川中黑山羊RBP4基因cDNA克隆及序列分析

龍石太+吳憲紅+胡亮+字向東

摘要：以川中黑山羊肝臟組織總RNA為模板，通過RT-PCR技術對黑山羊RBP4基因進行克隆測序及序列分析。結果表明，所克隆的665 bp片段為預期的川中黑山羊RBP4基因cDNA序列，包含整個CDS區，該編碼區長為606 bp，編碼201個氨基酸。用DNAMAN軟件進行同源性比對，結果顯示，川中黑山羊RBP4基因編碼區與GenBank中報道的牛、豬、馬、黑猩猩、小鼠、大鼠、人的同源性分別是98.5%、91.3%、92.2%、91.4%、83.0%、82.3%、91.3%；氨基酸序列同源性分別為97.5%、91.5%、93.5%、91.5%、83.6%、83.6%、91.5%。利用NJ法和MP法以該基因編碼區核苷酸序列構建物種間分子進化樹，其結果基本一致。聚類結果與遺傳距離大小一致，表明RBP4基因編碼區適用于構建物種間分子系統進化樹。

關鍵詞：川中黑山羊；RBP4基因；分子克隆；序列分析

中圖分類號：S826；Q785 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）03-0697-04

視黃醇結合蛋白（Retinol-binding proteins，RBPs）是存在于動物體內以實現維生素A從肝細胞內轉運至靶組織，并參與血清和細胞內視黃酸、視黃醇轉運代謝的一種特異性運載蛋白，類屬于疏水小分子結合蛋白家族[1]。RBPs在協助維生素A發揮生理功能中起著不可替代的作用。首先，RBP與維生素A結合后再與甲狀腺素運載蛋白結合，形成VA-RBP-TTR復合體，伴隨血液循環流經靶組織，與RBP的可識別受體結合，然后將維生素A轉運到細胞內的受體上，以此完成其運載功能[2]。RBP主要在肝臟細胞中合成，合成后釋放到血液中，最后通過內循環進入動物體內各組織。但RBP基因的mRNA在哺乳動物的卵巢、輸卵管、卵泡、黃體、子宮內膜、肝臟、小腸、睪丸和附睪等多種組織中都有表達，只是在不同物種、組織器官和不同發育時期存在表達差異[3]。研究顯示，視黃醇結合蛋白4基因（RBP4）在豬妊娠關鍵期的轉運作用和胚胎發育過程中發揮重要作用，從而影響豬的產仔數[3，4]，RBP4是產生孕體的主要蛋白質之一。

目前，有關RBP基因在人、豬、牛、綿羊、小鼠、大鼠等物種中的研究均有報道，但在山羊物種中的研究尚未見報道。繁殖性狀是山羊最為重要的經濟性狀，提高山羊產活羔率是增加山羊經濟價值的重要手段，提高山羊繁殖力則普遍成為世界養羊業所追求的目標。而川中黑山羊是經過長期自然選擇和人工重點選育的多胎山羊品種，具有性成熟早（母羊初情期為3～4月齡，初配年齡為5～6月齡）、產仔率高（平均產羔率為270%）、生長速度快、產肉性能好、耐粗食、抗病力強、適應性良好等優點[4，5]。

本研究以川中黑山羊為研究對象，首次對山羊的RBP4基因CDS區進行克隆測序及序列分析，與GenBank中其他物種的相應基因進行序列比對，并在此基礎上構建物種間分子系統進化樹，以期為進一步開展川中黑山羊RBP4基因的定位、表達調控以及繁殖性狀的相關分析等提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

從四川省樂至縣天龍科技示范園選取6只3～5歲健康的黑山羊，屠宰后采集肝臟組織，迅速放置在室溫生理鹽水中，并沖洗3次，放于RNA later 中，然后放置到盛有液氮的液氮罐中保存，帶回實驗室保存于超低溫冰箱（-70 ℃）中，用于RNA提取。

1.2 主要試劑和儀器

動物組織總RNA提取試劑盒、2×Taq PCR Master Mix、感受態細胞均購自天根生化科技（北京）有限公司，反轉錄試劑盒購自FERMENTAS（MBI）公司，X-Gal、IPTG、氨芐青霉素（Ampr）、克隆載體PMD-19 Vector購自寶生物工程（大連）有限公司，DNA膠回收試劑盒購自愛思進生物技術（杭州）有限公司。

1.3 總RNA的提取

依據動物組織總RNA提取試劑盒（離心柱型）提取川中黑山羊肝臟總RNA。依據反轉錄試劑盒進行cDNA第一鏈的合成。

1.4 引物設計及目的基因PCR擴增

參考GenBank已公布的牛視黃醇結合蛋白（RBP4）基因（登錄號：NM_001040475）的mRNA序列，應用 Primer Premier 5 設計1對引物，預期擴增片段長度為 665 bp，引物序列送上海英俊生物有限公司合成（表1）。以合成的川中黑山羊肝臟cDNA為模板，構建25 μL PCR擴增體系。上、下游引物各1 μL，cDNA模板0.5 μL，2×Taq PCR Master Mix酶12.5 μL，水10 μL。PCR 擴增程序為：95 ℃ 預變性5 min；95 ℃ 變性40 s，60 ℃ 退火40 s，72 ℃ 延伸1 min，35個循環；72 ℃ 延伸5 min，4 ℃ 保存。PCR反應產物以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 克隆及重組子篩選和鑒定

PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，按DNA膠回收試劑盒說明進行膠回收，回收產物與PMD-19 載體在16 ℃ 連接過夜。連接反應產物轉化宿主菌5α 感受態細胞，涂布于含氨芐青霉素、X-Gal和IPTG的LB固體平板上，37 ℃培養過夜。挑選白色單克隆菌落于LB液體培養基上，37 ℃振蕩培養12 h，取菌液進行PCR陽性重組子鑒定，并提取重組質粒。

1.6 序列及系統進化分析

將重組質粒送上海英俊生物有限公司測序。測序結果用DNAMAN 4.0 軟件拼接后，與GenBank 中已公布的牛、豬、馬、人、黑猩猩、大鼠、小鼠的RBP4基因進行比對，分析其在核苷酸和相應的氨基酸序列上的異同，并使用Mega 4.0 軟件構建物種間系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 RBP4基因PCR電泳結果

以川中黑山羊肝臟cDNA為模板進行PCR擴增，擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳（電泳緩沖液為1×TBE）檢測后，得到與預期大小（665 bp）一致的片段（圖1）。

2.2 重組子鑒定

挑選8個單克隆菌落37 ℃搖菌，培養5 h后，從每管培養基中抽取1 μL作為模板，以原引物進行PCR 反應，再用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增的目的片段的大小，結果與預期結果一致（圖2），然后將鑒定后的陽性菌液送上海英俊生物有限公司測序。

2.3 川中黑山羊RBP4基因CDS序列分析

利用DNAMAN 4.0對測序結果進行拼接，得到665 bp的片段，與預期結果相符。RBP4基因測序結果如圖3所示。用ORF查找器（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）查找RBP4的開放性閱讀框并翻譯出氨基酸序列，結果表明，RBP4基因含有一個606 bp的可讀框，起始密碼子為ATG（編碼蛋氨酸），終止密碼子為TAG （不編碼氨基酸），編碼201個AA。

2.4 RBP4基因核苷酸、氨基酸序列的同源性比對

2.4.1 核苷酸序列比對及遺傳距離 將所得的RBP4基因CDS區與GenBank中查找的其他物種RBP4的CDS區進行比對，計算其序列相似性與遺傳距離。核苷酸序列比對結果表明，參與比對的各物種RBP4基因編碼區長度相同，均為606 bp， 沒有發現不同物種間的特異插入或缺失。

經比對（表2），川中黑山羊RBP4基因 CDS 區與牛（NM_001040475）、豬（NM_214057）、馬（NM_001081951）、黑猩猩（NM_001045495）、小鼠（NM_001159487）、大鼠（NM_013162）、人（NM_006744）的同源性分別是98.5%、91.3%、92.2%、91.4%、83.0%、82.3%、91.3%，表明川中黑山羊RBP4基因的CDS區較保守。

由核苷酸序列推導的氨基酸序列比對結果（表2）可知，川中黑山羊RBP4的氨基酸序列與牛、豬、馬、黑猩猩、小鼠、大鼠、人的同源性分別為97.5%、91.5%、93.5%、91.5%、83.6%、83.6%、91.5%。

2.4.2 物種間分子系統進化樹 采用鄰接法（NJ）和最大簡約法（MP）對川中黑山羊、牛、馬、豬、人、黑猩猩、大鼠、小鼠的核苷酸序列分別構建物種間分子系統進化樹（圖4、圖5），利用Clustal X軟件進行同源性比對，并計算RBP4基因核苷酸及推導氨基酸序列的遺傳距離（表3）。結果表明，2種方法構建的物種間分子系統進化樹基本一致，且遺傳距離的大小、核苷酸及推導氨基酸序列的同源性一致。

3 小結與討論

3.1 川中黑山羊RBP4基因核苷酸及其推導氨基酸序列分析

參與比對的各物種RBP4基因編碼區均為606 bp，無種屬特異性插入和缺失。采用DNAMAN、Clustal X軟件進行同源性比對，結果表明川中黑山羊RBP4基因CDS區核苷酸序列與牛、豬、馬、黑猩猩、人的同源性都在90%以上，與川中黑山羊親緣關系最近的是牛，同源性高達98.5%，二者有10處核苷酸的差異；與小鼠、大鼠同源性為83.0%、82.3%，表明川中黑山羊RBP4基因的CDS區較保守。川中黑山羊RBP4基因與牛科動物遺傳距離很小，僅為0.015，與大鼠的遺傳距離最大，為0.177，表明川中黑山羊與牛的親緣關系最近，與鼠的親緣關系最遠。

川中黑山羊RBP4基因推導氨基酸序列與查找的各物種同源性比對結果基本一致，其親緣關系遠近與核苷酸序列比對結果也基本一致。氨基酸序列比對結果顯示，與川中黑山羊親緣關系最近的是牛。

3.2 物種間分子進化關系

川中黑山羊與牛、豬、馬、人、黑猩猩、鼠等物種間的分子系統進化樹的構建結果表明，NJ法構建的系統樹各分支置信度均在98以上，其中，川中黑山羊與牛聚類時置信度達100；MP法構建的系統樹中，川中黑山羊和牛聚類時的置信度也達到100，除了人和豬聚類時的置信度為90以外，其他分支的置信度均在98以上，說明這2種方法的聚類結果可靠性較強。從聚類結果可以看出，川中黑山羊首先與牛聚為一類，再與馬聚為一類，然后與人、豬聚類，最后與鼠科動物聚類。該分子系統進化樹較準確、真實地反映了各物種間的進化關系和親緣關系，即親緣關系越近的物種，同源性越高，遺傳距離越小。

3.3 RBP4基因作為動物繁殖力候選基因

RBP4基因作為豬的繁殖力相關的候選基因已經被廣泛研究。楊龍等[3]對長白、大白、民豬、杜洛克和雜種豬5種豬的多態性進行研究，發現這5種豬均表現為中度多態性，民豬的B等位基因為優勢等位基因，推測B等位基因與豬的多胎性狀相關。羅仍卓么等[6]對北京黑豬RBP4基因的多態性進行研究，發現BB型比AA型和AB型的總產仔數分別多1.04頭和0.31頭，B等位基因的加性效應為0.282頭/窩。朱吉等[7]對湖南黑豬的研究發現，初產母豬的BB基因型比AA基因型個體總產仔數、產活仔數分別多1.66、1.83頭。該研究結論進一步支持了B等位基因可能為豬繁殖性能的優勢等位基因。Rothschild等[8]對6個商品系1 300頭母豬的2 555頭仔豬進行了RBP4標記基因型檢測，其加性效應分別為0.23 頭/窩（總產仔數）和0.15 頭/窩（產活仔數），表明RBP4基因對產仔數存在中等增強的效應。Ollivier等[9]分析了高產仔系和對照組母豬，估計RBP4基因的加性效應為0.4頭/窩。Linville等[10]報道了RBP4對總產仔數的加性效應為0.179頭/窩，對產活仔數的加性效應為0.526頭/窩。因此，RBP4基因可作為豬的一個較為合理的產仔數候選基因。

RBP4基因作為綿羊的繁殖力候選基因的研究也有報道，何遠清等[11]以RBP4為候選基因，檢測 RBP4基因在高繁殖力綿羊品種（湖羊、小尾寒羊）和低繁殖力綿羊品種（薩福克羊、多賽特羊）中的單核苷酸多態性。結果發現，RBP4基因在4個綿羊品種中均存在多態性，且BB基因型小尾寒羊產羔數分別比AA和AB基因型多0.52只和0.67只。表明RBP4基因與小尾寒羊高繁殖力相關。在山羊種中，RBP4基因作為繁殖力候選基因尚未見報道，本研究對川中黑山羊RBP4基因編碼區進行克隆，旨在為開展山羊RBP4基因的相關研究提供理論支持。

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RBP4基因作為綿羊的繁殖力候選基因的研究也有報道，何遠清等[11]以RBP4為候選基因，檢測 RBP4基因在高繁殖力綿羊品種（湖羊、小尾寒羊）和低繁殖力綿羊品種（薩福克羊、多賽特羊）中的單核苷酸多態性。結果發現，RBP4基因在4個綿羊品種中均存在多態性，且BB基因型小尾寒羊產羔數分別比AA和AB基因型多0.52只和0.67只。表明RBP4基因與小尾寒羊高繁殖力相關。在山羊種中，RBP4基因作為繁殖力候選基因尚未見報道，本研究對川中黑山羊RBP4基因編碼區進行克隆，旨在為開展山羊RBP4基因的相關研究提供理論支持。

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