蓮藕愈傷組織誘導及組織學觀察

李佳+趙文龍+周長艷+王震宇

摘要：以蓮藕（Nelumba nucifera）的頂芽和側芽為外植體，接種于不同外源激素配比的MS培養基上進行愈傷組織誘導。結果表明，愈傷組織誘導的最佳培養基為MS基本培養基+0.5 mg/L 6-BA+4.0 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L NAA+0.20% Gelrite，誘導率在20%以上，且愈傷組織狀態良好，顏色淡黃色至黃褐色，生長量較大。其中，2，4-D在蓮藕愈傷組織誘導中起重要作用。從組織學切片的顯微觀察結果分析，單寧類物質可能是導致蓮藕愈傷組織誘導過程中極易褐化的重要因素之一。以Gelrite代替瓊脂粉作為固化劑，可明顯改善外植體的褐化現象。

關鍵詞：蓮藕（Nelumba nucifera）；愈傷組織；單寧；褐化

中圖分類號：S645.1；Q813.1+2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）03-0701-03

蓮藕（Nelumba nucifera）為睡蓮科（Nymphaeaceae）蓮屬（Nelumbo）多年生大型水生草本植物，是雙子葉植物的較低級種，原產于中國和印度，在中國栽培歷史悠久[1]。在自然選擇和人工選擇中，產生很多變異，因而種質資源豐富。蓮藕營養豐富，含淀粉、蛋白質、糖、維生素等多種營養成分，營養價值較高[2]。然而，由于蓮藕主要以塊莖進行無性繁殖，多年反復栽培后，種質容易退化。此外，以常規方法進行蓮藕的繁育，繁殖率低、用種量大、生產成本較高，且病毒病、褐斑病、腐敗病等病害易發生，給蓮藕的制種和品質改良帶來了的困難，使其產量和質量受到影響[3]。利用組織培養技術進行蓮藕的培養可提高其無性繁殖率，并保持良好的遺傳穩定性[4]。本試驗以蓮藕頂芽及側芽為材料進行愈傷組織誘導，并對其發生過程進行了組織學觀察，對愈傷組織的發生機理進行了初步研究，為蓮藕的種質保存及品種改良奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試蓮藕品種為鄂蓮五號“3735”（品種號），由湖北省武漢市東西湖區吳家山西湖大隊提供。于2010年3至4月栽種期取藕頭飽滿、頂芽完整的種藕為試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 愈傷組織誘導

1）材料處理。選取蓮藕頂芽與側芽，將其外部葉片剝去，在自來水下沖洗干凈，然后在無菌條件下用75%的乙醇消毒30 s，隨即放入0.1%升汞溶液中處理15 min，用無菌水漂洗4次，橫切成0.3 ～ 0.5 cm3的外植體，接種到培養基上進行培養。

2）愈傷組織誘導培養基。以MS為基本培養基，pH調至5.8～6.0，蔗糖3%，添加不同濃度水平的6-BA、NAA、2，4-D、瓊脂粉或Gelrite、活性炭，組成愈傷組織誘導培養基，以這5個因素，每因素4個水平進行L16（45）正交試驗，試驗因素和水平見表1。

3）培養條件。溫度為（25±2） ℃，避光培養。

1.2.2 愈傷組織發生過程的組織學觀察 接種后，每隔10 d取具有代表性的樣品組織塊，FAA固定液固定24 h，70%乙醇∶冰醋酸為3∶1（V/V）的溶液中保存。材料收集齊后，用70%乙醇將酸洗凈，經乙醇/二甲苯系列脫水后，石蠟包埋，石蠟切片機切片，厚度10 μm，切片脫蠟復水后采用蘇木精染色法染色，乙醇系列脫水后二甲苯透明，中性樹膠永久封片[5]。采用光學顯微鏡鏡檢拍照。

2 結果與分析

2.1 不同培養基配比對蓮藕愈傷組織誘導的影響

將蓮藕頂芽和側芽橫切成0.3～0.5 cm3的外植體，按照表1所示的正交試驗，接種在不同濃度配比的愈傷組織培養基中誘導，10 d左右可見外植體組織膨大，30 d左右開始形成愈傷組織（圖1），50 d左右大量愈傷組織形成，此時若不及時更換培養基，組織則極易褐化死亡。將50 d時愈傷組織的誘導情況進行統計分析，結果如表2所示。結果表明，不同成分配比的培養基對蓮藕莖尖的愈傷組織誘導有較大的影響。

正交試驗結果（表2）表明，從愈傷組織誘導率的結果來看，13號試驗的效果最好，達到36.67%，其次為7號試驗，結果為33.33%。通過比較極差R值的大小，對愈傷組織誘導率的影響由大到小的因素為2，4-D、固化劑、6-BA、活性炭、NAA。表明2，4-D的濃度水平的變化對蓮藕愈傷組織的誘導起主導作用，其極差可達25.000；且隨著2，4-D濃度的增加，愈傷組織誘導率也明顯增加。其次為固化劑的影響，添加Gelrite比添加瓊脂粉對愈傷組織的誘導更有利，然而并不是濃度越高效果越好，其最佳濃度為0.2%。6-BA的添加也對愈傷組織的誘導起到明顯作用，其R值為8.335。活性炭和NAA對愈傷組織誘導率的影響不大，其極差分別為7.500和5.829。

愈傷組織誘導50 d左右的情況見表2。當2，4-D濃度增高時，雖然愈傷組織誘導率明顯增加，但形態上逐漸出現大量結節狀愈傷，此類愈傷組織很難分化成苗，因此，選擇2.0或4.0 mg/L的2，4-D對于愈傷組織的誘導更為有利。此外，若2，4-D濃度較高并同時添加較高濃度6-BA時，則伴有少量硬塊出現，所以6-BA的濃度也不宜過高。NAA對愈傷組織誘導率的影響不大，然而添加一定量的NAA有助于愈傷組織的誘導，當添加較低濃度的NAA時，愈傷組織的生長量有所增加，顏色由淡黃色變為黃色。固化劑對愈傷組織的誘導同樣有較大的影響。當以瓊脂粉為固化劑時，愈傷組織普遍呈現暗黃色，易褐化，生長量也較少；若同時添加活性炭，褐化現象有所改善；當以Gelrite為固化劑時，愈傷組織顏色變淺，褐化現象明顯減少，生長量也普遍增加。

綜合愈傷組織誘導率和誘導狀態的結果分析，得到誘導蓮藕愈傷組織的最佳培養基配方為：MS基本培養基+0.5 mg/L 6-BA+4.0 mg/L 2，4-D+ 0.1 mg/L NAA+0.20% Gelrite。采用該培養基配方進行驗證試驗，愈傷組織誘導情況較為理想，誘導率普遍在20%以上，且愈傷組織狀態良好，顏色為淡黃色至黃褐色，生長量較大。

2.2 蓮藕愈傷組織誘導過程的組織學觀察

采用正交試驗得到的最佳培養基配方誘導蓮藕愈傷組織，外植體接種后，每隔10 d取樣1次，制片拍照，結果見圖2。培養10 d左右，可見細胞核染色加深，核質比增大，細胞開始活躍分裂（圖2a）；培養30 d左右，細胞內容物染色加深，細胞質濃厚，細胞分裂旺盛，愈傷組織形成，并出現少量單寧細胞（圖2b）；培養50 d左右，可見大量細碎的染色較深的細胞，內部出現大量無規則的維管束（圖2c），此時應及時轉入新鮮培養基，若不及時轉接，繼續培養到60 d，則結構變得疏松，且出現大量染色很深的單寧細胞（圖2d），此時，愈傷組織極易褐化死亡。

3 討論

在蓮藕組織培養過程中，污染比較嚴重，可能是蓮藕本身存在很多空隙，其中的微生物在消毒滅菌過程中不容易被消滅，因此造成組織培養過程中較為嚴重的污染情況。可以采取一定的方法減少類似情況發生，比如取材要新鮮，切取頂芽或側芽時盡量不要損傷芽體，以免暴露內部的空隙。

此外，褐化問題一直是蓮藕組織培養過程中普遍存在的現象。分析原因，與蓮藕中多酚氧化酶（PPO）活性較高有關[6，7]。切取的外植體在接觸氧氣后，切口處多酚類物質在PPO的作用下，氧化成醌，導致蓮藕褐化，積累較多時，對外植體產生毒害[8]。從組織切片觀察結果看，單寧類物質隨著培養的時間加長而增加，而單寧是多酚高聚化合物。朱玉球等[9]在研究山核桃愈傷組織誘導過程中發現隨著單寧物質含量的減少，愈傷組織形成部位向切口上移，說明單寧的存在可抑制愈傷組織的發生，本試驗結果顯示，培養時間越長，單寧含量越高，組織越容易褐化，愈傷組織的產生越少，因此分析單寧是導致蓮藕極易褐化的主要原因之一。本試驗中采取了多種方法抑制蓮藕外植體的褐化。其中比較有效的方法包括及時繼代，減少培養時間，可一定程度上減緩單寧物質的影響；另外，在培養基中添加一定量的活性炭，可吸附部分醌類，有效控制褐化現象，然而活性炭同時也吸附了其他的營養物質，對愈傷組織的生長和增殖有一定影響。因此，在培養初期采用活性炭，到后期組織情況穩定后，可不必再添加；此外，采用Gelrite替代瓊脂作為固化劑可明顯改善褐化情況，分析原因，可能是由于Gelrite成分更為純凈，在固化效果相同的情況下，用量少，一般僅為瓊脂用量的1/3，甚至更少。因此，Gelrite固化劑滲透性強，使產生的醌更快擴散。

此外，蓮藕的愈傷組織誘導率較低，一般最高僅為30%左右，相應的類似報道也不多見，刁英等[10]報道的蓮藕愈傷誘導結果表明，最佳培養基為MS基本培養基+0.5 mg/L 6-BA+5.0 mg/L 2，4-D，最高誘導率可達32%，誘導率同樣較低。因此，要達到實際生產的要求，還需要進一步研究更加適合的培養方案。

參看文獻：

[1] 中國科學院植物研究所.中國高等植物圖鑒（第一冊）[M].北京：科學出版社，1994.646.

[2] 張建福，王 鋒.蓮藕的組織培養現狀與展望[J].上海農業科技，2000（4）：10.

[3] 陳麗萍，周可明，張志友.蓮藕組織培養研究進展[J].現代農業科技，2008（20）：15-16.

[4] 刁 英，韓延闖，何建軍，等.蓮藕研究進展[J].氨基酸和生物資源，2004，26（1）：8-11.

[5] 李正理.植物制片技術[M].北京：科學出版社，1987.40.

[6] 崔堂兵，郭 勇，張長遠.植物組織培養中褐變現象的產生機理及克服方法[J].廣東農業科學，2001（3）：16-18.

[7] 陳桂芳，婁利華.植物組織培養中幾個常見的技術問題[J].重慶林業科技，2003（4）：50-51.

[8] 何士敏，秦家順，李 鵬.蓮藕多酚氧化酶的催化特性檢測[J].西南農業學報，2011，24（1）：75-79.

[9] 朱玉球，廖望儀，黃堅欽，等.山核桃愈傷組織誘導的初步研究[J].浙江林學院學報，2001，18（2）：115-118.

[10] 刁 英，吳金平，趙玲玲，等.蓮胚性愈傷組織誘導研究初報[J].湖北農業科學，2011，50（14）：2991-2992.

2.2 蓮藕愈傷組織誘導過程的組織學觀察

采用正交試驗得到的最佳培養基配方誘導蓮藕愈傷組織，外植體接種后，每隔10 d取樣1次，制片拍照，結果見圖2。培養10 d左右，可見細胞核染色加深，核質比增大，細胞開始活躍分裂（圖2a）；培養30 d左右，細胞內容物染色加深，細胞質濃厚，細胞分裂旺盛，愈傷組織形成，并出現少量單寧細胞（圖2b）；培養50 d左右，可見大量細碎的染色較深的細胞，內部出現大量無規則的維管束（圖2c），此時應及時轉入新鮮培養基，若不及時轉接，繼續培養到60 d，則結構變得疏松，且出現大量染色很深的單寧細胞（圖2d），此時，愈傷組織極易褐化死亡。

3 討論

在蓮藕組織培養過程中，污染比較嚴重，可能是蓮藕本身存在很多空隙，其中的微生物在消毒滅菌過程中不容易被消滅，因此造成組織培養過程中較為嚴重的污染情況。可以采取一定的方法減少類似情況發生，比如取材要新鮮，切取頂芽或側芽時盡量不要損傷芽體，以免暴露內部的空隙。

此外，褐化問題一直是蓮藕組織培養過程中普遍存在的現象。分析原因，與蓮藕中多酚氧化酶（PPO）活性較高有關[6，7]。切取的外植體在接觸氧氣后，切口處多酚類物質在PPO的作用下，氧化成醌，導致蓮藕褐化，積累較多時，對外植體產生毒害[8]。從組織切片觀察結果看，單寧類物質隨著培養的時間加長而增加，而單寧是多酚高聚化合物。朱玉球等[9]在研究山核桃愈傷組織誘導過程中發現隨著單寧物質含量的減少，愈傷組織形成部位向切口上移，說明單寧的存在可抑制愈傷組織的發生，本試驗結果顯示，培養時間越長，單寧含量越高，組織越容易褐化，愈傷組織的產生越少，因此分析單寧是導致蓮藕極易褐化的主要原因之一。本試驗中采取了多種方法抑制蓮藕外植體的褐化。其中比較有效的方法包括及時繼代，減少培養時間，可一定程度上減緩單寧物質的影響；另外，在培養基中添加一定量的活性炭，可吸附部分醌類，有效控制褐化現象，然而活性炭同時也吸附了其他的營養物質，對愈傷組織的生長和增殖有一定影響。因此，在培養初期采用活性炭，到后期組織情況穩定后，可不必再添加；此外，采用Gelrite替代瓊脂作為固化劑可明顯改善褐化情況，分析原因，可能是由于Gelrite成分更為純凈，在固化效果相同的情況下，用量少，一般僅為瓊脂用量的1/3，甚至更少。因此，Gelrite固化劑滲透性強，使產生的醌更快擴散。

此外，蓮藕的愈傷組織誘導率較低，一般最高僅為30%左右，相應的類似報道也不多見，刁英等[10]報道的蓮藕愈傷誘導結果表明，最佳培養基為MS基本培養基+0.5 mg/L 6-BA+5.0 mg/L 2，4-D，最高誘導率可達32%，誘導率同樣較低。因此，要達到實際生產的要求，還需要進一步研究更加適合的培養方案。

參看文獻：

[1] 中國科學院植物研究所.中國高等植物圖鑒（第一冊）[M].北京：科學出版社，1994.646.

[2] 張建福，王 鋒.蓮藕的組織培養現狀與展望[J].上海農業科技，2000（4）：10.

[3] 陳麗萍，周可明，張志友.蓮藕組織培養研究進展[J].現代農業科技，2008（20）：15-16.

[4] 刁 英，韓延闖，何建軍，等.蓮藕研究進展[J].氨基酸和生物資源，2004，26（1）：8-11.

[5] 李正理.植物制片技術[M].北京：科學出版社，1987.40.

[6] 崔堂兵，郭 勇，張長遠.植物組織培養中褐變現象的產生機理及克服方法[J].廣東農業科學，2001（3）：16-18.

[7] 陳桂芳，婁利華.植物組織培養中幾個常見的技術問題[J].重慶林業科技，2003（4）：50-51.

[8] 何士敏，秦家順，李 鵬.蓮藕多酚氧化酶的催化特性檢測[J].西南農業學報，2011，24（1）：75-79.

[9] 朱玉球，廖望儀，黃堅欽，等.山核桃愈傷組織誘導的初步研究[J].浙江林學院學報，2001，18（2）：115-118.

[10] 刁 英，吳金平，趙玲玲，等.蓮胚性愈傷組織誘導研究初報[J].湖北農業科學，2011，50（14）：2991-2992.

2.2 蓮藕愈傷組織誘導過程的組織學觀察

采用正交試驗得到的最佳培養基配方誘導蓮藕愈傷組織，外植體接種后，每隔10 d取樣1次，制片拍照，結果見圖2。培養10 d左右，可見細胞核染色加深，核質比增大，細胞開始活躍分裂（圖2a）；培養30 d左右，細胞內容物染色加深，細胞質濃厚，細胞分裂旺盛，愈傷組織形成，并出現少量單寧細胞（圖2b）；培養50 d左右，可見大量細碎的染色較深的細胞，內部出現大量無規則的維管束（圖2c），此時應及時轉入新鮮培養基，若不及時轉接，繼續培養到60 d，則結構變得疏松，且出現大量染色很深的單寧細胞（圖2d），此時，愈傷組織極易褐化死亡。

3 討論

在蓮藕組織培養過程中，污染比較嚴重，可能是蓮藕本身存在很多空隙，其中的微生物在消毒滅菌過程中不容易被消滅，因此造成組織培養過程中較為嚴重的污染情況。可以采取一定的方法減少類似情況發生，比如取材要新鮮，切取頂芽或側芽時盡量不要損傷芽體，以免暴露內部的空隙。

此外，褐化問題一直是蓮藕組織培養過程中普遍存在的現象。分析原因，與蓮藕中多酚氧化酶（PPO）活性較高有關[6，7]。切取的外植體在接觸氧氣后，切口處多酚類物質在PPO的作用下，氧化成醌，導致蓮藕褐化，積累較多時，對外植體產生毒害[8]。從組織切片觀察結果看，單寧類物質隨著培養的時間加長而增加，而單寧是多酚高聚化合物。朱玉球等[9]在研究山核桃愈傷組織誘導過程中發現隨著單寧物質含量的減少，愈傷組織形成部位向切口上移，說明單寧的存在可抑制愈傷組織的發生，本試驗結果顯示，培養時間越長，單寧含量越高，組織越容易褐化，愈傷組織的產生越少，因此分析單寧是導致蓮藕極易褐化的主要原因之一。本試驗中采取了多種方法抑制蓮藕外植體的褐化。其中比較有效的方法包括及時繼代，減少培養時間，可一定程度上減緩單寧物質的影響；另外，在培養基中添加一定量的活性炭，可吸附部分醌類，有效控制褐化現象，然而活性炭同時也吸附了其他的營養物質，對愈傷組織的生長和增殖有一定影響。因此，在培養初期采用活性炭，到后期組織情況穩定后，可不必再添加；此外，采用Gelrite替代瓊脂作為固化劑可明顯改善褐化情況，分析原因，可能是由于Gelrite成分更為純凈，在固化效果相同的情況下，用量少，一般僅為瓊脂用量的1/3，甚至更少。因此，Gelrite固化劑滲透性強，使產生的醌更快擴散。

此外，蓮藕的愈傷組織誘導率較低，一般最高僅為30%左右，相應的類似報道也不多見，刁英等[10]報道的蓮藕愈傷誘導結果表明，最佳培養基為MS基本培養基+0.5 mg/L 6-BA+5.0 mg/L 2，4-D，最高誘導率可達32%，誘導率同樣較低。因此，要達到實際生產的要求，還需要進一步研究更加適合的培養方案。

參看文獻：

[1] 中國科學院植物研究所.中國高等植物圖鑒（第一冊）[M].北京：科學出版社，1994.646.

[2] 張建福，王 鋒.蓮藕的組織培養現狀與展望[J].上海農業科技，2000（4）：10.

[3] 陳麗萍，周可明，張志友.蓮藕組織培養研究進展[J].現代農業科技，2008（20）：15-16.

[4] 刁 英，韓延闖，何建軍，等.蓮藕研究進展[J].氨基酸和生物資源，2004，26（1）：8-11.

[5] 李正理.植物制片技術[M].北京：科學出版社，1987.40.

[6] 崔堂兵，郭 勇，張長遠.植物組織培養中褐變現象的產生機理及克服方法[J].廣東農業科學，2001（3）：16-18.

[7] 陳桂芳，婁利華.植物組織培養中幾個常見的技術問題[J].重慶林業科技，2003（4）：50-51.

[8] 何士敏，秦家順，李 鵬.蓮藕多酚氧化酶的催化特性檢測[J].西南農業學報，2011，24（1）：75-79.

[9] 朱玉球，廖望儀，黃堅欽，等.山核桃愈傷組織誘導的初步研究[J].浙江林學院學報，2001，18（2）：115-118.

[10] 刁 英，吳金平，趙玲玲，等.蓮胚性愈傷組織誘導研究初報[J].湖北農業科學，2011，50（14）：2991-2992.