魔芋內(nèi)生拮抗菌的定殖研究

程海麗+陳磊+樂超銀

摘要：采用抗魔芋（Amorphophallus rivieri Durieu）軟腐病的內(nèi)生芽孢桿菌BS-8發(fā)酵液灌根魔芋植株，定期測定該內(nèi)生拮抗菌在魔芋葉片中的定殖情況。根據(jù)該內(nèi)生菌16S rRNA特異性保守區(qū)域設計引物，定期4次采樣，提取魔芋葉片DNA，通過SYBR Green I實時熒光定量PCR法檢測該內(nèi)生拮抗菌在魔芋葉片中的定殖情況。結(jié)果表明，經(jīng)內(nèi)生拮抗菌灌根培養(yǎng)的魔芋葉片中芽孢桿菌數(shù)量均明顯大于對照，該內(nèi)生芽孢桿菌能大量定殖在魔芋葉片中。

關鍵詞：魔芋（Amorphophallus rivieri Durieu）軟腐病；內(nèi)生拮抗菌；SYBR Green I實時熒光定量PCR

中圖分類號：S632.9；TQ458 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）03-0613-04

魔芋（Amorphophallus rivieri Durieu）軟腐病是由胡蘿卜軟腐歐文氏桿菌（Erwonia carotovora var. Carotovora）引起的一種細菌性病害[1]。該病原菌致病機理為病原菌分泌果膠酶，消解細胞中間層，使組織潰爛，吸引其他腐敗細菌寄生，分解細胞蛋白胨，產(chǎn)生吲哚[2]。可危害所有十字花科蔬菜，且可交替?zhèn)魅尽Ｔ诹餍心攴輷p失可達50%～60%，甚至絕收，因此對其進行防治十分必要[3]。

近年來，生物防治已成為國內(nèi)外學者的研究熱點[4]。生物防治有利于人畜安全及環(huán)境保護，它不僅成本低廉，且兼防兼治，可增產(chǎn)增收，是一種無公害植保新技術，倍受人們青睞[5]。植物內(nèi)生菌是指在植物生長的一定或全部階段生活在植物體內(nèi)、但不表現(xiàn)出外在性狀的一類微生物，通常存在于細胞間隙[6，7]。植物內(nèi)生菌作為生防因子的優(yōu)勢主要表現(xiàn)在它能定殖于植物體內(nèi)，相對于其他環(huán)境微生物而言，避免了多種外界壓力的干擾，更有利于發(fā)揮生防效果。關于魔芋內(nèi)生菌定殖體內(nèi)的生防效果研究很少，因此，篩選出具有拮抗魔芋軟腐病的微生物是目前防治軟腐病的有效途徑。

實時熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR）技術是通過在反應體系中添加熒光染料或熒光標記特異性探針，在PCR反應過程中對擴增產(chǎn)物進行實時在線監(jiān)控，通過收集的熒光信號強弱進行定性或定量檢測和分析[8-10]。與常規(guī)PCR相比，熒光定量PCR能準確確定初始模板的拷貝數(shù)或濃度，靈敏度高，其擴增產(chǎn)物無需進行瓊脂糖凝膠電泳，大大提高了試驗效率。利用實時熒光定量PCR技術能對植物樣品進行定性和定量檢測，主要用于研究植物體內(nèi)有益微生物及病原菌的定量檢測、基因拷貝數(shù)檢測、目的基因表達水平差異檢測等，檢測范圍為101～1010拷貝數(shù)。本研究利用實時熒光定量PCR技術檢測內(nèi)生拮抗菌在魔芋植株中的定殖情況，以期為研究新的魔芋生防制劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試灌根用菌為魔芋內(nèi)生拮抗菌芽孢桿菌BS-8，由三峽大學生物技術研究中心于2011年分離鑒定并保存，經(jīng)鑒定該菌抗魔芋軟腐病。培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基[11]。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵液的制備 將BS-8菌種涂布于LB固體培養(yǎng)基的平板上，置于37 ℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。挑取一定體積的菌落置于含250 mL LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，封口后放入搖床，37 ℃振蕩培養(yǎng)48 h。檢測發(fā)酵液OD值，使其OD值為0.6，以備后面灌根用。

1.2.2 DNA的提取 挑取大小均勻、質(zhì)量約10 g的種芋播種于花盆中，待出苗后，以每盆100 mL內(nèi)生拮抗菌發(fā)酵液澆灌于魔芋植株根部，以澆灌自來水的作為空白對照，每個處理20個重復。待魔芋灌根處理后每隔15 d采1次樣，共采樣4次，樣品和空白對照每次做3次重復。DNA的提取采用CTAB法[12]。

1.2.3 引物設計與PCR檢測 將該內(nèi)生拮抗菌16S rRNA序列與同屬菌株進行比對，尋找特異性區(qū)域，根據(jù)該區(qū)域設計引物。上游引物為FQ-5 5′-ATGTTAGCGGCGGACGGGTGAG-3′和下游引物為FQ-3 5′-TCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCC-3′，PCR擴增產(chǎn)物為147 bp。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1）構(gòu)建質(zhì)粒標準品。以BS-8菌株的DNA為模板進行PCR擴增，反應體系（25 μL）為DNA模板 0.5 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，Primer 1和Primer 2各0.5 μL，Taq酶0.5 μL，ddH2O 18.5 μL。反應條件為94 ℃ 預變性5 min；94 ℃ 變性30 s，59 ℃退火 30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72 ℃保溫10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，割膠回收后連接T載體，并將陽性轉(zhuǎn)化子菌液送至生工生物工程（上海）有限公司測序。

2）標準品和待測樣品的實時熒光定量PCR。反應體系（25 μL）：DNA模板2.0 μL，Primer 1和Primer 2各1.0 μL，ddH2O 8.5 μL，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（2×） 12.5 μL。反應條件為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，78 ℃ 孵育1 s，共39個循環(huán)；72 ℃保溫10 min。反應結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進行檢測，溫度從60 ℃上升到95.5 ℃，直至PCR產(chǎn)物全部解鏈，溫度上升的幅度為0.3 ℃/s，每10 s檢測一次熒光信號，繪制PCR產(chǎn)物的溶解曲線、擴增曲線圖和標準曲線。

3）SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR標準曲線的繪制。以純化后的質(zhì)粒作為標準品，用核酸蛋白測定儀檢測提取的質(zhì)粒濃度，計算其拷貝數(shù)[13]。

將質(zhì)粒標準品稀釋成10、1、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4 ng/μL 6個濃度梯度，拷貝數(shù)范圍在105～1010copies/μL之間，以這6個濃度的質(zhì)粒DNA進行熒光實時定量PCR，制作標準曲線，每個濃度3次重復，同時以不加模板作為陰性對照。反應結(jié)束后，自動生成溶解曲線，并根據(jù)不同濃度標準DNA的Ct值及其起始拷貝數(shù)的log值繪制標準曲線，建立標準曲線的線性范圍，構(gòu)建絕對定量。

4）內(nèi)生拮抗菌BS-8在魔芋體內(nèi)定殖情況的檢測。以4次定期采樣的樣品和空白魔芋葉片總DNA為模板進行熒光定量PCR檢測，反應體系和條件同上，反應結(jié)束后，將每個模板對應的Ct值代入標準曲線的方程中，計算內(nèi)生拮抗菌的log值，并換算成芽孢桿菌數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 常規(guī)PCR檢測內(nèi)生拮抗菌在魔芋葉片中的定殖情況

利用內(nèi)生拮抗菌芽孢桿菌16S rRNA特異性保守區(qū)域序列設計引物FQ-5和FQ-3，以芽胞桿菌灌根處理的魔芋葉片總DNA為模板進行PCR擴增，同時以未灌根的魔芋葉片總DNA為空白對照，2%瓊脂糖電泳檢測擴增產(chǎn)物。如圖1所示，接種后魔芋葉片DNA的PCR產(chǎn)物在150 bp左右有一條亮帶，條帶清晰，與預期的條帶大小一致；未接種魔芋葉片DNA的PCR產(chǎn)物除第三次外均無此條帶。結(jié)果表明，常規(guī)PCR檢測到經(jīng)芽孢桿菌BS-8灌根處理的魔芋葉片中含有芽孢桿菌，與空白對照相比，初步確定該芽孢桿菌BS-8能定殖在魔芋體內(nèi)。該內(nèi)生拮抗菌在空白處理魔芋葉片中也有一定量的表達。

2.2 質(zhì)粒標準品的構(gòu)建

以芽孢桿菌BS-8的DNA為模板進行PCR擴增，結(jié)果如圖2所示。在150 bp處有一條清晰的條帶，與預期的條帶大小一致，PCR產(chǎn)物特異性強、條帶清晰，沒有明顯的二聚體產(chǎn)生。將擴增的目標片段與T載體連接，測序結(jié)果得到序列大小為147 bp。

2.3 實時熒光定量PCR標準曲線的繪制

利用構(gòu)建好的標準質(zhì)粒DNA（濃度梯度分別稀釋為10、1、1×10-1、1×10-2、1×10-3及1×10-4 ng/μL）進行實時熒光定量PCR，溶解曲線、擴增曲線和標準曲線依次見圖3、4和5。由圖3可知，溶解曲線只有單一峰，說明反應過程中沒有其他非靶標產(chǎn)物產(chǎn)生，引物特異性強，產(chǎn)物的溶解溫度Tm值惟一，溫度為84.3 ℃，定量準確。

由圖5可知，標準曲線的斜率為-3.216 66，說明反應的Ct值與質(zhì)粒濃度的拷貝數(shù)log值成反比，實時熒光定量PCR標準曲線的R2=0.980 82，說明不同拷貝數(shù)與其對應的Ct值具有很高的相關性，準確性好，能用于后續(xù)進一步的熒光定量分析。

2.4 內(nèi)生拮抗菌的定殖情況

將灌根處理的魔芋葉片的總DNA稀釋成相同濃度（10 ng/μL）作為模板進行實時熒光定量PCR，熒光擴增曲線如圖6所示。將魔芋總DNA反應的Ct值代入標準曲線方程中，計算芽胞桿菌DNA拷貝數(shù)的log值，并換算出每克魔芋葉片中含有的芽胞桿菌數(shù)量。

2.5 檢測結(jié)果

由表1可知，利用Ct值代入標準曲線方程中計算出的拷貝數(shù)范圍在108～109 copies/μL之間，符合定量標準曲線105～1010 copies/μL的線性范圍，經(jīng)芽胞桿菌灌根接種的魔芋葉片中芽胞桿菌數(shù)量均明顯大于空白處理。

3 結(jié)論

本試驗通過實時熒光定量PCR檢測了魔芋內(nèi)生拮抗芽孢桿菌BS-8在魔芋葉片中的定殖情況。但是該數(shù)據(jù)不能說明該內(nèi)生拮抗菌與抗魔芋軟腐病之間有直接關系，因此，需要后面繼續(xù)進行研究，檢測該內(nèi)生拮抗菌在魔芋塊莖和葉柄中的定殖情況及與抗軟腐病之間的關系。另外，該定量方法并不能說明所檢測的內(nèi)生菌數(shù)量全部是芽孢桿菌BS-8，因為魔芋葉片的DNA 包括魔芋自身的，也包括大量微生物的，也就是說熒光定量PCR檢測的定殖芽孢桿菌含量并不準確，因為熒光定量PCR并不能進行物種分類，包含有此特異的16S rRNA引物的微生物都會被檢測到，單純的16S rRNA引物并不能用來對特異的某種微生物進行準確定量分析，尤其在比較復雜的微生物體中，如果要進行更精確的分析，應采用探針法進行研究。

參考文獻：

[1] 李雅華，咸洪泉，李樹文，等.拮抗胡蘿卜軟腐歐文氏桿菌的放線菌的分離和篩選[J].青島農(nóng)業(yè)大學學報（自然科學版），2009， 26（2）：143-146.

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[11] 沈 萍，范秀容，李廣武.微生物學實驗[M].北京：高等教育出版社，1999.

[12] 申煌煊，李 剛.分子生物學實驗方法與技巧[M].廣州：中山大學出版社，2010.134-135.

[13] 馮 興.益生芽孢桿菌PAS38在肉雞腸道中的消長規(guī)律及對腸道菌群調(diào)節(jié)作用研究[D].四川雅安：四川農(nóng)業(yè)大學，2009.

將質(zhì)粒標準品稀釋成10、1、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4 ng/μL 6個濃度梯度，拷貝數(shù)范圍在105～1010copies/μL之間，以這6個濃度的質(zhì)粒DNA進行熒光實時定量PCR，制作標準曲線，每個濃度3次重復，同時以不加模板作為陰性對照。反應結(jié)束后，自動生成溶解曲線，并根據(jù)不同濃度標準DNA的Ct值及其起始拷貝數(shù)的log值繪制標準曲線，建立標準曲線的線性范圍，構(gòu)建絕對定量。

4）內(nèi)生拮抗菌BS-8在魔芋體內(nèi)定殖情況的檢測。以4次定期采樣的樣品和空白魔芋葉片總DNA為模板進行熒光定量PCR檢測，反應體系和條件同上，反應結(jié)束后，將每個模板對應的Ct值代入標準曲線的方程中，計算內(nèi)生拮抗菌的log值，并換算成芽孢桿菌數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 常規(guī)PCR檢測內(nèi)生拮抗菌在魔芋葉片中的定殖情況

利用內(nèi)生拮抗菌芽孢桿菌16S rRNA特異性保守區(qū)域序列設計引物FQ-5和FQ-3，以芽胞桿菌灌根處理的魔芋葉片總DNA為模板進行PCR擴增，同時以未灌根的魔芋葉片總DNA為空白對照，2%瓊脂糖電泳檢測擴增產(chǎn)物。如圖1所示，接種后魔芋葉片DNA的PCR產(chǎn)物在150 bp左右有一條亮帶，條帶清晰，與預期的條帶大小一致；未接種魔芋葉片DNA的PCR產(chǎn)物除第三次外均無此條帶。結(jié)果表明，常規(guī)PCR檢測到經(jīng)芽孢桿菌BS-8灌根處理的魔芋葉片中含有芽孢桿菌，與空白對照相比，初步確定該芽孢桿菌BS-8能定殖在魔芋體內(nèi)。該內(nèi)生拮抗菌在空白處理魔芋葉片中也有一定量的表達。

2.2 質(zhì)粒標準品的構(gòu)建

以芽孢桿菌BS-8的DNA為模板進行PCR擴增，結(jié)果如圖2所示。在150 bp處有一條清晰的條帶，與預期的條帶大小一致，PCR產(chǎn)物特異性強、條帶清晰，沒有明顯的二聚體產(chǎn)生。將擴增的目標片段與T載體連接，測序結(jié)果得到序列大小為147 bp。

2.3 實時熒光定量PCR標準曲線的繪制

利用構(gòu)建好的標準質(zhì)粒DNA（濃度梯度分別稀釋為10、1、1×10-1、1×10-2、1×10-3及1×10-4 ng/μL）進行實時熒光定量PCR，溶解曲線、擴增曲線和標準曲線依次見圖3、4和5。由圖3可知，溶解曲線只有單一峰，說明反應過程中沒有其他非靶標產(chǎn)物產(chǎn)生，引物特異性強，產(chǎn)物的溶解溫度Tm值惟一，溫度為84.3 ℃，定量準確。

由圖5可知，標準曲線的斜率為-3.216 66，說明反應的Ct值與質(zhì)粒濃度的拷貝數(shù)log值成反比，實時熒光定量PCR標準曲線的R2=0.980 82，說明不同拷貝數(shù)與其對應的Ct值具有很高的相關性，準確性好，能用于后續(xù)進一步的熒光定量分析。

2.4 內(nèi)生拮抗菌的定殖情況

將灌根處理的魔芋葉片的總DNA稀釋成相同濃度（10 ng/μL）作為模板進行實時熒光定量PCR，熒光擴增曲線如圖6所示。將魔芋總DNA反應的Ct值代入標準曲線方程中，計算芽胞桿菌DNA拷貝數(shù)的log值，并換算出每克魔芋葉片中含有的芽胞桿菌數(shù)量。

2.5 檢測結(jié)果

由表1可知，利用Ct值代入標準曲線方程中計算出的拷貝數(shù)范圍在108～109 copies/μL之間，符合定量標準曲線105～1010 copies/μL的線性范圍，經(jīng)芽胞桿菌灌根接種的魔芋葉片中芽胞桿菌數(shù)量均明顯大于空白處理。

3 結(jié)論

本試驗通過實時熒光定量PCR檢測了魔芋內(nèi)生拮抗芽孢桿菌BS-8在魔芋葉片中的定殖情況。但是該數(shù)據(jù)不能說明該內(nèi)生拮抗菌與抗魔芋軟腐病之間有直接關系，因此，需要后面繼續(xù)進行研究，檢測該內(nèi)生拮抗菌在魔芋塊莖和葉柄中的定殖情況及與抗軟腐病之間的關系。另外，該定量方法并不能說明所檢測的內(nèi)生菌數(shù)量全部是芽孢桿菌BS-8，因為魔芋葉片的DNA 包括魔芋自身的，也包括大量微生物的，也就是說熒光定量PCR檢測的定殖芽孢桿菌含量并不準確，因為熒光定量PCR并不能進行物種分類，包含有此特異的16S rRNA引物的微生物都會被檢測到，單純的16S rRNA引物并不能用來對特異的某種微生物進行準確定量分析，尤其在比較復雜的微生物體中，如果要進行更精確的分析，應采用探針法進行研究。

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[13] 馮 興.益生芽孢桿菌PAS38在肉雞腸道中的消長規(guī)律及對腸道菌群調(diào)節(jié)作用研究[D].四川雅安：四川農(nóng)業(yè)大學，2009.

將質(zhì)粒標準品稀釋成10、1、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4 ng/μL 6個濃度梯度，拷貝數(shù)范圍在105～1010copies/μL之間，以這6個濃度的質(zhì)粒DNA進行熒光實時定量PCR，制作標準曲線，每個濃度3次重復，同時以不加模板作為陰性對照。反應結(jié)束后，自動生成溶解曲線，并根據(jù)不同濃度標準DNA的Ct值及其起始拷貝數(shù)的log值繪制標準曲線，建立標準曲線的線性范圍，構(gòu)建絕對定量。

4）內(nèi)生拮抗菌BS-8在魔芋體內(nèi)定殖情況的檢測。以4次定期采樣的樣品和空白魔芋葉片總DNA為模板進行熒光定量PCR檢測，反應體系和條件同上，反應結(jié)束后，將每個模板對應的Ct值代入標準曲線的方程中，計算內(nèi)生拮抗菌的log值，并換算成芽孢桿菌數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 常規(guī)PCR檢測內(nèi)生拮抗菌在魔芋葉片中的定殖情況

利用內(nèi)生拮抗菌芽孢桿菌16S rRNA特異性保守區(qū)域序列設計引物FQ-5和FQ-3，以芽胞桿菌灌根處理的魔芋葉片總DNA為模板進行PCR擴增，同時以未灌根的魔芋葉片總DNA為空白對照，2%瓊脂糖電泳檢測擴增產(chǎn)物。如圖1所示，接種后魔芋葉片DNA的PCR產(chǎn)物在150 bp左右有一條亮帶，條帶清晰，與預期的條帶大小一致；未接種魔芋葉片DNA的PCR產(chǎn)物除第三次外均無此條帶。結(jié)果表明，常規(guī)PCR檢測到經(jīng)芽孢桿菌BS-8灌根處理的魔芋葉片中含有芽孢桿菌，與空白對照相比，初步確定該芽孢桿菌BS-8能定殖在魔芋體內(nèi)。該內(nèi)生拮抗菌在空白處理魔芋葉片中也有一定量的表達。

2.2 質(zhì)粒標準品的構(gòu)建

以芽孢桿菌BS-8的DNA為模板進行PCR擴增，結(jié)果如圖2所示。在150 bp處有一條清晰的條帶，與預期的條帶大小一致，PCR產(chǎn)物特異性強、條帶清晰，沒有明顯的二聚體產(chǎn)生。將擴增的目標片段與T載體連接，測序結(jié)果得到序列大小為147 bp。

2.3 實時熒光定量PCR標準曲線的繪制

利用構(gòu)建好的標準質(zhì)粒DNA（濃度梯度分別稀釋為10、1、1×10-1、1×10-2、1×10-3及1×10-4 ng/μL）進行實時熒光定量PCR，溶解曲線、擴增曲線和標準曲線依次見圖3、4和5。由圖3可知，溶解曲線只有單一峰，說明反應過程中沒有其他非靶標產(chǎn)物產(chǎn)生，引物特異性強，產(chǎn)物的溶解溫度Tm值惟一，溫度為84.3 ℃，定量準確。

由圖5可知，標準曲線的斜率為-3.216 66，說明反應的Ct值與質(zhì)粒濃度的拷貝數(shù)log值成反比，實時熒光定量PCR標準曲線的R2=0.980 82，說明不同拷貝數(shù)與其對應的Ct值具有很高的相關性，準確性好，能用于后續(xù)進一步的熒光定量分析。

2.4 內(nèi)生拮抗菌的定殖情況

將灌根處理的魔芋葉片的總DNA稀釋成相同濃度（10 ng/μL）作為模板進行實時熒光定量PCR，熒光擴增曲線如圖6所示。將魔芋總DNA反應的Ct值代入標準曲線方程中，計算芽胞桿菌DNA拷貝數(shù)的log值，并換算出每克魔芋葉片中含有的芽胞桿菌數(shù)量。

2.5 檢測結(jié)果

由表1可知，利用Ct值代入標準曲線方程中計算出的拷貝數(shù)范圍在108～109 copies/μL之間，符合定量標準曲線105～1010 copies/μL的線性范圍，經(jīng)芽胞桿菌灌根接種的魔芋葉片中芽胞桿菌數(shù)量均明顯大于空白處理。

3 結(jié)論

本試驗通過實時熒光定量PCR檢測了魔芋內(nèi)生拮抗芽孢桿菌BS-8在魔芋葉片中的定殖情況。但是該數(shù)據(jù)不能說明該內(nèi)生拮抗菌與抗魔芋軟腐病之間有直接關系，因此，需要后面繼續(xù)進行研究，檢測該內(nèi)生拮抗菌在魔芋塊莖和葉柄中的定殖情況及與抗軟腐病之間的關系。另外，該定量方法并不能說明所檢測的內(nèi)生菌數(shù)量全部是芽孢桿菌BS-8，因為魔芋葉片的DNA 包括魔芋自身的，也包括大量微生物的，也就是說熒光定量PCR檢測的定殖芽孢桿菌含量并不準確，因為熒光定量PCR并不能進行物種分類，包含有此特異的16S rRNA引物的微生物都會被檢測到，單純的16S rRNA引物并不能用來對特異的某種微生物進行準確定量分析，尤其在比較復雜的微生物體中，如果要進行更精確的分析，應采用探針法進行研究。

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