植物擴展蛋白基因及其表達調控的研究進展

趙美榮

（赤峰學院生命科學學院，內蒙古 赤峰 024000）

植物擴展蛋白基因及其表達調控的研究進展

趙美榮

（赤峰學院生命科學學院，內蒙古 赤峰 024000）

趙美榮，女，漢族，1981年12月生于山東濟寧。2004年7月畢業于山東農業大學生命科學學院生物技術專業，獲理學學士學位；2011年7月畢業于山東農業大學生命科學學院植物學專業，獲理學博士學位；2011年8月進入赤峰學院生命科學學院工作，主要承擔《植物生理學》、《植物生理學實驗》課程的教學工作，為校級植物生物學教學團隊主要成員。

作為一種細胞壁蛋白，擴展蛋白調節細胞的伸展性.許多研究表明，擴展蛋白基因表達在植物生長發育過程中起著重要作用，還與多種抗性反應有關.本文就擴展蛋白的基因家族、蛋白結構及基因表達調控等方面的研究進展作一簡單綜述.

擴展蛋白；基因表達；研究進展

細胞壁是植物細胞的結構支持物，細胞壁的松弛和不可逆伸展性是決定細胞延伸生長速率的重要因素之一.“酸生長學說”（acid-growth theory）認為生長素誘導細胞壁酸化，促進細胞壁中一些多糖水解酶（如纖維素酶）活化或增加，使連接多糖和纖維素微纖絲的鍵斷裂，引起細胞壁松弛，從而有利于細胞生長.這一學說能夠解釋細胞生長中的許多生理問題，但細胞壁的伸展不是一個簡單的機械運動，而受到細胞壁蛋白和酶的調節以及細胞壁物質的合成和降解作用的影響.直到1992年，美國賓夕法尼亞大學Daniel J. Cosgrove實驗室從黃瓜（Cucumic sativus）細胞壁中分離得到了兩種細胞壁蛋白，CsEXP1和CsEXP2，它們可以在酸性條件下誘導離體細胞壁的擴張生長，這類蛋白被命名為“擴展蛋白，expansins”（McQueen-Mason等，1992）.擴展蛋白的發現給經典的“酸生長”機制的研究帶來了新的生機.業已證明，擴展蛋白廣泛存在于雙子葉和單子葉植物中，被認為是體外唯一能使熱失活細胞壁恢復伸展的細胞壁松弛酶，是調節“酸生長”的關鍵因子.

1 擴展蛋白基因家族及蛋白結構

1.1 擴展蛋白的基因家族

序列分析表明擴展蛋白有一個龐大的基因家族.人們將與黃瓜中首次發現的CsEXP1和CsEXP2序列類似的擴展蛋白歸為α-expansin.隨后又鑒定出β-expansin，包括編碼group-I的花粉過敏源.后來α-和β-expansins家族分別被重命名為expansin A（EXPA）和expansin B（EXPB）.擬南芥和水稻全基因組的獲得又鑒定出另外兩個家族的擴展蛋白，他們的氨基酸序列分別與EXPA和EXPB類似，命名為expansin-like A（EXLA）和expansin-like B（EXLB）（Kende等，2004）.在植物界以外還發現了其他與擴展蛋白類似的基因序列，現將他們歸類于expansin-like X（EXLX）家族.目前研究發現，EXPA在大多數植物中是最大的一個擴展蛋白家族，在植物界廣泛存在，EXPB在單子葉植物中要比在其它植物種類中多，而EXLA和EXLB目前發現和研究的較少，至今為止，還沒有證據表明EXLA和EXLB基因在植物中活躍表達，其功能尚不清楚.表1列舉了幾種重要植物品種中擴展蛋白的種類和數量分布（徐筱等，2010a）.

表1 不同植物中擴展蛋白的種類和數量

系統發生分析表明，擴展蛋白基因起源于一個共同的祖先基因，EXLA亞家族首先從系統發生樹主干分離，緊接著是EXPA和EXPB的分離，EXLB亞族最后從EXPB的一個亞族起源產生（Li等，2003）.氨基酸序列比較和進化樹分析發現，擴展蛋白家族成員間總體同源性較高，進化上趨于保守.比較而言，擴展蛋白亞型間的同源性較低，如EXPA和EXPB之間的同源性大約為20-25%，而亞型內的同源性則高的多，如擬南芥中，EXPA之間的同源性介于55%-99%之間（孫涌棟等，2009）.比較不同擴展蛋白基因的序列構成，發現擴展蛋白基因結構中有四個保守的內含子，分別為1，2，3和4.這些保守的內含子幾乎定位于相同的位置和內含子間隔（圖1；Sampedro等，2005）.不同的擴展蛋白基因中內含子的種類、數量及長度有所不同，可能在進化過程中發生了添加或丟失.多數EXPA家族含有兩個內含子1和3，少數會丟失其中的一個；而EXPB、EXLA和EXLB家族具有四個全部的內含子.外顯子序列比對顯示，不同亞型擴展蛋白之間存在一段特殊的插入序列，一般位于內含子2和3之間（圖1）.例如，擬南芥中α-擴展蛋白的插入序列位于一段保守區的前端，長度14bp左右，其3'端具有保守氨基酸序列GWCN；β-擴展蛋白的插入序列在這段保守區的后面，長度7bp左右，序列變異較大；而γ-擴展蛋白中沒有這段插入序列（Li等，2002）.

圖1 擴展蛋白的基因結構

1.2 蛋白結構及作用機理

圖2 擴展蛋白氨基酸序列結構模式圖（徐筱等，2010a）

盡管擴展蛋白的蛋白結構還不完全清楚，但序列分析表明擴展蛋白是由250-270個氨基酸組成的小蛋白，具有三個結構域（圖2；徐筱等，2010a）.首先，N端有一個由22-25個氨基酸組成的信號肽區域，引導擴展蛋白定位于細胞壁.緊挨著信號肽區域，是一個由120-135個氨基酸殘基組成的結構域I，也被稱為催化區域，包含一系列的半胱氨酸殘基和HFD（His-Phe-Asp）基序，組成擴展蛋白的結構特征.C端由90-120個氨基酸殘基組成結構域II，其包含一系列保守的色氨酸殘基，這些色氨酸在空間上類似于某些細菌的纖維素結合結構，因而被稱為結合區域，可能協助擴展蛋白結合到細胞壁上.除掉信號肽之后，成熟的擴展蛋白分子量大約在25-28kD之間（Cosgrove等，2002）.

作為一種細胞壁蛋白，擴展蛋白不是結構蛋白，而是一種酶蛋白，但不具有蛋白水解酶的活性，其作用機制一般認為是擴展蛋白通過打斷細胞壁纖維素與半纖維素之間的非共價鍵，促使它們之間相互位移，從而引起細胞壁伸展. Cosgrove（2000）提出了一種關于擴展蛋白作用模式的假說（圖3），認為擴展蛋白弱化細胞壁多聚糖間的非共價鍵，導致一些聚合體滑動.擴展蛋白利用細胞壁上的機械能，催化細胞壁聚合體發生緩慢滑動.擴展蛋白的運動可能僅限于沿著纖維素微纖絲的表面進行側向擴散，這些連續的擴散能使擴展蛋白到達微纖絲的表面，使其周圍與基質的連接松弛，從而引起鏈式運動和壓力釋放.

圖3 擴展蛋白作用模式（趙美榮等，2012）

細胞壁上的纖維素微纖絲與多糖之間以及多糖分子之間相互結合.擴展蛋白可打斷多聚糖與纖維素微纖絲表面的結合(a)或多糖之間的結合(b)，在膨壓引起的機械壓力作用下，擴展蛋白促使細胞壁多聚體位移(c)，并使多聚體在結合處相互滑動(b和c比較).

2 擴展蛋白基因表達調控

2.1 發育進程的調控

在擴展蛋白龐大的基因家族中，不同成員行使各自不同的功能，其基因表達也各不相同，具有明顯的時空效應.例如，黃瓜擴展蛋白基因CsEXP1和CsEXP2在正在生長的下胚軸特異表達，在停止生長的莖基部和上胚軸不表達（Mc-Queen-Mason等，1992）.Chen和Bradford（2000）在正萌發的番茄種子中鑒定了至少三個擴展蛋白基因，其中LeEXP4的mRNA累積水平與胚乳冠的軟化程度相一致，推測擴展蛋白可能通過促進細胞壁解聚，使胚乳冠組織軟化，參與調節種子的萌發過程.鷹嘴豆中，CaEXPA2在莖中表達且與莖的伸長相關（Sánchez等，2004）.Lee等（2003）通過RNA凝膠印跡檢測了大豆根特異性表達擴展蛋白基因GmEXPl在不同生長時期根中的mRNA表達水平，結果發現該基因在種子萌發后一天的根中就有很高的表達水平，在5天苗階段的根中表達量達到最大.LeEXP1在成熟的番茄果實中大量存在，而在綠色果實中表達卻很少（Rose等，2000）.龍眼中，5個擴展蛋白基因DlEXP1-5在果實發育的不同階段，其表達模式不同（Xie等，2009）.香蕉中擴展蛋白基因MaEXPA2和MaEXPA4在果實完熟期特異性高水平表達（Asha等，2007）.荊贊革等（2009）對蘿卜擴展蛋白基因RsEXPB1進行半定量分析發現，在幼葉細胞分裂旺盛時期RsEXPB1的表達水平高于功能葉時期；在葉片生長盛期和肉質根膨大期，RsEXPB1表達水平較高；彭大后期，肉質根發育完成，RsEXPB1表達極低或不表達.綜合以上研究，不同的擴展蛋白基因在植物的不同生長階段、不同組織器官表達活性不同，且與植物的生長發育密切相關.也許正是由于擴展蛋白的這種時空表達特性使其幾乎在種子萌發、根毛的起始和延長、莖和葉的發育、果實成熟、器官脫落等植物生長發育的整個進程中發揮重要作用.

2.2 植物激素的調控

大量研究表明，植物激素作為一種信號物質，是影響擴展蛋白基因表達的一個重要因子.水稻中一系列擴展蛋白基因被赤霉素（GA）所調節（Lee和Kende，2002）.鷹嘴豆（Cicer arietinum）中，CaEXP2被油菜素內酯（BR）和生長素（IAA）嚴格調節（Sánchez等，2004）.乙烯和生長素促進了Rumex擴展蛋白基因RpEXPA1的表達，而脫落酸（ABA）和GA對RpEXPA1的表達無明顯的影響（Vreeburg等，2005）.Xue等（2009）研究發現，乙烯可以調控番茄果實中LeEXP1的表達.Park等（2010）分析了擬南芥擴展蛋白基因AtEXPA5的表達，發現其表達受BR的調控.總之，擴展蛋白基因表達受到多種植物激素的調控，然而其調控機理是復雜的，還需要進一步深入研究.

2.3 擴展蛋白啟動子調控

作為基因表達調控序列，擴展蛋白啟動子的研究越來越受到重視.Kim等（2006）研究發現，擬南芥中兩個根毛特異性表達擴展蛋白基因，AtEXP7和AtEXP18，受其啟動子中特異性順式作用元件（RHEs）的調控.水稻和大麥中根毛特異性擴展蛋白基因，OsEXPB5、HvEXPB1的啟動子中也包含RHEs序列（Won等，2010）.Karaaslan和Hrazdina（2010）在酸櫻桃（Prunus cerasus L.）中克隆了一個果實成熟特異性擴展蛋白基因PcEXP2及其啟動子，發現其啟動子中一個350bp的片段是基因表達所必須的.芥菜擴展蛋白基因Bj-EXPA1啟動子區包含植物激素響應元件、非生物脅迫響應元件以及組織特異性元件，BjEXPA1的表達受到植物激素，鹽及重金屬的調節（Sun等，2011）.因此，研究擴展蛋白啟動子及其調控機制對于更深入研究擴展蛋白的功能具有重要意義.

2.4 環境因子的調控

隨著研究的深入，越來越多的文獻表明擴展蛋白基因表達與植物抗逆性反應有關，受到多種環境脅迫因子，如干旱、高鹽、水淹、病原菌等的調控.干旱條件下水稻根尖和側根的快速生長主要是由于Os-EXP2基因的表達（Yang等，2004）.水分虧缺誘導玉米擴展蛋白基因下調表達，從而抑制玉米葉片伸展（Muller等，2007）.Sabirzhanova等（2005）斑點雜交（Dot-Blot）分析發現在聚乙二醇模擬的干旱條件下，玉米葉片中擴展蛋白基因轉錄水平提高.復蘇植物C.plantagineum葉片細胞壁在干旱條件下擴展能力明顯增高，其擴展蛋白的活性也相應地提高（Jones等，2004）.水分脅迫促進了小麥胚芽鞘擴展蛋白基因表達上調（Zhao等，2011）.徐筱等（2010b）分析了不同翦股穎草坪草品種在干旱環境下As-EXP1基因的表達，發現AsEXP1的表達與草坪草品種的抗旱性呈顯著正相關.高鹽條件下，玉米葉片擴展蛋白基因ZmEXPA1的表達上調，維持了葉片細胞的伸長生長（Veselov等，2008）.Huang等（2000）研究發現，水淹條件下OsEXP2和OsEXP4響應缺氧環境上調表達，促使水稻植株快速生長以達到水面以上.Rumex palustris的葉柄在水淹條件下的伸長與RpEXPA1表達量增加相一致（Vreeburg等，2005）.缺氧和CO2促進馬鈴薯（Sagittaria pygmaea Miq.）莖的伸長與SpEXPA1、SpEXPA2、SpEXPA3和SpEXPA4的表達上調有關（Ookawara等，2005）.Xu等（2007）分析發現，草坪草AsEXP1的表達水平與草坪草品種的耐熱性呈顯著正相關.Gao等（2009）研究發現，在4℃低溫脅迫下，柑橘果實中擴展蛋白基因CsEXP的表達增加，并且可能與柑橘果實在低溫脅迫下形成蝕損斑（Peel pitting）有關.番茄中，擴展蛋白基因LeExp1在易感病的果實中表達或被貴腐菌Botrytis cinerea誘導表達（Cantu等，2009）.Ding等（2008）研究水稻白葉枯病抗性時，發現水稻對白葉枯病菌的抗性與擴展蛋白基因EXPA1、EXPA5、EXPA10、EXPB7的相對表達水平呈負相關.

以上研究表明，擴展蛋白基因表達受到多種環境因子調控，與植物多種逆境適應性相關，這為植物抗逆機制研究提供了新的思路.然而，擴展蛋白是一個龐大的基因家族，不同的擴展蛋白作用不同，如何利用擴展蛋白基因，發揮其在植物抗逆性中的作用還有待進一步探討.

3 展望

植物擴展蛋白自發現以來受到了廣泛關注，各種植物擴展蛋白基因序列被克隆和研究.大量的資料表明，擴展蛋白的主要作用方式是疏松植物細胞壁的組分，增加細胞壁的柔韌性，從而調控植物的生長發育.擴展蛋白基因表達受到植物激素以及環境因子等多種因素的調控，這可能與其參與調節植物逆境適應性相關，這為植物抗逆分子生物學研究開辟了新的思路.然而仍有許多問題亟待解決，擴展蛋白的具體作用機制還不清楚，擴展蛋白基因時空表達模式以及對逆境的響應機制、大量未發現和新發現的擴展蛋白基因的功能，仍需要大量深入的研究.

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