ml、3.5×107/ml、4.0×107/ml，備用。

1.2.5 注射RB-Y9細胞建模 固定實驗小鼠于體式顯微鏡下，找到小鼠眼裂的體表痕跡，用5 μl微量注射器，抽取事先調整好濃度的RBY-79細胞懸液，于眼裂體表痕跡下1～2 mm處進針，進針2～3 mm，有針尖刺破小鼠皮膚的落空感時，即將細胞懸液緩慢推注到小鼠玻璃體腔，每只小鼠注射4 μl，注射后退針。A、B、C、D組小鼠注射的細胞濃度依次為2.0×107/ml、3.0×107/ml 、3.5×107/ml、4.0×107/ml。以同樣方法，向作為對照眼的每只實驗小鼠的左眼，注射4 μl上述細胞重懸用溶劑。

1.2.6 觀察成瘤情況 注射腫瘤細胞后，每天觀察各組小鼠生活狀態變化。于體式顯微鏡下觀察小鼠右眼移植瘤生長情況，并與左眼對照，拍照、記錄觀察結果。標記可見腫瘤形成小鼠，不同時間可見腫瘤團塊的小鼠剪掉不同的腳趾 ，以區別于未見腫瘤形成的小鼠。如遇小鼠死亡，即解剖死亡小鼠，剪開其眼瞼，觀察是否有腫瘤形成，計算小鼠成瘤率。

1.2.7 切除小鼠移植瘤 準備好小鼠解剖剪刀、鑷子，1XPBS、4% PFA，將小鼠取出鼠盒，用CO2安樂處死。置于體式顯微鏡下，用解剖鑷夾起小鼠眼瞼，沿著腫瘤邊緣將眼瞼剪開，用鑷子輕輕將小鼠的眼瞼扯下，若眼瞼和腫瘤粘連較緊密，撕扯會損壞腫瘤的完整性，此時可用解剖剪刀沿著眼瞼與腫瘤粘連的邊緣將眼瞼剪下，以保證腫瘤組織的完整性。若出血較多，即用1XPBS沖洗，清楚視野。將完整解剖出來的腫瘤組織用4% PFA固定。以同樣的方法解剖每只小鼠的左眼，同樣將解剖出來的左眼眼球用4%PFA固定。

1.2.8 確認移植瘤病理形態 觀察切除腫瘤的顏色、質地并記錄。將上述腫瘤組織及切除的左眼眼球分別做石蠟切片，切片厚5 μm。進行HE染色，普通光學顯微鏡下觀察腫瘤組織形態，明確腫瘤組織的病理學類型。

1.3 統計學處理 應用SPSS18.0統計軟件，多組樣本間率的比較采用卡方檢驗或Fisher確切概率法，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同RB細胞濃度小鼠的成瘤率及存活率 注射腫瘤細胞10 d后，C組和D組成瘤率最高，均為100%，存活率分別為80%和50%，兩組存活率比較差異有統計學意義(P<0.05，表1)。因此，C組細胞濃度3.5×107/ml, 4 μl/只是建模最佳濃度，成瘤率、存活率最高。

2.2 注射RB-Y79細胞(3.5×107/ml)的CD1小鼠移植瘤形成情況 見圖1。注射腫瘤細胞后連續2 d未見腫瘤形成，第3天可見7只小鼠右眼球較左眼球突出皮膚表面。第4天，之前未見腫瘤團塊形成的3只小鼠右眼見腫瘤團塊的形成，之前有腫瘤形成的小鼠右眼球更明顯的突出于皮膚表面；第7天，1小鼠自發死亡，解剖該小鼠，剪開眼瞼，右眼可見明顯的腫瘤組織的形成，左眼未見異常；第10天，剩余8只存活小鼠，腫瘤更加突出增大。

表1 4組不同濃度細胞培養下視網膜母細胞瘤小鼠的10 d成瘤率及存活率

注：A、B、C、D組分別表示Y79濃度是2.0×107/ml、3.0×107/ml、3.5×107/ml、4.0×107/ml；與A組比較，①P<0.05；與C組比較，②P<0.05

2.3 移植瘤組織病理形態 對照的左眼HE染色，可以見到清晰完整的眼球基本結構；右眼眼球結構破壞，被腫瘤細胞占據；腫瘤細胞大小不等，呈圓形、橢圓形、多邊形或不規則形，細胞質少，胞核大，染色深，有1～2個核樣結構體(圖2)。

圖1 注射RB-Y79(3.5×107/ml)細胞后CD1移植瘤形成過程

A. 第3天，右眼(箭頭所指，后同)；B. 第3天，左眼；C. 第5天，右眼；D. 第5天，左眼；E. 第7天，剖開眼瞼小鼠右眼；F. 第7天，剖開眼瞼小鼠左眼；G. 第10天，移植瘤更加增大，明顯突出于皮膚表面；H.第10天，剪開小鼠右眼眼瞼，腫瘤組織呈魚肉狀，腫瘤表面可見豐富的血管網，腫瘤中心部位呈向內凹陷現象，并可見輕微出血壞死(箭頭所示)；I. 完整解剖出來的腫瘤(箭頭所示)，部分移植瘤呈紅色，有明顯充血現象，部分移植瘤呈瓷白色，無明顯充血，部分移植瘤表面光滑，部分移植瘤形態很不規則。左眼眼球形狀規則，呈圓形，眼球透光度好，玻璃體內晶狀體清晰可見

圖2 注射RB-Y79(3.5×107/ml)細胞后小鼠第10天病理(HE)

3 討 論

移植性腫瘤動物模型是篩選抗腫瘤新藥中最常用的模型。1969年，丹麥Rygaard和Povsen[5]首先將人類結腸腺癌移植到裸小鼠成功，為移植性腫瘤動物模型開創了新局面。裸鼠由于先天缺乏T細胞免疫，缺少了對異種物質的排斥反應，這一特點為人源腫瘤細胞找到一個合適的活載體，所以很多對人源腫瘤的生長和轉移研究都借助于裸鼠。1977年，Gallie等[6]首先報道將新鮮RB手術切除標本制成細胞懸液后接種于裸小鼠眼前房內，結果發現絕大多數腫瘤標本能生長增殖，且能成功傳代。1995年，易先金等[7]成功建立了一株人RB裸小鼠移植瘤，共接種5例新鮮RB手術標本于裸小鼠皮下，結果僅1例獲得成功。2009年，孫瑩等[8]于成年裸鼠身上建立視網膜移植瘤模型獲得成功。與腫瘤相關的研究離不開免疫，由于缺少了T細胞免疫，裸鼠體內腫瘤的生長轉移和人體內的情況會有很大差異，對于裸鼠接種的腫瘤，瘤體可以長到接近裸鼠自身體重的程度，而裸鼠仍然可以存活很長時間，但是如果發生在人體，機體將難以承受。此外，很多基因、蛋白和藥物對于腫瘤的作用均是通過作用于免疫系統而發揮作用，而沒有T細胞免疫的裸鼠本身成為這方面研究的最大障礙，裸鼠的優點也成為了其缺點，且裸小鼠抵抗力差，飼養和繁殖要求條件比較嚴格，易患病毒性肝炎和肺炎， 受孕率低。由于以上種種原因，裸鼠建立腫瘤動物模型有很多局限性。

目前，國際上用于RB研究的動物模型主要采用反轉錄病毒法小鼠視網膜單個前體細胞內癌基因導入的轉基因RB小鼠模型，或者采用基因敲除的方法，將小鼠RB及P53或P107基因一起敲除[9-12]。這些模型的優點是更接近于人類RB的形成，但是，此模型的獲得周期長，數量受限，且價格昂貴，不適合臨床前期藥物選擇。

本研究采用RB-Y79細胞在新出生的無免疫缺陷CD1小鼠玻璃體腔建立視網膜移植瘤模型。借鑒于RB在成年裸鼠建立移植瘤所需的細胞數[6-8]，本研究設置了4組不同的細胞濃度在新生CD1小鼠玻璃體內建立移植瘤模型。根據新生小鼠眼球的解剖結構，我們確定了注射腫瘤細胞到玻璃體腔內的進針位置及深度，在注射器的針尖穿透眼瞼進入玻璃體腔時，會有一個輕微的落空感，若不慎將腫瘤細胞注入了眼眶，沒有進入玻璃體腔，在把針尖拔出后，細胞懸液隨即會從針孔溢出，表示注射失敗。

RB-Y79細胞系來源于一有母系家族史的2歲半白種女性RB患兒，是第1個培養成功的人類RB細胞株，目前在國際上應用較為廣泛[13]。新生24 h內的小鼠免疫系統尚未完善[14]，排斥反應小，適于腫瘤種植。CD1小鼠是沒有基因缺陷的正常小鼠；小鼠的產仔數量多，適于實驗要求；相對于其他品系的小鼠CD1小鼠哺乳期的母鼠不會把非親生的小鼠吃掉，更適合做代孕媽媽。RB主要發生于3歲之內的嬰幼兒，選用無免疫缺陷的新生小鼠建立腫瘤模型，其生長發育環境比成年鼠更接近腫瘤在人體內的生長環境。新生小鼠移植瘤模型的建立，可彌補裸鼠腫瘤模型的不足，更好地促進腫瘤研究的進展。

本實驗結果顯示，RB-Y79細胞在新生CD1小鼠玻璃體腔內可成功種植。最佳建模濃度是3.5×107/ml，4 μl/只，本實驗濃度梯度中該濃度成瘤率最高的同時存活率最高，接種腫瘤細胞后第3天即可見腫瘤團塊的形成，第10天成瘤率100%。HE染色結果顯示，腫瘤細胞在玻璃體內聚集成瘤，眼球結構被破壞，腫瘤生長速度較快，明顯突出于眶外。移植瘤腫瘤細胞大小不等，呈圓形、橢圓形、多邊形或不規則形，細胞質少，胞核大，染色深，有1～2個以上核樣結構體，組織細胞學特點與人類RB相符合。

基于以上實驗結果，通過玻璃體腔RB-Y79細胞接種可以建立新生小鼠RB模型，為RB治療研究提供了更佳的實驗動物模型。

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(2014-05-20收稿 2014-08-15修回)

(責任編輯 武建虎)

Development of a new retinoblastoma mouse model

YI Shiqin1, LI Yanshan2, MIAO Lixia2, SUN Yanfeng2, WANG Jun2, LIU Hongyan2, YANG Xinji2, and LIU Qiuling2.

1. Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002, China; 2. Department of Pediatrics, The General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Beijing 100039, China

Objective To establish a retinoblastoma model and provide an animal model for the new treatment of RB. Methods Forty CD1 postnatal day 1 mice were randomly divided into 4 groups ( A,B, C, D), 10 in each. We set the right eye of each mouse as experiment group and the left as control. Different density of RB-Y9 cells(A 2.0×107/ml，B 3.0×107/ml，C 3.5×107/ml，D 4.0×107/ml, 4 μl/one) were injected into the vitreous cavity of right eyes, and the left eyes were injected with the same volume of cell culture medium. We closely monitored the tumor growth after injection and found the most appropriate density of the cells for the model construction. We used HE staining to analyze the tumor formation and histology and convinced that the tumor was RB. Results After the cell injection, we found no tumor formation in control group and most mice in the experiment group had tumors. Different density of injeced cells resulted in different rates of survival and tumor formation: the rate of tumor formation in the above 4 groups were 20%,80%,100% and 100% and the survival rates were100%,80%,80% and 50%. We regarded the C group (the density of the cells was 3.5×107/ml) as the best model for the experiment. HE staining of the tumor tissues implied that the structure of right eyes were severely destroyed and the cells had different size and were irregularly shaped: some were circular, oval and others were polygonal or irregular. The tumor cells had less cytoplasm and bigger nuclei when compared with normal controls. Cells with more than 1-2 nuclei can be frequently observed. Conclusions By injecting RB-Y79 cells in the vitreous cavity of neonatal mice can successfully develop the RB mouse model.

CD1 postnatal day 1mice; retinoblastoma; transplanted tumor model

伊世芹，碩士，醫師，E-mail: yishiqin2006@163.com

1. 221002，徐州醫學院;2.100039北京，武警總醫院兒科

劉秋玲，E-mail:wj670@vip.sina.com

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