微波輔助提取連翹黃酮類化合物及其抗氧化性研究

劉夢(mèng)星+王濤+馬晶軍

摘要：以連翹[Forsythiae suspentsa（Thunb.）Vahl.]為試材，采用單因素試驗(yàn)法，研究了乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波時(shí)間、微波功率、料液比和提取次數(shù)對(duì)連翹黃酮類化合物提取的影響及連翹黃酮類化合物的抗氧化性，確定了提取的最適工藝參數(shù)。結(jié)果表明，連翹黃酮類化合物的最適提取工藝參數(shù)為乙醇70%，微波功率250 W，微波時(shí)間5 min，料液比1∶20和提取2次。連翹黃酮類化合物具有一定的清除羥自由基的能力。

關(guān)鍵詞：連翹[Forsythiae suspentsa（Thunb.）Vahl.]；微波輔助；黃酮；抗氧化性

中圖分類號(hào)：Q946.8；S665.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）03-0651-03

連翹[Forsythiae suspentsa（Thunb.）Vahl.]屬于木犀科連翹屬植物，是我國(guó)常用的傳統(tǒng)中藥之一[1，2]。在我國(guó)除華南地區(qū)外，其他各地均有栽培[3，4]。中藥連翹是連翹的干燥果實(shí)，性微寒，味苦，其主要活性成分有連翹苷、連翹酯苷、黃酮類和齊墩果酸等，可治療肺炎、傷寒、痢疾等病癥[1，2]；有研究表明，連翹提取物不但能清除自由基，還具有抗病毒、抗菌和抗腫瘤的功能，同時(shí)還可以保護(hù)肝臟不受化學(xué)性損傷[2，5-7]；另外，有醫(yī)學(xué)研究證明，連翹中的黃酮類化合物使連翹表現(xiàn)出了很高的抗氧化活性[2，8]，進(jìn)一步提高了連翹的利用價(jià)值。黃酮類化合物廣泛存在于綠色植物體中，其生物活性一直受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。該類化合物不但具有良好的抗氧化性能和清除自由基的能力，還在抗腫瘤、保護(hù)心血管和抗突變等方面表現(xiàn)出較強(qiáng)的能力[7-11]。研究表明，天然黃酮類化合物是一類安全可靠、成本低、來(lái)源廣、具有強(qiáng)抗氧化活性的抗氧化劑[12-14]。目前，黃酮類化合物廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和化妝品行業(yè)，正在逐步取代人工合成的抗氧化劑，有很好的應(yīng)用前景。

目前，從天然物質(zhì)中提取黃酮類化合物的方法以溶劑熱浸提為主[15，16]，國(guó)內(nèi)外利用微波法提取連翹黃酮類化合物的報(bào)道較少。微波輔助萃取法是在普通萃取法的基礎(chǔ)上輔以微波技術(shù)，利用微波熱效率高、穿透力強(qiáng)和選擇性高的特點(diǎn)來(lái)加快萃取過(guò)程中的傳質(zhì)作用， 從而提高萃取效率[17]。目前微波提取技術(shù)應(yīng)用于提取黃酮類化合物的報(bào)道有很多[15-18]。本試驗(yàn)利用微波輔助技術(shù)提取連翹中的黃酮類化合物，優(yōu)化了提取條件，并應(yīng)用Feton法[19-21]測(cè)定了黃酮類化合物清除羥自由基的能力，考察了黃酮類化合物的抗氧化性，旨在為連翹中有效活性物質(zhì)的提取提供理論基礎(chǔ)，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用連翹資源提供可靠的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和藥品

供試材料：河北本地產(chǎn)連翹，2012年9～10月購(gòu)買于河北省安國(guó)市中藥批發(fā)市場(chǎng)。將連翹置于烘箱中60 ℃下烘干，粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩，于棕色瓶中避光保存、備用。

藥品：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（生化試劑，中國(guó)藥品生物制品檢定所）、無(wú)水乙醇、95%乙醇（V/V，下同）、30%H2O2、FeSO4·7H2O、NaNO2、Al（NO3）3、NaOH、水楊酸、濃H2SO4等，所用試劑均為分析純及以上級(jí)別。試驗(yàn)所用水為二次去離子水。

儀器：756P型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司），ZIP-271 型微波爐（2.45 GHz，惠而浦微波爐公司），HH·SY11-Ni2型電熱恒溫水浴鍋（天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司），AG285型分析天平（Mettler Toledo），pHS-3C型酸度計(jì)（上海虹益儀器儀表有限公司），PH070A型干燥箱（上海一恒科技儀器有限公司），SHB-3型循環(huán)水多用真空泵（鄭州杜甫儀器廠） 。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制 準(zhǔn)確吸取0.05 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1、2、3、4、5 mL，分別置于6個(gè)10 mL容量瓶中，各加入0.3 mL 5% NaNO2溶液，6 min后加入0.3 mL 10% Al（NO3）3溶液，6 min后加入4 mL 1 mol/L的NaOH溶液，30%乙醇定容，靜置15 min，取4號(hào)瓶在200～800 nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描， 得到標(biāo)樣的光譜圖。從光譜圖可知， 在506 nm處有最大吸收峰，得到質(zhì)量濃度x與吸光度y的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=14.069x+0.022，R2=0.998 4。

1.2.2 微波輔助提取連翹中黃酮類化合物 稱取一定量的連翹藥材粉末，加入溶劑，微波提取，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定方法測(cè)定提取液的吸光度，根據(jù)線性回歸方程計(jì)算黃酮類化合物的含量。計(jì)算公式如下：

每克干藥材中黃酮類化合物的含量=（c×V×f）/m

其中，c為被測(cè)溶液濃度，V為定容后體積，f為稀釋倍數(shù)，m為干藥材的質(zhì)量。采用微波輔助提取法，分別考察了乙醇濃度、微波功率、微波時(shí)間、料液比（質(zhì)量比）和提取次數(shù)等影響因素對(duì)連翹中黃酮類化合的影響。

1.2.3 體外抗氧化活性的測(cè)定 采用Fenton體系測(cè)定體外抗氧化性。設(shè)3個(gè)處理：樣品組、空白組、本底組。樣品組中含有0.4 mL 0.15 mol/L FeSO4，2.0 mL 2 mmol/L 水楊酸，1.0 mL 6 mmol/L H2O2以及樣液（稀釋10倍）1.0 mL；空白組中用去離子水代替樣液；本底組中以去離子水代替水楊酸。試驗(yàn)時(shí)，加入H2O2后37 ℃水浴1 h，1 500 r/min離心6 min 后取上清液，以去離子水為參比，分別測(cè)定510 nm處吸光度。

按以下公式計(jì)算·OH清除率：

E={[A0-（A-A1）]/A0}×100%

式中，E為清除率；A0為空白組吸光度；A為樣品組的吸光度；A1為本底組的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)連翹黃酮類化合物含量的影響

從圖1可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高，黃酮類化合物的含量呈增加的趨勢(shì)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，黃酮類化合物的含量達(dá)到最高，再增加乙醇體積分?jǐn)?shù)時(shí)，含量反而減小，因此，確定提取的最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。出現(xiàn)這個(gè)現(xiàn)象可能是因?yàn)樵谝掖俭w積分?jǐn)?shù)較低時(shí)，黃酮類化合物沒(méi)有完全溶出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，溶出黃酮類化合物增多，但是當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時(shí)，溶出黃酮類化合物基本達(dá)到平衡，繼續(xù)增加乙醇體積分?jǐn)?shù)不能使更多的黃酮類化合物溶解。

2.2 微波功率對(duì)連翹黃酮類化合物含量的影響

由圖2可知，隨著微波功率的增加，連翹黃酮類化合物的含量也隨之增加，當(dāng)微波功率為250 W時(shí)，黃酮類化合物的含量接近最高，繼續(xù)增加微波功率時(shí)，黃酮類化合物的含量沒(méi)有明顯增加，因此確定最佳的提取功率為250 W。

2.3 微波時(shí)間對(duì)連翹黃酮類化合物含量的影響

由圖3可知，隨著微波時(shí)間的增加，連翹黃酮類化合物的含量也隨之增加，當(dāng)微波時(shí)間為5 min時(shí)，黃酮類化合物的含量接近最高，當(dāng)微波時(shí)間再增加時(shí)，黃酮類化合物的含量沒(méi)有明顯增加，因此確定最佳的微波時(shí)間為5 min。

2.4 不同料液比對(duì)連翹黃酮類化合物含量的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，微波功率為250 W，提取時(shí)間為5 min的條件下，不同料液比對(duì)連翹黃酮類化合物含量的影響如圖4所示。由圖4可知，在料液比為1∶20時(shí)，連翹黃酮類化合物含量達(dá)到峰值，因此確定最佳料液比為1∶20。

2.5 提取次數(shù)對(duì)連翹黃酮類化合物含量的影響

由圖5可知，隨著提取次數(shù)的增加，連翹黃酮類化合物的含量增加，當(dāng)提取次數(shù)為2時(shí)，黃酮類化合物的含量較高，繼續(xù)增加提取次數(shù)時(shí)，黃酮類化合物的含量無(wú)明顯增加。因此確定最佳的提取次數(shù)為2次。

2.6 抗氧化性

由圖6可知，連翹黃酮類化合物具有一定的清除羥自由基的能力，且清除率隨著提取液濃度增加而增大。

3 小結(jié)

根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果可知，連翹中含有豐富的黃酮類化合物，具有較強(qiáng)的抗氧化活性，是良好的天然抗氧化劑。明確了在微波條件下連翹中黃酮類化合物的最佳提取工藝為提取2次，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比為1∶20，微波功率250 W和提取時(shí)間5 min。連翹黃酮類化合物具有一定的清除羥自由基的能力。

參考文獻(xiàn)：

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2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)連翹黃酮類化合物含量的影響

從圖1可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高，黃酮類化合物的含量呈增加的趨勢(shì)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，黃酮類化合物的含量達(dá)到最高，再增加乙醇體積分?jǐn)?shù)時(shí)，含量反而減小，因此，確定提取的最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。出現(xiàn)這個(gè)現(xiàn)象可能是因?yàn)樵谝掖俭w積分?jǐn)?shù)較低時(shí)，黃酮類化合物沒(méi)有完全溶出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，溶出黃酮類化合物增多，但是當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時(shí)，溶出黃酮類化合物基本達(dá)到平衡，繼續(xù)增加乙醇體積分?jǐn)?shù)不能使更多的黃酮類化合物溶解。

2.2 微波功率對(duì)連翹黃酮類化合物含量的影響

由圖2可知，隨著微波功率的增加，連翹黃酮類化合物的含量也隨之增加，當(dāng)微波功率為250 W時(shí)，黃酮類化合物的含量接近最高，繼續(xù)增加微波功率時(shí)，黃酮類化合物的含量沒(méi)有明顯增加，因此確定最佳的提取功率為250 W。

2.3 微波時(shí)間對(duì)連翹黃酮類化合物含量的影響

由圖3可知，隨著微波時(shí)間的增加，連翹黃酮類化合物的含量也隨之增加，當(dāng)微波時(shí)間為5 min時(shí)，黃酮類化合物的含量接近最高，當(dāng)微波時(shí)間再增加時(shí)，黃酮類化合物的含量沒(méi)有明顯增加，因此確定最佳的微波時(shí)間為5 min。

2.4 不同料液比對(duì)連翹黃酮類化合物含量的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，微波功率為250 W，提取時(shí)間為5 min的條件下，不同料液比對(duì)連翹黃酮類化合物含量的影響如圖4所示。由圖4可知，在料液比為1∶20時(shí)，連翹黃酮類化合物含量達(dá)到峰值，因此確定最佳料液比為1∶20。

2.5 提取次數(shù)對(duì)連翹黃酮類化合物含量的影響

由圖5可知，隨著提取次數(shù)的增加，連翹黃酮類化合物的含量增加，當(dāng)提取次數(shù)為2時(shí)，黃酮類化合物的含量較高，繼續(xù)增加提取次數(shù)時(shí)，黃酮類化合物的含量無(wú)明顯增加。因此確定最佳的提取次數(shù)為2次。

2.6 抗氧化性

由圖6可知，連翹黃酮類化合物具有一定的清除羥自由基的能力，且清除率隨著提取液濃度增加而增大。

3 小結(jié)

根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果可知，連翹中含有豐富的黃酮類化合物，具有較強(qiáng)的抗氧化活性，是良好的天然抗氧化劑。明確了在微波條件下連翹中黃酮類化合物的最佳提取工藝為提取2次，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比為1∶20，微波功率250 W和提取時(shí)間5 min。連翹黃酮類化合物具有一定的清除羥自由基的能力。

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2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)連翹黃酮類化合物含量的影響

從圖1可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高，黃酮類化合物的含量呈增加的趨勢(shì)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，黃酮類化合物的含量達(dá)到最高，再增加乙醇體積分?jǐn)?shù)時(shí)，含量反而減小，因此，確定提取的最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。出現(xiàn)這個(gè)現(xiàn)象可能是因?yàn)樵谝掖俭w積分?jǐn)?shù)較低時(shí)，黃酮類化合物沒(méi)有完全溶出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，溶出黃酮類化合物增多，但是當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時(shí)，溶出黃酮類化合物基本達(dá)到平衡，繼續(xù)增加乙醇體積分?jǐn)?shù)不能使更多的黃酮類化合物溶解。

2.2 微波功率對(duì)連翹黃酮類化合物含量的影響

由圖2可知，隨著微波功率的增加，連翹黃酮類化合物的含量也隨之增加，當(dāng)微波功率為250 W時(shí)，黃酮類化合物的含量接近最高，繼續(xù)增加微波功率時(shí)，黃酮類化合物的含量沒(méi)有明顯增加，因此確定最佳的提取功率為250 W。

2.3 微波時(shí)間對(duì)連翹黃酮類化合物含量的影響

由圖3可知，隨著微波時(shí)間的增加，連翹黃酮類化合物的含量也隨之增加，當(dāng)微波時(shí)間為5 min時(shí)，黃酮類化合物的含量接近最高，當(dāng)微波時(shí)間再增加時(shí)，黃酮類化合物的含量沒(méi)有明顯增加，因此確定最佳的微波時(shí)間為5 min。

2.4 不同料液比對(duì)連翹黃酮類化合物含量的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，微波功率為250 W，提取時(shí)間為5 min的條件下，不同料液比對(duì)連翹黃酮類化合物含量的影響如圖4所示。由圖4可知，在料液比為1∶20時(shí)，連翹黃酮類化合物含量達(dá)到峰值，因此確定最佳料液比為1∶20。

2.5 提取次數(shù)對(duì)連翹黃酮類化合物含量的影響

由圖5可知，隨著提取次數(shù)的增加，連翹黃酮類化合物的含量增加，當(dāng)提取次數(shù)為2時(shí)，黃酮類化合物的含量較高，繼續(xù)增加提取次數(shù)時(shí)，黃酮類化合物的含量無(wú)明顯增加。因此確定最佳的提取次數(shù)為2次。

2.6 抗氧化性

由圖6可知，連翹黃酮類化合物具有一定的清除羥自由基的能力，且清除率隨著提取液濃度增加而增大。

3 小結(jié)

根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果可知，連翹中含有豐富的黃酮類化合物，具有較強(qiáng)的抗氧化活性，是良好的天然抗氧化劑。明確了在微波條件下連翹中黃酮類化合物的最佳提取工藝為提取2次，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比為1∶20，微波功率250 W和提取時(shí)間5 min。連翹黃酮類化合物具有一定的清除羥自由基的能力。

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