一株高產(chǎn)殼聚糖酶細(xì)菌的篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化

劉杰+許晶+王能飛

摘要：殼聚糖（Chitosan）及其降解產(chǎn)物因具有優(yōu)良的物理特性和生物活性而被廣泛關(guān)注。研究通過平板透明圈初篩、搖瓶復(fù)篩方法，從青島海岸土壤中分離篩選到1株產(chǎn)殼聚糖酶活性較高的細(xì)菌K1，并對(duì)其產(chǎn)酶發(fā)酵條件進(jìn)行了單因子優(yōu)化試驗(yàn)。結(jié)果表明，經(jīng)16S rDNA序列分析，K1菌株被鑒定為Mitsuaria sp. K1（GenBank登錄號(hào)：KC489157）；最適產(chǎn)酶發(fā)酵條件為1.0%（m/V，下同）粉末殼聚糖，0.5%硝酸鉀，0.22%KH2PO4，0.1%Na2HPO4，0.15%KCl，0.05%MgSO4·7H2O，碳源∶氮源=2∶1，培養(yǎng)基初始pH 6.5，接種量3.0%（V/V），搖瓶裝液量100 mL，培養(yǎng)溫度25 ℃，培養(yǎng)時(shí)間24 h。在最適條件下，K1菌株發(fā)酵液中殼聚糖酶活最高可達(dá)到11.50 U/mL，是優(yōu)化前酶活的5.3倍，且發(fā)酵溫度較低，產(chǎn)酶周期較短，具有較高的工業(yè)發(fā)酵應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：殼聚糖酶；細(xì)菌；篩選；發(fā)酵條件；優(yōu)化

中圖分類號(hào)：TQ920.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）03-0517-05

殼聚糖[（1，4）-2-氨基-2-脫氧-β-D-葡萄糖]，是天然多糖中為數(shù)不多的含陽離子高分子聚合物[1]。因其具有高生物相容性、易成膜性、安全性、生物降解性等特征而被各行業(yè)高度重視[2]。殼聚糖的進(jìn)一步降解產(chǎn)物為一系列具有生物活性功能的低分子殼寡糖和氨基葡萄糖，具有抗菌、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抗腫瘤及促進(jìn)農(nóng)作物增產(chǎn)等功效，故在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景[3]。殼聚糖來自于其前體物質(zhì)甲殼質(zhì)[（1，4）-2-乙酰氨基-2-β-脫氧-D-葡萄糖，脫乙酰后成為殼聚糖]，在自然界中分布極為廣泛（存在于各類節(jié)肢動(dòng)物、軟體動(dòng)物、環(huán)節(jié)動(dòng)物和某些真菌中）[4]，是地球上數(shù)量僅次于纖維素的含氮有機(jī)化合物。

目前，降解殼聚糖的方法有化學(xué)法、物理法、酶解法、電化學(xué)法等[5]，其中酶解法主要是利用微生物產(chǎn)酶來制備殼寡糖。因該法具有特異性強(qiáng)、節(jié)能、環(huán)保、安全等優(yōu)勢(shì)而成為國際研究熱點(diǎn)。

自然界存在很多微生物能夠產(chǎn)生降解甲殼質(zhì)和殼聚糖的酶，然而它們的產(chǎn)酶能力卻受物種、培養(yǎng)條件等多種內(nèi)外因素的影響[6]。因此分離篩選高效產(chǎn)酶微生物并對(duì)其產(chǎn)酶條件進(jìn)行研究是酶解法降解殼聚糖的基礎(chǔ)。本研究通過平板透明圈初篩、液體發(fā)酵復(fù)篩等方法，從青島沿海岸邊蝦殼、貝殼堆積土壤和生物工程公司排污口土壤中分離篩選到一株產(chǎn)活性較高殼聚糖酶的細(xì)菌，通過單因子試驗(yàn)對(duì)該菌的產(chǎn)酶發(fā)酵條件進(jìn)行了前期探索，并對(duì)其分類地位進(jìn)行了初步的鑒定，將為后續(xù)該菌株在工業(yè)發(fā)酵上的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

土壤樣品采集自青島沿海岸邊蝦殼、貝殼堆積土壤和某生物工程公司排污口處土壤。樣品采集后保存于4 ℃冰箱備用。

1.2 菌株平板透明圈初篩

稱取0.5 g土樣于無菌水中，振蕩搖勻靜置6 h后懸液做梯度稀釋，然后涂布于初篩平板上（培養(yǎng)基A液：膠體殼聚糖1.0 g，去離子水100 mL，pH 6.2；B液：KH2PO4 0.22 g，Na2HPO4 0.1 g，KCl 0.15 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，CaCl2 0.002 g，KNO3 0.5 g，葡萄糖0.1 g，酵母膏0.1 g，瓊脂3 g，去離子水100 mL，pH 6.0；A液、B液分別于115 ℃滅菌30 min后，按體積比1∶1混合均勻倒平板），30 ℃培養(yǎng)3～5 d。挑取產(chǎn)透明圈的菌株，再接入新制初篩平板上劃線分離單菌落。挑取生長良好、透明圈明顯的單菌落，測量透明圈直徑（D）和菌落直徑（d），選取二者比值（D/d）較大者保存斜面?zhèn)溆谩?/p>

膠體殼聚糖的制備方法參考文獻(xiàn)[7]：將6 g殼聚糖粉末和400 mL 0.2 mol/L的HCl加入均質(zhì)機(jī)中，攪拌1 min至完全溶解，期間緩慢滴加2 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH至9.0，使殼聚糖完全以白色乳狀膠體析出。將殼聚糖膠體于5 000 r/min 離心沉淀15 min，去上清液，用去離子水反復(fù)沖洗沉淀至上清液pH呈中性。然后在均質(zhì)機(jī)攪拌下用0.2 mol/L的HCl溶液調(diào)pH至6.2，使殼聚糖完全溶解，補(bǔ)足去離子水至總體積為600 mL，115 ℃滅菌30 min，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 菌株搖瓶發(fā)酵復(fù)篩

將活化好的初篩菌株斜面接入LB液體培養(yǎng)基中30 ℃擴(kuò)大培養(yǎng)，然后再以5%（V/V，下同）的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基（配方：粉末殼聚糖1.0 g，KH2PO4 0.22 g，Na2HPO4 0.1 g，KCl 0.15 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，CaCl2 0.002 g，KNO3 0.5 g，去離子水100 mL，pH 6.0）中，30 ℃、160 r/min進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)。每天取發(fā)酵培養(yǎng)液2 mL經(jīng)10 000 r/min離心10 min后取上清液測定酶活性，并選擇保留高酶活菌株。

1.4 發(fā)酵液殼聚糖酶活性的測定

參照Imoto等[8]的方法并略作改動(dòng)。取發(fā)酵液2 mL，10 000 r/min離心10 min，取100 μL上清液加入到裝有0.9 mL 1%膠體殼聚糖和1 mL pH 5.6的醋酸緩沖液試管中（提前50 ℃保溫2 min），50 ℃精確保溫15 min，加入1.5 mL DNS終止反應(yīng)，沸水浴5 min顯色，冰水冷卻至室溫后用去離子水定容至25 mL，振蕩搖勻，6 000 r/min離心10 min，取上清液測520 nm下的OD值。對(duì)照組酶液先煮沸滅活，之后按照上述方法同樣處理。根據(jù)氨基葡萄糖鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線折算成還原糖量，進(jìn)而推算出酶活。1個(gè)酶活性單位定義為在50 ℃下每分鐘產(chǎn)生相當(dāng)于1 μmol氨基葡萄糖鹽酸鹽的還原糖所需要的酶量。

1.5 菌株的16S rDNA 序列測定與分析

選取上述篩選的高殼聚糖酶活性菌株，采用凍融法破裂菌體細(xì)胞， DNA提取試劑盒（康為世紀(jì)公司生產(chǎn)）提取總DNA。利用通用引物（27F： 5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′， 1492R：5′- GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3′）進(jìn)行菌株16S rDNA的PCR擴(kuò)增。50 μL PCR反應(yīng)體系包含PCR mastermix 25 μL， 正向引物27F 0.5 μL，反向引物1492R 0.5 μL，DNA模板5 μL， 去離子水 19 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序。測序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行序列比較，應(yīng)用 MEGA 5.1軟件進(jìn)行同源性分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（Neighbor-joining方法）。

1.6 菌株產(chǎn)酶發(fā)酵條件的單因子試驗(yàn)

1.6.1 不同碳源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 分別以1.0%（m/V，下同）膠體殼聚糖、1.0%粉末殼聚糖、1.0%膠體殼聚糖+0.1%葡萄糖、1.0%粉末殼聚糖+0.1%葡萄糖、1.0%葡萄糖、1.0%淀粉、1.0%蔗糖為碳源進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)（160 r/min，30 ℃），然后測定發(fā)酵上清液酶活。

1.6.2 碳源添加量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 分別以0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%粉末殼聚糖為碳源進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)（160 r/min，30 ℃），然后測定發(fā)酵上清液酶活。

1.6.3 不同氮源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 在發(fā)酵培養(yǎng)基中，以1.0%粉末殼聚糖為碳源，分別以0.5%硫酸銨、0.5%硝酸銨、0.5%氯化銨、0.5%尿素、0.5%硝酸鉀、0.5%酵母粉、0.5%蛋白胨為氮源進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)（160 r/min，30 ℃），然后測定發(fā)酵上清液酶活。

1.6.4 氮源不同添加量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 在發(fā)酵培養(yǎng)基中，以1.0%粉末殼聚糖為碳源，分別以0.3%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的硝酸鉀為氮源進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)（160 r/min，30 ℃），然后測定發(fā)酵上清液酶活。

1.6.5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 將種子菌液以5%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，置于160 r/min、30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)，分別于8、16、24、36、48、72、96、120 h取發(fā)酵上清液測定酶活。

1.6.6 培養(yǎng)溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 將種子菌液以5%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，設(shè)定搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，分別在15、20、25、30、35、40 ℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)24 h，取發(fā)酵上清液測定酶活。

1.6.7 培養(yǎng)基初始pH對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 將發(fā)酵培養(yǎng)基的pH分別調(diào)至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，接入種子菌液后，于160 r/min、25 ℃搖床發(fā)酵培養(yǎng)24 h，取上清液測定酶活。

1.6.8 接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 將種子菌液分別以1%、2%、3%、5%、7%、9%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)初始pH 6.5，160 r/min、25 ℃下發(fā)酵培養(yǎng)24 h，取上清液測定酶活。

1.6.9 搖瓶裝液量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 在500 mL三角瓶中，分別裝入50、100、150、200、250 mL的培養(yǎng)基，調(diào)pH 6.5，以3%接種量接入種子菌液，160 r/min、25 ℃下發(fā)酵培養(yǎng)24 h，取上清液測定酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 初篩與復(fù)篩結(jié)果

以膠體殼聚糖為惟一碳源，利用平板透明圈初篩與液體搖瓶復(fù)篩，從采集的土樣中篩選出3株細(xì)菌菌株（編號(hào)為K1、K5、T1）和3株真菌菌株（編號(hào)為K7、W1、T2），其透明圈直徑與菌落直徑比值、最高酶活見表1。由表1可知，3株細(xì)菌菌株K1、K5、T1的D/d比值和最高酶活均明顯高于3株真菌菌株K7、W1、T2，其中以細(xì)菌菌株K1的液體發(fā)酵酶活最高（2.17 U/mL）。但各菌株酶活與D/d比值不成正比，這可能是由于菌株自身生理活性、所產(chǎn)殼聚糖酶種類及作用在兩種檢測方法中的效果差異所致，說明平板D/d比值只可作為菌株產(chǎn)酶的初步判斷標(biāo)準(zhǔn)，而液體發(fā)酵酶活才是菌株產(chǎn)酶比較真實(shí)的反映。

2.2 篩選菌株的16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育鑒定結(jié)果

選取產(chǎn)酶活性最高的細(xì)菌菌株K1進(jìn)行了16S rDNA 序列測定（全長1 414 bp，GenBank登錄號(hào)：KC489157）和系統(tǒng)發(fā)育分析。從系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1）中可以看到，在與K1相關(guān)的8個(gè)模式菌株當(dāng)中（與K1相比序列相似性均大于97%），K1菌株與Mitsuaria chitosanitabida 3001T的序列相似性最高（為99.15%）。因此初步判定K1菌株為Mitsuaria sp.，下列試驗(yàn)均以Mitsuaria sp. K1菌株作為目標(biāo)菌。

2.3 K1菌株產(chǎn)酶發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 不同碳源及最佳碳源質(zhì)量體積比對(duì)產(chǎn)酶的影響 不同碳源對(duì)微生物的生長代謝影響很大。不同類型碳源及最佳碳源質(zhì)量體積比對(duì)K1菌株產(chǎn)酶的影響見圖2。從圖2A可知，本試驗(yàn)所采用的膠體殼聚糖、粉末殼聚糖作為碳源比較適合K1菌株產(chǎn)酶，而利用葡萄糖、淀粉、蔗糖作為碳源的產(chǎn)酶能力非常弱，說明該菌所產(chǎn)的酶為誘導(dǎo)酶。另外，膠體殼聚糖加少許葡萄糖與單獨(dú)利用粉末殼聚糖的產(chǎn)酶效果相當(dāng)（相對(duì)酶活大于94.2%），但是考慮到膠體殼聚糖制作工藝繁瑣、成本高、重復(fù)性差，因此本試驗(yàn)將粉末殼聚糖確定為最佳碳源。由圖2B可知，隨著粉末殼聚糖質(zhì)量體積比的增大，K1菌株產(chǎn)酶能力逐漸增強(qiáng)；但當(dāng)粉末殼聚糖質(zhì)量體積比超過2.0%時(shí)酶活卻開始下降。這可能是由于隨著碳源質(zhì)量體積比的增大導(dǎo)致發(fā)酵液黏稠度增加，從而影響了溶氧量及菌株代謝產(chǎn)酶。另外，粉末殼聚糖質(zhì)量體積比為1.0%和1.5%時(shí)的相對(duì)酶活分別為98.0%和99.5%，因此從成本考慮，本試驗(yàn)選擇1.0%粉末殼聚糖作為最佳碳源。

2.3.2 不同氮源及最佳氮源添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響 不同氮源及最佳氮源添加量對(duì)K1菌株產(chǎn)酶的影響見圖3。由圖3A可知，在1.0%碳源和0.5%氮源用量水平上，不同類型的氮源對(duì)K1菌株產(chǎn)酶效果影響很大，其中無機(jī)氮源的利用效果要遠(yuǎn)好于有機(jī)氮源。而在幾種無機(jī)氮源中，又以硝酸鉀的效果最佳，因此本試驗(yàn)選擇硝酸鉀為最佳氮源。從圖3B可以看出，最佳氮源添加量對(duì)K1菌株的產(chǎn)酶影響十分明顯。在1.0%碳源水平上，應(yīng)用0.5%氮源時(shí)菌株所產(chǎn)酶活性最高，氮源用量過大、過小均明顯影響菌株所產(chǎn)酶活性。因此確定2∶1為最適碳氮比。

2.3.3 培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響 由圖4A可知，在最適碳氮源條件下，K1菌株液體發(fā)酵24 h時(shí)的相對(duì)酶活達(dá)到最大值，發(fā)酵48 h的相對(duì)酶活仍能達(dá)到90.8%，但隨著發(fā)酵時(shí)間延長至120 h時(shí)，相對(duì)酶活下降至37.3%。發(fā)酵酶活隨時(shí)間變化趨勢(shì)與該菌株的生長曲線基本保持一致，即酶活最大值與生長曲線最高峰幾乎在同一時(shí)間出現(xiàn)。因此選擇24 h為該菌株的最佳發(fā)酵時(shí)間。培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)基初始pH對(duì)發(fā)酵的影響是多方面且錯(cuò)綜復(fù)雜的，主要表現(xiàn)在對(duì)微生物生長繁殖、產(chǎn)物合成積累以及發(fā)酵液物理性質(zhì)等方面的影響。從圖4B、圖4C可以看到，25 ℃左右是K1菌株比較適合產(chǎn)酶的培養(yǎng)溫度，而培養(yǎng)基的初始pH在6.5左右最合適。因此，選擇25 ℃和pH 6.5作為該菌株的最適培養(yǎng)溫度和最適培養(yǎng)基初始pH。

2.3.4 接種量和搖瓶裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響 在最適碳氮源、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH條件下，對(duì)K1菌株的接種量和搖瓶的裝液量進(jìn)行了探索。因?yàn)榫N接種量和搖瓶裝液量也是影響微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的重要因素之一。從圖5A、圖5B可以看到，接種量為3%、500 mL三角瓶裝液量為100 mL時(shí)的相對(duì)酶活均能達(dá)到最高值。接種量過大雖能縮短發(fā)酵周期，但會(huì)引起初級(jí)代謝過度，過多產(chǎn)生代謝廢物；接種量過小則會(huì)延長發(fā)酵時(shí)間，降低生產(chǎn)效率；搖瓶裝液量過大會(huì)影響發(fā)酵液的溶氧量，過小則會(huì)使發(fā)酵液蒸發(fā)變濃。

3 小結(jié)與討論

通過平板透明圈初篩、液體發(fā)酵復(fù)篩試驗(yàn)，獲得一株產(chǎn)活性較高殼聚糖酶的細(xì)菌菌株K1（16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育鑒定為Mitsuaria sp.）。對(duì)該菌株進(jìn)行的一系列單因子發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果顯示，其在最適培養(yǎng)條件下（1.0%粉末殼聚糖、0.5%硝酸鉀、0.22%KH2PO4，0.1%Na2HPO4，0.15%KCl，0.05%MgSO4·7H2O，培養(yǎng)基初始pH 6.5、培養(yǎng)溫度25 ℃、3%接種量、100 mL裝液量、培養(yǎng)時(shí)間24 h、160 r/min搖床轉(zhuǎn)速）的最高酶活達(dá)11.50 U/mL，是優(yōu)化前酶活2.17 U/mL的5.3倍。目前，國內(nèi)外學(xué)者在篩選產(chǎn)殼聚糖酶菌株及其發(fā)酵條件優(yōu)化方面已做了許多工作，但其所獲菌株的發(fā)酵液酶活及發(fā)酵周期卻差異較大。從發(fā)酵液酶活看，大多數(shù)菌株所產(chǎn)酶活性在10 U/mL以下[9-12]，少數(shù)在10～100 U/mL之間[13-16]，個(gè)別在100 U/mL以上[17-19]；從培養(yǎng)溫度和發(fā)酵周期看，絕大部分菌株在30～40 ℃、48～72 h之間；盡管黃磊等[20]篩選的P1菌株和賈艷萍等[21]篩選的C001菌株能在較短時(shí)間內(nèi)（分別為12 h和18 h）達(dá)到最高酶活，但發(fā)酵液酶活卻比較低（在10 U/mL以下）。與已有報(bào)道相比，K1菌株所產(chǎn)酶活性屬中等偏上水平，但發(fā)酵溫度較低，產(chǎn)酶周期能縮短50%左右，因此具有工業(yè)發(fā)酵應(yīng)用價(jià)值。如對(duì)其進(jìn)一步進(jìn)行適當(dāng)誘變處理，相信產(chǎn)酶能力還會(huì)有較大的提升空間。

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[15] 逢玉娟，韓寶芹，劉萬順，等.高產(chǎn)殼聚糖酶菌株的篩選和發(fā)酵產(chǎn)酶條件研究[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2005， 35（2）：287-292.

[16] 孫 菲，陳山嶺，李宜海，等.殼聚糖酶高產(chǎn)菌株的篩選、產(chǎn)酶條件的優(yōu)化及殼聚糖酶的分離純化[J].現(xiàn)代食品科技，2006， 22（3）：21-23.

[17] 孫玉英，韓寶芹，劉萬順，等.殼聚糖酶高產(chǎn)菌株的篩選和發(fā)酵條件的研究[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007，37（2）：266-272.

[18] 段 妍，韓寶芹，董 文，等.產(chǎn)殼聚糖酶菌株發(fā)酵條件優(yōu)化及殼聚糖酶的分離純化研究[J].海洋科學(xué)，2009，33（1）：1-7.

[19] CHOI Y J， KIM E J， PIAO Z， et al. Purification and characterization of chitosanase from Bacillus sp. strain KCTC-0377BP and its application for the production of chitosan oligosaccharides[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2004，70：4522-4531.

[20] 黃 磊，呂淑霞，劉可杰，等.殼聚糖酶產(chǎn)生菌Stretomycse alavuligerus sp. P1最適發(fā)酵條件研究[J].園藝與種苗，2012（5）：39-41.

[21] 賈艷萍，張?zhí)m河，韓 利.產(chǎn)殼聚糖酶菌株的發(fā)酵條件優(yōu)化[J].生物技術(shù)，2010，20（2）：62-64.

2.3.2 不同氮源及最佳氮源添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響 不同氮源及最佳氮源添加量對(duì)K1菌株產(chǎn)酶的影響見圖3。由圖3A可知，在1.0%碳源和0.5%氮源用量水平上，不同類型的氮源對(duì)K1菌株產(chǎn)酶效果影響很大，其中無機(jī)氮源的利用效果要遠(yuǎn)好于有機(jī)氮源。而在幾種無機(jī)氮源中，又以硝酸鉀的效果最佳，因此本試驗(yàn)選擇硝酸鉀為最佳氮源。從圖3B可以看出，最佳氮源添加量對(duì)K1菌株的產(chǎn)酶影響十分明顯。在1.0%碳源水平上，應(yīng)用0.5%氮源時(shí)菌株所產(chǎn)酶活性最高，氮源用量過大、過小均明顯影響菌株所產(chǎn)酶活性。因此確定2∶1為最適碳氮比。

2.3.3 培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響 由圖4A可知，在最適碳氮源條件下，K1菌株液體發(fā)酵24 h時(shí)的相對(duì)酶活達(dá)到最大值，發(fā)酵48 h的相對(duì)酶活仍能達(dá)到90.8%，但隨著發(fā)酵時(shí)間延長至120 h時(shí)，相對(duì)酶活下降至37.3%。發(fā)酵酶活隨時(shí)間變化趨勢(shì)與該菌株的生長曲線基本保持一致，即酶活最大值與生長曲線最高峰幾乎在同一時(shí)間出現(xiàn)。因此選擇24 h為該菌株的最佳發(fā)酵時(shí)間。培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)基初始pH對(duì)發(fā)酵的影響是多方面且錯(cuò)綜復(fù)雜的，主要表現(xiàn)在對(duì)微生物生長繁殖、產(chǎn)物合成積累以及發(fā)酵液物理性質(zhì)等方面的影響。從圖4B、圖4C可以看到，25 ℃左右是K1菌株比較適合產(chǎn)酶的培養(yǎng)溫度，而培養(yǎng)基的初始pH在6.5左右最合適。因此，選擇25 ℃和pH 6.5作為該菌株的最適培養(yǎng)溫度和最適培養(yǎng)基初始pH。

2.3.4 接種量和搖瓶裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響 在最適碳氮源、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH條件下，對(duì)K1菌株的接種量和搖瓶的裝液量進(jìn)行了探索。因?yàn)榫N接種量和搖瓶裝液量也是影響微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的重要因素之一。從圖5A、圖5B可以看到，接種量為3%、500 mL三角瓶裝液量為100 mL時(shí)的相對(duì)酶活均能達(dá)到最高值。接種量過大雖能縮短發(fā)酵周期，但會(huì)引起初級(jí)代謝過度，過多產(chǎn)生代謝廢物；接種量過小則會(huì)延長發(fā)酵時(shí)間，降低生產(chǎn)效率；搖瓶裝液量過大會(huì)影響發(fā)酵液的溶氧量，過小則會(huì)使發(fā)酵液蒸發(fā)變濃。

3 小結(jié)與討論

通過平板透明圈初篩、液體發(fā)酵復(fù)篩試驗(yàn)，獲得一株產(chǎn)活性較高殼聚糖酶的細(xì)菌菌株K1（16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育鑒定為Mitsuaria sp.）。對(duì)該菌株進(jìn)行的一系列單因子發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果顯示，其在最適培養(yǎng)條件下（1.0%粉末殼聚糖、0.5%硝酸鉀、0.22%KH2PO4，0.1%Na2HPO4，0.15%KCl，0.05%MgSO4·7H2O，培養(yǎng)基初始pH 6.5、培養(yǎng)溫度25 ℃、3%接種量、100 mL裝液量、培養(yǎng)時(shí)間24 h、160 r/min搖床轉(zhuǎn)速）的最高酶活達(dá)11.50 U/mL，是優(yōu)化前酶活2.17 U/mL的5.3倍。目前，國內(nèi)外學(xué)者在篩選產(chǎn)殼聚糖酶菌株及其發(fā)酵條件優(yōu)化方面已做了許多工作，但其所獲菌株的發(fā)酵液酶活及發(fā)酵周期卻差異較大。從發(fā)酵液酶活看，大多數(shù)菌株所產(chǎn)酶活性在10 U/mL以下[9-12]，少數(shù)在10～100 U/mL之間[13-16]，個(gè)別在100 U/mL以上[17-19]；從培養(yǎng)溫度和發(fā)酵周期看，絕大部分菌株在30～40 ℃、48～72 h之間；盡管黃磊等[20]篩選的P1菌株和賈艷萍等[21]篩選的C001菌株能在較短時(shí)間內(nèi)（分別為12 h和18 h）達(dá)到最高酶活，但發(fā)酵液酶活卻比較低（在10 U/mL以下）。與已有報(bào)道相比，K1菌株所產(chǎn)酶活性屬中等偏上水平，但發(fā)酵溫度較低，產(chǎn)酶周期能縮短50%左右，因此具有工業(yè)發(fā)酵應(yīng)用價(jià)值。如對(duì)其進(jìn)一步進(jìn)行適當(dāng)誘變處理，相信產(chǎn)酶能力還會(huì)有較大的提升空間。

參考文獻(xiàn)：

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[3] 占今舜，胡金杰，林彬彬，等.殼寡糖的生物學(xué)功能及其在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].中國飼料，2012（4）：33-36.

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[10] 葉淑紅，孫 浩，陳 麗，等.產(chǎn)殼聚糖酶菌株的篩選及殼寡糖性質(zhì)的研究[J].食品研究與開發(fā)，2007，28（1）：23-26.

[11] 魏福衛(wèi)，蔣霞云，陳舜勝，等.殼聚糖酶高產(chǎn)菌的篩選、鑒定與發(fā)酵產(chǎn)酶初探[J].上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，20（2）：296-302.

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[13] 李劍鋒，劉必謙，洪松柏，等.高產(chǎn)殼聚糖酶菌株的篩選及其產(chǎn)酶條件的優(yōu)化[J].水生態(tài)學(xué)雜志，2010，3（3）：127-131.

[14] 涂紹勇，楊愛華，吳柏春，等.產(chǎn)殼聚糖酶菌株的篩選及其發(fā)酵產(chǎn)酶條件的研究[J].化學(xué)與生物工程，2009，26（9）：52-55.

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[16] 孫 菲，陳山嶺，李宜海，等.殼聚糖酶高產(chǎn)菌株的篩選、產(chǎn)酶條件的優(yōu)化及殼聚糖酶的分離純化[J].現(xiàn)代食品科技，2006， 22（3）：21-23.

[17] 孫玉英，韓寶芹，劉萬順，等.殼聚糖酶高產(chǎn)菌株的篩選和發(fā)酵條件的研究[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007，37（2）：266-272.

[18] 段 妍，韓寶芹，董 文，等.產(chǎn)殼聚糖酶菌株發(fā)酵條件優(yōu)化及殼聚糖酶的分離純化研究[J].海洋科學(xué)，2009，33（1）：1-7.

[19] CHOI Y J， KIM E J， PIAO Z， et al. Purification and characterization of chitosanase from Bacillus sp. strain KCTC-0377BP and its application for the production of chitosan oligosaccharides[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2004，70：4522-4531.

[20] 黃 磊，呂淑霞，劉可杰，等.殼聚糖酶產(chǎn)生菌Stretomycse alavuligerus sp. P1最適發(fā)酵條件研究[J].園藝與種苗，2012（5）：39-41.

[21] 賈艷萍，張?zhí)m河，韓 利.產(chǎn)殼聚糖酶菌株的發(fā)酵條件優(yōu)化[J].生物技術(shù)，2010，20（2）：62-64.

2.3.2 不同氮源及最佳氮源添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響 不同氮源及最佳氮源添加量對(duì)K1菌株產(chǎn)酶的影響見圖3。由圖3A可知，在1.0%碳源和0.5%氮源用量水平上，不同類型的氮源對(duì)K1菌株產(chǎn)酶效果影響很大，其中無機(jī)氮源的利用效果要遠(yuǎn)好于有機(jī)氮源。而在幾種無機(jī)氮源中，又以硝酸鉀的效果最佳，因此本試驗(yàn)選擇硝酸鉀為最佳氮源。從圖3B可以看出，最佳氮源添加量對(duì)K1菌株的產(chǎn)酶影響十分明顯。在1.0%碳源水平上，應(yīng)用0.5%氮源時(shí)菌株所產(chǎn)酶活性最高，氮源用量過大、過小均明顯影響菌株所產(chǎn)酶活性。因此確定2∶1為最適碳氮比。

2.3.3 培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響 由圖4A可知，在最適碳氮源條件下，K1菌株液體發(fā)酵24 h時(shí)的相對(duì)酶活達(dá)到最大值，發(fā)酵48 h的相對(duì)酶活仍能達(dá)到90.8%，但隨著發(fā)酵時(shí)間延長至120 h時(shí)，相對(duì)酶活下降至37.3%。發(fā)酵酶活隨時(shí)間變化趨勢(shì)與該菌株的生長曲線基本保持一致，即酶活最大值與生長曲線最高峰幾乎在同一時(shí)間出現(xiàn)。因此選擇24 h為該菌株的最佳發(fā)酵時(shí)間。培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)基初始pH對(duì)發(fā)酵的影響是多方面且錯(cuò)綜復(fù)雜的，主要表現(xiàn)在對(duì)微生物生長繁殖、產(chǎn)物合成積累以及發(fā)酵液物理性質(zhì)等方面的影響。從圖4B、圖4C可以看到，25 ℃左右是K1菌株比較適合產(chǎn)酶的培養(yǎng)溫度，而培養(yǎng)基的初始pH在6.5左右最合適。因此，選擇25 ℃和pH 6.5作為該菌株的最適培養(yǎng)溫度和最適培養(yǎng)基初始pH。

2.3.4 接種量和搖瓶裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響 在最適碳氮源、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH條件下，對(duì)K1菌株的接種量和搖瓶的裝液量進(jìn)行了探索。因?yàn)榫N接種量和搖瓶裝液量也是影響微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的重要因素之一。從圖5A、圖5B可以看到，接種量為3%、500 mL三角瓶裝液量為100 mL時(shí)的相對(duì)酶活均能達(dá)到最高值。接種量過大雖能縮短發(fā)酵周期，但會(huì)引起初級(jí)代謝過度，過多產(chǎn)生代謝廢物；接種量過小則會(huì)延長發(fā)酵時(shí)間，降低生產(chǎn)效率；搖瓶裝液量過大會(huì)影響發(fā)酵液的溶氧量，過小則會(huì)使發(fā)酵液蒸發(fā)變濃。

3 小結(jié)與討論

通過平板透明圈初篩、液體發(fā)酵復(fù)篩試驗(yàn)，獲得一株產(chǎn)活性較高殼聚糖酶的細(xì)菌菌株K1（16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育鑒定為Mitsuaria sp.）。對(duì)該菌株進(jìn)行的一系列單因子發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果顯示，其在最適培養(yǎng)條件下（1.0%粉末殼聚糖、0.5%硝酸鉀、0.22%KH2PO4，0.1%Na2HPO4，0.15%KCl，0.05%MgSO4·7H2O，培養(yǎng)基初始pH 6.5、培養(yǎng)溫度25 ℃、3%接種量、100 mL裝液量、培養(yǎng)時(shí)間24 h、160 r/min搖床轉(zhuǎn)速）的最高酶活達(dá)11.50 U/mL，是優(yōu)化前酶活2.17 U/mL的5.3倍。目前，國內(nèi)外學(xué)者在篩選產(chǎn)殼聚糖酶菌株及其發(fā)酵條件優(yōu)化方面已做了許多工作，但其所獲菌株的發(fā)酵液酶活及發(fā)酵周期卻差異較大。從發(fā)酵液酶活看，大多數(shù)菌株所產(chǎn)酶活性在10 U/mL以下[9-12]，少數(shù)在10～100 U/mL之間[13-16]，個(gè)別在100 U/mL以上[17-19]；從培養(yǎng)溫度和發(fā)酵周期看，絕大部分菌株在30～40 ℃、48～72 h之間；盡管黃磊等[20]篩選的P1菌株和賈艷萍等[21]篩選的C001菌株能在較短時(shí)間內(nèi)（分別為12 h和18 h）達(dá)到最高酶活，但發(fā)酵液酶活卻比較低（在10 U/mL以下）。與已有報(bào)道相比，K1菌株所產(chǎn)酶活性屬中等偏上水平，但發(fā)酵溫度較低，產(chǎn)酶周期能縮短50%左右，因此具有工業(yè)發(fā)酵應(yīng)用價(jià)值。如對(duì)其進(jìn)一步進(jìn)行適當(dāng)誘變處理，相信產(chǎn)酶能力還會(huì)有較大的提升空間。

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[4] 蔣挺大.甲殼素[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003.

[5] 鄧培昌，胡杰珍，侯慶華，等.殼寡糖制備方法研究進(jìn)展[J].廣州化工，2012，40（6）：22-24.

[6] 顏方貴.發(fā)酵微生物學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1993.

[7] IZUME M， NAGAE S， KAWAGISHI H. Action pattern of Bacillus sp. No. 7-M chitosanase on partially N-acetylated chitosan[J]. Biosci Biotech Biochem，1992，56（3）：448-453.

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[11] 魏福衛(wèi)，蔣霞云，陳舜勝，等.殼聚糖酶高產(chǎn)菌的篩選、鑒定與發(fā)酵產(chǎn)酶初探[J].上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，20（2）：296-302.

[12] 李群良，李啟虔.產(chǎn)殼聚糖酶微生物的篩選及產(chǎn)酶條件的優(yōu)化[J].中國生物制品學(xué)雜志，2011，24（1）：108-111.

[13] 李劍鋒，劉必謙，洪松柏，等.高產(chǎn)殼聚糖酶菌株的篩選及其產(chǎn)酶條件的優(yōu)化[J].水生態(tài)學(xué)雜志，2010，3（3）：127-131.

[14] 涂紹勇，楊愛華，吳柏春，等.產(chǎn)殼聚糖酶菌株的篩選及其發(fā)酵產(chǎn)酶條件的研究[J].化學(xué)與生物工程，2009，26（9）：52-55.

[15] 逢玉娟，韓寶芹，劉萬順，等.高產(chǎn)殼聚糖酶菌株的篩選和發(fā)酵產(chǎn)酶條件研究[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2005， 35（2）：287-292.

[16] 孫 菲，陳山嶺，李宜海，等.殼聚糖酶高產(chǎn)菌株的篩選、產(chǎn)酶條件的優(yōu)化及殼聚糖酶的分離純化[J].現(xiàn)代食品科技，2006， 22（3）：21-23.

[17] 孫玉英，韓寶芹，劉萬順，等.殼聚糖酶高產(chǎn)菌株的篩選和發(fā)酵條件的研究[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007，37（2）：266-272.

[18] 段 妍，韓寶芹，董 文，等.產(chǎn)殼聚糖酶菌株發(fā)酵條件優(yōu)化及殼聚糖酶的分離純化研究[J].海洋科學(xué)，2009，33（1）：1-7.

[19] CHOI Y J， KIM E J， PIAO Z， et al. Purification and characterization of chitosanase from Bacillus sp. strain KCTC-0377BP and its application for the production of chitosan oligosaccharides[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2004，70：4522-4531.

[20] 黃 磊，呂淑霞，劉可杰，等.殼聚糖酶產(chǎn)生菌Stretomycse alavuligerus sp. P1最適發(fā)酵條件研究[J].園藝與種苗，2012（5）：39-41.

[21] 賈艷萍，張?zhí)m河，韓 利.產(chǎn)殼聚糖酶菌株的發(fā)酵條件優(yōu)化[J].生物技術(shù)，2010，20（2）：62-64.