靈芝多糖超聲波提取工藝條件的優化

李鳳林+呂艷榮+宮敬利+齊俊生

摘要：為確定靈芝（Ganoderma lucidum）多糖超聲波提取最佳工藝條件，通過單因素試驗與正交回歸組合設計對其進行優化。結果表明，靈芝多糖超聲波提取最佳工藝條件為料液比（g/mL）1∶35，超聲功率80 W，超聲溫度50 ℃，超聲時間35 min，此條件下靈芝多糖實際提取率為2.06%。

關鍵詞：靈芝（Ganoderma lucidum）多糖；超聲波提取；正交回歸組合設計；工藝條件

中圖分類號：R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）03-0640-04

靈芝（Ganoderma lucidum）為擔子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌赤芝和紫芝的總稱，以子實體為入藥部位，具有補氣安神、止咳平喘、扶正固本等功效，被《本經》稱為上品[1]。靈芝的藥用成分非常豐富，已分離得到的有效成分有數十種之多，其中多糖是靈芝中主要的生理活性物質之一，近年來引起國內外科研工作者極大的關注。現代藥理學研究表明，靈芝多糖具有抗衰老、抗輻射、抗腫瘤、調節心律失常、鎮靜中樞神經、鎮痛、強心、擴張冠狀動脈、降低心肌缺血量、改善心肌微循環、降血糖、降血壓、抑菌、提高免疫力、促進白細胞再生、保護肝細胞等多種生物活性[2-5]。多糖傳統的萃取方法是水提法，存在著費時、耗能高、提取率低等缺點。超聲波提取法是一種有效的新型提取方法，其空化作用能有效破碎細胞壁或者包埋結構的外層，改變物質擴散，釋放內容物，從而提高提取率。目前，超聲波技術已在植物多糖提取中被廣泛應用，但目前鮮見關于超聲波提取靈芝多糖的報道。本研究的目的是驗證超聲波法在靈芝多糖提取中應用的可行性，力求尋找出一種高效的提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 靈芝子實體采于吉林農業科技學院與吉林市匯豐科技開發有限責任公司合作基地（吉林市豐滿區江南鄉），為目前已培育定型的新品種（吉農匯特1號）。靈芝子實體切片后，用中藥粉碎機粉碎，過40目篩備用。無水葡萄糖（分析純）購于中國藥品生物制品檢定所；苯酚、濃硫酸、硝基水楊酸、乙醇等均為分析純，由吉林農業科技學院食品理化實驗室保存。

1.1.2 儀器與設備 KQ-100DB型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）， UV-1750型紫外可見分光光度計（島津公司），RE-5299型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠），SHB-III型循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司），YF型中藥粉碎機（江陰市偉翔藥化機械廠），DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司），KDC-1044型低速離心機（科大創新股份有限公司中佳分公司）。

1.2 方法

1.2.1 靈芝多糖超聲波提取方法 稱取5.0 g靈芝子實體細粉，置于一定比例水中浸泡1 h，然后放在超聲頻率固定為40 kHz的超聲波清洗器中，分別按照不同的萃取條件（不同的超聲功率、溫度及時間）提取，離心，留取上清液，并減壓濃縮至30 mL，用Sevag法脫蛋白后加入2倍量的無水乙醇沉淀多糖，過夜，離心，得沉淀物，依次用無水乙醇、丙酮、乙醚反復洗滌沉淀，干燥后稱重，即得靈芝粗多糖。

1.2.2 靈芝多糖提取率的測定 多糖含量的測定采用苯酚-硫酸法。以葡萄糖為標準品，480 nm波長下測定其吸光度，以葡萄糖溶液濃度（C，mg/mL）作橫坐標，以吸光度（A）作縱坐標，繪制標準曲線。用最小二乘法進行線性回歸，得葡萄糖溶液濃度與吸光度關系曲線的回歸方程：A=7.025C-0.004 9。R2=0.998 8，說明葡萄糖在規定范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

稱取靈芝粗多糖干品2.0 mg， 用去離子水定容于50 mL容量瓶中，然后精確吸取樣品溶液1.0 mL， 加入5%的苯酚溶液1.6 mL 及濃硫酸7.0 mL， 充分搖勻， 室溫放置25 min 后于480 nm 測其吸光度。根據標準曲線及回歸方程計算即得其多糖含量。靈芝多糖提取率（K）按下式計算：

式中，m為靈芝多糖質量（mg）；M為靈芝子實體細粉質量（mg）。

1.3 試驗設計

針對影響靈芝多糖超聲波提取效果的料液比、超聲功率、超聲溫度及超聲時間等條件，分別做單因素試驗，然后采用正交回歸組合設計（表1）試驗優化靈芝多糖超波聲提取工藝條件。

1.4 數據分析

采用DPS 3.01處理軟件對試驗結果進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 料液比對靈芝多糖提取率的影響

稱取5.0 g靈芝子實體細粉，分別按料液比（g/mL，下同）1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50加入水浸泡1 h，然后在超聲功率70 W，超聲溫度50 ℃，超聲時間30 min條件下提取靈芝多糖，其結果見圖1。由圖1可見，隨著溶劑比例的加大，靈芝多糖提取率逐漸上升，但當溶劑的比例超過30之后，靈芝多糖的提取率趨于平穩。分析其原因可能是由于在料液比達到1∶30時，多糖已大部分被提取出來。從能耗角度考慮，料液比選擇1∶30較為適宜。

2.2 超聲功率對靈芝多糖提取率的影響

稱取5.0 g靈芝子實體細粉，按料液比1∶30浸泡1 h，分別設定超聲功率為50、60、70、80、90 W，在超聲溫度50 ℃，超聲時間30 min條件下提取靈芝多糖，其結果見圖2。由圖2可見，隨著超聲功率的加大，靈芝多糖提取率逐漸上升，但超聲功率超過80 W之后提取率反而下降。分析其原因可能是由于較高的超聲功率加快多糖糖苷鍵的斷裂而導致其降解，所以超聲功率選擇80 W左右較為適宜。

2.3 超聲溫度對靈芝多糖提取率的影響

稱取5.0 g靈芝子實體細粉，按料液比1∶30浸泡1 h，分別設定超聲溫度30、40、50、60、70 ℃，在超聲功率70 W，超聲時間30 min條件下提取靈芝多糖，其結果見圖3。由圖3可見，隨著超聲溫度的升高，靈芝多糖提取率逐漸上升，但超聲溫度超過50 ℃之后提取率反而逐漸下降。分析其原因可能是由于較高的超聲溫度與超聲波機械的協同作用下能使多糖的某些結構被破壞而降低了其提取率，所以超聲溫度選擇50 ℃左右較為適宜。

2.4 超聲時間對靈芝多糖提取率的影響

稱取5.0 g靈芝子實體細粉，按料液比1∶30浸泡1 h，分別設定超聲時間10、20、30、40、50 min，在超聲功率70 W，超聲溫度50 ℃情況下提取靈芝多糖，其結果見圖4。由圖4可見，隨著超聲時間的延長，靈芝多糖提取率逐漸上升，但超聲時間超過30 min之后提取率反而逐漸下降。分析其原因可能是由于前期超聲波對細胞壁的破壞，細胞內部的多糖物質向外擴散，從而釋放更多的多糖；后期由于處理時間的延長，超聲波本身對多糖有降解作用，其結構被破壞，所以超聲時間選擇30 min左右較為適宜。

2.5 正交回歸組合設計試驗結果

在單因素試驗基礎上，以多糖提取率為指標，采用正交回歸組合設計優化靈芝多糖超聲波提取工藝，其結果見表2。對結果的方差分析見表3。由表2結果可計算出擬合方程的各項系數，從而得到回歸方程：y=2.062 86+0.078 33 x1-0.040 00 x2+0.011 67 x3+0.087 50 x4-0.067 80 x12-0.072 80 x22-0.070 30 x32-0.061 55 x42+0.006 25 x1x2-0.008 75 x1x3+0.003 75 x1x4-0.028 75 x2x3-0.016 25 x2x4-0.006 25 x3x4。由表3可見，F2=16.166>F0.05（14，16）=2.35，說明回歸顯著，方程擬合良好；F1=3.884

以下是α=0.10顯著水平剔除不顯著項后，簡化后的回歸方程：y=2.062 86+0.078 33 x1-0.040 00 x2+0.087 50 x4-0.067 80 x12-0.072 80 x22-0.070 30 x32-0.061 55 x42-0.028 75 x2x3-0.016 25 x2x4。最高值的各個因素組合x1為1水平，x2為0水平，x3為0水平，x4為1水平，ymax=2.10，即優化靈芝多糖超聲波提取工藝條件為料液比1∶35，超聲功率80 W，超聲溫度50 ℃，超聲時間35 min，此條件下靈芝多糖理論提取率為2.10%，用此條件重新進行驗證，得靈芝多糖實際提取率為2.06%，與理論值較接近，進一步驗證了本試驗結果擬合得出的回歸方程可以較好地應用于靈芝多糖的提取。

3 小結

1）在單因素試驗的基礎上，運用正交回歸組合設計的理論與方法，通過DPS 3.01處理軟件分析確定靈芝多糖超聲波提取的最佳工藝條件為：料液比1∶35，超聲功率80 W，超聲溫度50 ℃，超聲時間35 min，此條件下靈芝多糖實際提取率為2.06%，與理論值較為接近，說明此回歸模型是可靠的。

2）采用超聲波輔助提取靈芝多糖具有時間短、溫度低、提取率高、工藝簡單等特點，該工藝可為靈芝多糖的工業化生產提供理論依據。

參考文獻：

[1] 趙東旭，楊新林，王幫武，等.靈芝研究的若干進展[J]. 食用菌學報，1999，6（3）：59-64.

[2] ZHANG G L， WANG Y H， NI W， et al. Hepatoprotective role of ganoderma lucidum polysaccharide against BCG-induced immune liver injury in mice[J]. World J Gastroenterol，2002，8（4）：728-733.

[3] 白 丹，常迺滔，李大海，等.靈芝多糖抑菌活性初探[J].華北農學報，2008（S1）：282-285.

[4] 毛 健，馬海樂.靈芝多糖的研究進展[J].食品科學，2010，31（1）：295-298.

[5] LI F L， ZHANG Y M， ZHONG Z J. Antihyperglycemic effect of Ganoderma lucidum polysaccharides on streptozotocin-induced diabetic mice[J]. International Journal of Molecular Sciences，2011，12（9）：6135-6145.

2.4 超聲時間對靈芝多糖提取率的影響

稱取5.0 g靈芝子實體細粉，按料液比1∶30浸泡1 h，分別設定超聲時間10、20、30、40、50 min，在超聲功率70 W，超聲溫度50 ℃情況下提取靈芝多糖，其結果見圖4。由圖4可見，隨著超聲時間的延長，靈芝多糖提取率逐漸上升，但超聲時間超過30 min之后提取率反而逐漸下降。分析其原因可能是由于前期超聲波對細胞壁的破壞，細胞內部的多糖物質向外擴散，從而釋放更多的多糖；后期由于處理時間的延長，超聲波本身對多糖有降解作用，其結構被破壞，所以超聲時間選擇30 min左右較為適宜。

2.5 正交回歸組合設計試驗結果

在單因素試驗基礎上，以多糖提取率為指標，采用正交回歸組合設計優化靈芝多糖超聲波提取工藝，其結果見表2。對結果的方差分析見表3。由表2結果可計算出擬合方程的各項系數，從而得到回歸方程：y=2.062 86+0.078 33 x1-0.040 00 x2+0.011 67 x3+0.087 50 x4-0.067 80 x12-0.072 80 x22-0.070 30 x32-0.061 55 x42+0.006 25 x1x2-0.008 75 x1x3+0.003 75 x1x4-0.028 75 x2x3-0.016 25 x2x4-0.006 25 x3x4。由表3可見，F2=16.166>F0.05（14，16）=2.35，說明回歸顯著，方程擬合良好；F1=3.884

以下是α=0.10顯著水平剔除不顯著項后，簡化后的回歸方程：y=2.062 86+0.078 33 x1-0.040 00 x2+0.087 50 x4-0.067 80 x12-0.072 80 x22-0.070 30 x32-0.061 55 x42-0.028 75 x2x3-0.016 25 x2x4。最高值的各個因素組合x1為1水平，x2為0水平，x3為0水平，x4為1水平，ymax=2.10，即優化靈芝多糖超聲波提取工藝條件為料液比1∶35，超聲功率80 W，超聲溫度50 ℃，超聲時間35 min，此條件下靈芝多糖理論提取率為2.10%，用此條件重新進行驗證，得靈芝多糖實際提取率為2.06%，與理論值較接近，進一步驗證了本試驗結果擬合得出的回歸方程可以較好地應用于靈芝多糖的提取。

3 小結

1）在單因素試驗的基礎上，運用正交回歸組合設計的理論與方法，通過DPS 3.01處理軟件分析確定靈芝多糖超聲波提取的最佳工藝條件為：料液比1∶35，超聲功率80 W，超聲溫度50 ℃，超聲時間35 min，此條件下靈芝多糖實際提取率為2.06%，與理論值較為接近，說明此回歸模型是可靠的。

2）采用超聲波輔助提取靈芝多糖具有時間短、溫度低、提取率高、工藝簡單等特點，該工藝可為靈芝多糖的工業化生產提供理論依據。

參考文獻：

[1] 趙東旭，楊新林，王幫武，等.靈芝研究的若干進展[J]. 食用菌學報，1999，6（3）：59-64.

[2] ZHANG G L， WANG Y H， NI W， et al. Hepatoprotective role of ganoderma lucidum polysaccharide against BCG-induced immune liver injury in mice[J]. World J Gastroenterol，2002，8（4）：728-733.

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2.4 超聲時間對靈芝多糖提取率的影響

稱取5.0 g靈芝子實體細粉，按料液比1∶30浸泡1 h，分別設定超聲時間10、20、30、40、50 min，在超聲功率70 W，超聲溫度50 ℃情況下提取靈芝多糖，其結果見圖4。由圖4可見，隨著超聲時間的延長，靈芝多糖提取率逐漸上升，但超聲時間超過30 min之后提取率反而逐漸下降。分析其原因可能是由于前期超聲波對細胞壁的破壞，細胞內部的多糖物質向外擴散，從而釋放更多的多糖；后期由于處理時間的延長，超聲波本身對多糖有降解作用，其結構被破壞，所以超聲時間選擇30 min左右較為適宜。

2.5 正交回歸組合設計試驗結果

在單因素試驗基礎上，以多糖提取率為指標，采用正交回歸組合設計優化靈芝多糖超聲波提取工藝，其結果見表2。對結果的方差分析見表3。由表2結果可計算出擬合方程的各項系數，從而得到回歸方程：y=2.062 86+0.078 33 x1-0.040 00 x2+0.011 67 x3+0.087 50 x4-0.067 80 x12-0.072 80 x22-0.070 30 x32-0.061 55 x42+0.006 25 x1x2-0.008 75 x1x3+0.003 75 x1x4-0.028 75 x2x3-0.016 25 x2x4-0.006 25 x3x4。由表3可見，F2=16.166>F0.05（14，16）=2.35，說明回歸顯著，方程擬合良好；F1=3.884

以下是α=0.10顯著水平剔除不顯著項后，簡化后的回歸方程：y=2.062 86+0.078 33 x1-0.040 00 x2+0.087 50 x4-0.067 80 x12-0.072 80 x22-0.070 30 x32-0.061 55 x42-0.028 75 x2x3-0.016 25 x2x4。最高值的各個因素組合x1為1水平，x2為0水平，x3為0水平，x4為1水平，ymax=2.10，即優化靈芝多糖超聲波提取工藝條件為料液比1∶35，超聲功率80 W，超聲溫度50 ℃，超聲時間35 min，此條件下靈芝多糖理論提取率為2.10%，用此條件重新進行驗證，得靈芝多糖實際提取率為2.06%，與理論值較接近，進一步驗證了本試驗結果擬合得出的回歸方程可以較好地應用于靈芝多糖的提取。

3 小結

1）在單因素試驗的基礎上，運用正交回歸組合設計的理論與方法，通過DPS 3.01處理軟件分析確定靈芝多糖超聲波提取的最佳工藝條件為：料液比1∶35，超聲功率80 W，超聲溫度50 ℃，超聲時間35 min，此條件下靈芝多糖實際提取率為2.06%，與理論值較為接近，說明此回歸模型是可靠的。

2）采用超聲波輔助提取靈芝多糖具有時間短、溫度低、提取率高、工藝簡單等特點，該工藝可為靈芝多糖的工業化生產提供理論依據。

參考文獻：

[1] 趙東旭，楊新林，王幫武，等.靈芝研究的若干進展[J]. 食用菌學報，1999，6（3）：59-64.

[2] ZHANG G L， WANG Y H， NI W， et al. Hepatoprotective role of ganoderma lucidum polysaccharide against BCG-induced immune liver injury in mice[J]. World J Gastroenterol，2002，8（4）：728-733.

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[4] 毛 健，馬海樂.靈芝多糖的研究進展[J].食品科學，2010，31（1）：295-298.

[5] LI F L， ZHANG Y M， ZHONG Z J. Antihyperglycemic effect of Ganoderma lucidum polysaccharides on streptozotocin-induced diabetic mice[J]. International Journal of Molecular Sciences，2011，12（9）：6135-6145.