均勻設計在釀酒酵母電轉化條件研究中的應用

張啟聲+李珺+王翠峰+蔡祿

摘要：電穿孔方法是一種高效導入外源DNA的技術。通過電轉化法對酵母YPH 500進行外源DNA轉化，研究了電轉化中各因素對酵母轉化率的影響。結果表明，電場強度、外源DNA濃度、感受態細胞狀態對轉化率有明顯影響。采用均勻設計試驗，利用逐步回歸方法對試驗結果進行分析， 結果表明，當電場強度在1 750 V，酵母OD 600 nm在1.3，外源DNA濃度為7.5 mg/L時，酵母轉化率較高，約為24×102轉化子數/μg DNA。

關鍵詞：電轉化；釀酒酵母；均勻設計

中圖分類號：Q785；S963.32+7 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）03-0693-04

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一種模式生物，常常作為表達系統。近些年，研究者常利用它進行外源基因的表達或其他基因操作技術，所以外源基因的導入是進行試驗的先決條件。20世紀80年代，研究者開始利用電轉化法將外源DNA導入酵母細胞，該方法現已成為常用方法[1，2]。在轉化時，試驗結果往往受感受態細胞狀態、外源DNA濃度、電場強度等多個條件的影響，需要探索最佳電轉化率的條件。但其中涉及多因素、多水平的試驗，常規探索性試驗工作量較大。均勻設計具有試驗次數少，信息量大的優點，只需做少量試驗，建立數學模型，就可得到最佳的配比。本試驗將穿梭質粒通過電轉化到釀酒酵母YPH 500中，從中考察電場強度、外源DNA濃度和酵母細胞不同的生長狀態下3個因素對電轉化的影響，以期為釀酒酵母電轉化的應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

1.1.1 菌種和質粒 釀酒酵母YPH 500（遺傳背景：MATα ura3-52 lys2-801anber ade2-101ochre trp1-Δ63 his3-Δ200 leu2-Δ1）、穿梭質粒pRS405由美國新澤西州醫學院微生物學與分子遺傳學部Carol S. Newlon教授贈送。

1.1.2 培養基 YPD培養基：1%酵母粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖（固體培養基瓊脂含量1.5%）。SD篩選培養基：1.34%YNB，2%葡萄糖，2%瓊脂，氨基酸（ade、ure、trp、his、lys，均為20 mg/L），SD全營養培養基：在SD篩選培養基的基礎上加100 mg/L leu。

1.1.3 試劑與主要儀器 1 mol/L山梨醇（南京博爾迪生物科技有限公司）；DP103型小提試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]。2510型電轉儀、高速冷凍離心機（Eppendorf公司）；722型可見光分光光度計（上海馳唐電子有限公司）；紫外分光光度計（美國Merinton公司）；光學顯微鏡[OLYMPUS（中國）有限公司]。

1.2 試驗方法

1.2.1 酵母YPH 500生長曲線的測定 將凍存菌種在YPD固體培養基上劃線，30 ℃培養3～4 d。立即挑取單菌落接種于含有100 mL YPD液體培養基的250 mL錐形瓶中，30 ℃、180 r/min培養。每隔2 h取樣測定OD600 nm值，同時通過細胞計數板計數。繪制酵母菌生長曲線。

1.2.2 外源DNA的制備 在穿梭質粒pRS405上搭載酵母ARS304片段，導入大腸桿菌DH5α中儲存。采用DP103型小提試劑盒提取pRS405- ARS304質粒。將所得產物用紫外分光光度計測量質粒含量。

1.2.3 感受態細胞的制備 挑取活化好的酵母單菌落接種于含有50 mL YPD液體培養基的250 mL錐形瓶中，30 ℃ 180 r/min培養。將培養好的細胞冰上放置10 min，倒入50 mL離心管中，4 ℃、1 300 r/min離心5 min。去掉培養液，用50 mL預冷的無菌水將菌體沉淀重懸，重復此步驟，洗滌2遍。再加入10 mL冰冷的1 mol/L山梨醇重懸菌體。最后加入1 mL冰冷的1 mol/L山梨醇。

1.2.4 電轉化單因素驗證 將制備好的不同時期感受態細胞、外源DNA分別混勻進行以下處理，電轉化體系均為60 μL。①外源DNA 濃度5.0 mg/L，取不同感受態細胞的OD600 nm（0.2、0.4、0.7、1.1、1.3、1.4、1.5）進行處理，感受態細胞用量80 μL，電場強度1 500 V；②感受態細胞OD600 nm為 1.1，用量為80 μL，取不同外源DNA濃度（0.25、1.25、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 mg/L ）進行處理，電場強度1 500 V；③感受態細胞OD600 nm 為1.1，外源DNA濃度5.0 mg/L，取不同電場強度（600、900、1 200、1 500、1 800、2 100、2 400 V）進行處理。將反應液在冰上加入到空管中混勻，轉移到電轉杯中進行電轉化。

1.2.5 電轉化均勻試驗 確定所要研究的感受態細胞狀態、外源DNA濃度、電場強度3個因素的不同水平，根據均勻設計[2]進行試驗，試驗因素和水平見表1。

1.2.6 電轉化效果評價 將轉化產物加入1 mol/L 冰冷的山梨醇溶液中進行洗滌。高速離心5 s去部分上清，輕柔混勻后涂布于SD篩選培養基上。每個試驗3次重復，其中對照組分別涂布于SD 篩選培養基和SD全營養培養基上。30 ℃培養4 d，統計平板菌落個數。計算轉化率，評價每組試驗效果[3]，其定義如下：

轉化率=轉化子/外源DNA量×稀釋倍數。

2 結果與分析

2.1 外源DNA的制備

將酵母YPH 500中的ARS304片段進行克隆，通過 BamHⅠ和SacⅠ進行雙酶切后搭載于穿梭質粒pRS405上形成pRS405-ARS，該質粒結構如圖1所示。

在轉化時，環狀質粒線性化便于整合到宿主細胞基因組中從而提高轉化率[4]。pRS405作為穿梭質粒，在一定條件下可以帶ARS304自由穿梭于原核生物和真核生物中，ARS（Autonomously replicating sequence）為酵母染色質復制所依賴的順式作用元件，ARS序列可提高導入質粒的復制活性，減少質粒丟失率，同時少部分可整合到基因組中并隨基因組復制，所以目的基因不需要線性化。該質粒攜帶有亮氨酸基因，可在亮氨酸缺陷性酵母菌株中篩選。

2.2 酵母YPH 500生長曲線的測定

由酵母YPH 500細胞數量和OD600 nm可以看出（圖2），在30 ℃、180 r/min的條件下培養，酵母YPH 500在16～26 h可達到對數期，其OD600 nm為0.2～1.5，酵母YPH 500數量約為3.86×1011～5.04×1012個/mL。其中在28 h之后酵母數量與OD600 nm沒有相關性。

2.3 酵母YPH 500不同的生長狀態對電轉化效果的影響

酵母菌生長狀態對轉化率的影響主要是由于分裂時酵母細胞壁的結構發生變化[5]。在電壓1 500 V、外源DNA濃度5.0 mg/L的條件下，取處于不同階段（OD600 nm為0.2～1.5）的酵母YPH 500感受態細胞80 μL進行電轉化。通過統計發現，不同階段的感受態細胞對轉化率的影響差異較大，在對數初期和對數末期效率較低，是由于在初期菌量較少，外源DNA進入細胞的概率較小，而在對數末期其細胞壁較為致密不利于電穿孔。所以酵母菌生長狀態主要受2個因素控制，即細胞數和細胞壁的結構。其中OD600 nm為1.3時的酵母YPH 500細胞電轉化率最高，達到19.5×102轉化子數/μg DNA（圖3）。

2.4 外源DNA濃度對酵母電轉化效果的影響

在電壓為1 500 V，感受態細胞OD600 nm為1.1，用量為80 μL的條件下，分別加入不同濃度的外源DNA進行電轉化。結果如圖4所示，當外源DNA濃度在7.5 mg/L時轉化率最高，但在2.5～10.0 mg/L 的范圍內其轉化率差異較小。當外源DNA濃度較少時，有效電擊會減少[6]，而當量多時反應原理尚未弄清。有研究者猜想[7]可能是由于DNA較多時，會對細胞表面點位造成影響或者是由于堵塞轉化孔道所致。當外源DNA量低于2.5 mg/L或高于10.0 mg/L時其轉化率明顯下降。本試驗中，外源DNA在一定范圍內（2.5～10.0 mg/L）酵母電轉化率變化不大，而超出此范圍，轉化率則明顯減少。

2.5 電場強度對酵母電轉化效果的影響

采用1 mm寬度的電轉化杯，在OD600 nm為1.1的感受態細胞，用量為80 μL，外源DNA 濃度5.0 mg/L的條件下，分別施以不同的電壓進行電轉化，結果如圖5所示。在不同電壓下酵母轉化率差異較大，其中在電場強度為1 500 V時轉化率最高，1 800 V時次之，當電場強度大于1 800 V時，會造成細胞形成難以自愈的較大孔道，細胞內大分子容易溢出，造成細胞死亡，轉化率下降。而當電場強度過小時，在細胞表面形成的孔道較小，外源DNA難以進入，使轉化率降低。在本試驗中電場強度對酵母轉化率的影響較為明顯，其閾值范圍較小（1 500～1 800 V），超出此范圍，酵母轉化率明顯降低。

2.6 均勻設計試驗結果

為進一步探討電場強度、外源DNA濃度、感受態細胞狀態3個參數及其交互作用對酵母電轉化率的影響，以轉化率為考核指標進行優化試驗。優化試驗結果見表2。

利用SPSS 17.0數據處理軟件對試驗數據進行回歸分析處理，得到轉化率與各因素的回歸方程為：Y=321.4+46.75X1-32.54X2-12.9X3-26.151X12+103.48X22+1 343.5X32。其中相關系數R為0.999 9，F值為987，作F 檢驗，F>F0.05（8，1）=238.9，回歸方程顯著。將試驗中的數據通過回歸方程進行預測，結果如表3所示，觀測值與擬合值誤差較小，準確度高。通過單因素分析，其通徑系數為X1（0.827 6）>X3（-0.364 9）>X2（-0.283 4）。在3個參數中，感受態細胞狀態對酵母轉化率的影響最大，電場強度次之，外源DNA濃度最小。通過對回歸方程進行極值分析，發現酵母感受態細胞OD600 nm為1.3，電場強度為1 750 V，外源DNA濃度為7.5 mg/L時可得到較高的電轉化效率，約為24×102轉化子數/μg DNA。

3 小結與討論

本試驗通過電場強度、外源DNA濃度、感受態細胞狀態進行單因素試驗，發現各因素對酵母電轉化率的影響較大，其中酵母感受態細胞OD600 nm達到1.3，電場強度達1 500～1 800V，DNA濃度達到7.5 mg/L時可在各自水平中取得較好的試驗結果。

對以上3個因素進行均勻設計，研究各因素的交互作用對酵母轉化率的影響，發現3個因素對酵母轉化率的影響各不相同，感受態細胞狀態影響最大，電場強度次之，外源DNA濃度最小。通過對回歸方程的極值運算，可預測酵母感受態細胞OD600 nm達到1.3，電場強度達到1 750 V，外源DNA濃度達到7.5 mg/L時可得到較高的電轉化效率。本研究結果表明電轉化效率的條件優化利用均勻設計試驗簡單、可信度較高。如果加入其他條件的研究，將大大降低試驗組數，節省試驗材料。

參考文獻：

[1] HASHIMOTO H， MORIJAWA H， YAMATA Y， et al. A novel method for transformation of intact yeast cells by electroinjection of plasmid DNA[J]. Applied Microbiol Biotechnol，1985， 21（5）：336-339.

[2] 方開泰.均勻設計與均勻設計表[M].北京：科學出版社，1994. 13-17.

[3] 劉秀蓮，王宇光，雷祿旺. 海洋紅酵母電轉化條件的研究[J].生命科學研究，2008，12（2）：136-140.

[4] 秦玉靜，金建玲，鮑曉明，等.影響釀酒酵母電擊轉化率的條件[J]. 山東大學學報（自然科學版），1999，34（2）：236-240.

[5] BECHER D M， GUARENTE L. High-efficiency transformation of yeast by electroporation[J]. Methods Enzymol，1991，194：182-187.

[6] MEIHOC E， MASSON J M， TEISSIE J. High efficiency transformation of intact yeast cellls by electric field pulses[J].Biotechnol，1990，8：223-227.

[7] HICKS J B， HINNEN A， FINK G P. Properties of Yeast Transformation[M]. New York： Cold Spring Harbor Laboratory Press，1978.

在轉化時，環狀質粒線性化便于整合到宿主細胞基因組中從而提高轉化率[4]。pRS405作為穿梭質粒，在一定條件下可以帶ARS304自由穿梭于原核生物和真核生物中，ARS（Autonomously replicating sequence）為酵母染色質復制所依賴的順式作用元件，ARS序列可提高導入質粒的復制活性，減少質粒丟失率，同時少部分可整合到基因組中并隨基因組復制，所以目的基因不需要線性化。該質粒攜帶有亮氨酸基因，可在亮氨酸缺陷性酵母菌株中篩選。

2.2 酵母YPH 500生長曲線的測定

由酵母YPH 500細胞數量和OD600 nm可以看出（圖2），在30 ℃、180 r/min的條件下培養，酵母YPH 500在16～26 h可達到對數期，其OD600 nm為0.2～1.5，酵母YPH 500數量約為3.86×1011～5.04×1012個/mL。其中在28 h之后酵母數量與OD600 nm沒有相關性。

2.3 酵母YPH 500不同的生長狀態對電轉化效果的影響

酵母菌生長狀態對轉化率的影響主要是由于分裂時酵母細胞壁的結構發生變化[5]。在電壓1 500 V、外源DNA濃度5.0 mg/L的條件下，取處于不同階段（OD600 nm為0.2～1.5）的酵母YPH 500感受態細胞80 μL進行電轉化。通過統計發現，不同階段的感受態細胞對轉化率的影響差異較大，在對數初期和對數末期效率較低，是由于在初期菌量較少，外源DNA進入細胞的概率較小，而在對數末期其細胞壁較為致密不利于電穿孔。所以酵母菌生長狀態主要受2個因素控制，即細胞數和細胞壁的結構。其中OD600 nm為1.3時的酵母YPH 500細胞電轉化率最高，達到19.5×102轉化子數/μg DNA（圖3）。

2.4 外源DNA濃度對酵母電轉化效果的影響

在電壓為1 500 V，感受態細胞OD600 nm為1.1，用量為80 μL的條件下，分別加入不同濃度的外源DNA進行電轉化。結果如圖4所示，當外源DNA濃度在7.5 mg/L時轉化率最高，但在2.5～10.0 mg/L 的范圍內其轉化率差異較小。當外源DNA濃度較少時，有效電擊會減少[6]，而當量多時反應原理尚未弄清。有研究者猜想[7]可能是由于DNA較多時，會對細胞表面點位造成影響或者是由于堵塞轉化孔道所致。當外源DNA量低于2.5 mg/L或高于10.0 mg/L時其轉化率明顯下降。本試驗中，外源DNA在一定范圍內（2.5～10.0 mg/L）酵母電轉化率變化不大，而超出此范圍，轉化率則明顯減少。

2.5 電場強度對酵母電轉化效果的影響

采用1 mm寬度的電轉化杯，在OD600 nm為1.1的感受態細胞，用量為80 μL，外源DNA 濃度5.0 mg/L的條件下，分別施以不同的電壓進行電轉化，結果如圖5所示。在不同電壓下酵母轉化率差異較大，其中在電場強度為1 500 V時轉化率最高，1 800 V時次之，當電場強度大于1 800 V時，會造成細胞形成難以自愈的較大孔道，細胞內大分子容易溢出，造成細胞死亡，轉化率下降。而當電場強度過小時，在細胞表面形成的孔道較小，外源DNA難以進入，使轉化率降低。在本試驗中電場強度對酵母轉化率的影響較為明顯，其閾值范圍較小（1 500～1 800 V），超出此范圍，酵母轉化率明顯降低。

2.6 均勻設計試驗結果

為進一步探討電場強度、外源DNA濃度、感受態細胞狀態3個參數及其交互作用對酵母電轉化率的影響，以轉化率為考核指標進行優化試驗。優化試驗結果見表2。

利用SPSS 17.0數據處理軟件對試驗數據進行回歸分析處理，得到轉化率與各因素的回歸方程為：Y=321.4+46.75X1-32.54X2-12.9X3-26.151X12+103.48X22+1 343.5X32。其中相關系數R為0.999 9，F值為987，作F 檢驗，F>F0.05（8，1）=238.9，回歸方程顯著。將試驗中的數據通過回歸方程進行預測，結果如表3所示，觀測值與擬合值誤差較小，準確度高。通過單因素分析，其通徑系數為X1（0.827 6）>X3（-0.364 9）>X2（-0.283 4）。在3個參數中，感受態細胞狀態對酵母轉化率的影響最大，電場強度次之，外源DNA濃度最小。通過對回歸方程進行極值分析，發現酵母感受態細胞OD600 nm為1.3，電場強度為1 750 V，外源DNA濃度為7.5 mg/L時可得到較高的電轉化效率，約為24×102轉化子數/μg DNA。

3 小結與討論

本試驗通過電場強度、外源DNA濃度、感受態細胞狀態進行單因素試驗，發現各因素對酵母電轉化率的影響較大，其中酵母感受態細胞OD600 nm達到1.3，電場強度達1 500～1 800V，DNA濃度達到7.5 mg/L時可在各自水平中取得較好的試驗結果。

對以上3個因素進行均勻設計，研究各因素的交互作用對酵母轉化率的影響，發現3個因素對酵母轉化率的影響各不相同，感受態細胞狀態影響最大，電場強度次之，外源DNA濃度最小。通過對回歸方程的極值運算，可預測酵母感受態細胞OD600 nm達到1.3，電場強度達到1 750 V，外源DNA濃度達到7.5 mg/L時可得到較高的電轉化效率。本研究結果表明電轉化效率的條件優化利用均勻設計試驗簡單、可信度較高。如果加入其他條件的研究，將大大降低試驗組數，節省試驗材料。

參考文獻：

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[3] 劉秀蓮，王宇光，雷祿旺. 海洋紅酵母電轉化條件的研究[J].生命科學研究，2008，12（2）：136-140.

[4] 秦玉靜，金建玲，鮑曉明，等.影響釀酒酵母電擊轉化率的條件[J]. 山東大學學報（自然科學版），1999，34（2）：236-240.

[5] BECHER D M， GUARENTE L. High-efficiency transformation of yeast by electroporation[J]. Methods Enzymol，1991，194：182-187.

[6] MEIHOC E， MASSON J M， TEISSIE J. High efficiency transformation of intact yeast cellls by electric field pulses[J].Biotechnol，1990，8：223-227.

[7] HICKS J B， HINNEN A， FINK G P. Properties of Yeast Transformation[M]. New York： Cold Spring Harbor Laboratory Press，1978.

在轉化時，環狀質粒線性化便于整合到宿主細胞基因組中從而提高轉化率[4]。pRS405作為穿梭質粒，在一定條件下可以帶ARS304自由穿梭于原核生物和真核生物中，ARS（Autonomously replicating sequence）為酵母染色質復制所依賴的順式作用元件，ARS序列可提高導入質粒的復制活性，減少質粒丟失率，同時少部分可整合到基因組中并隨基因組復制，所以目的基因不需要線性化。該質粒攜帶有亮氨酸基因，可在亮氨酸缺陷性酵母菌株中篩選。

2.2 酵母YPH 500生長曲線的測定

由酵母YPH 500細胞數量和OD600 nm可以看出（圖2），在30 ℃、180 r/min的條件下培養，酵母YPH 500在16～26 h可達到對數期，其OD600 nm為0.2～1.5，酵母YPH 500數量約為3.86×1011～5.04×1012個/mL。其中在28 h之后酵母數量與OD600 nm沒有相關性。

2.3 酵母YPH 500不同的生長狀態對電轉化效果的影響

酵母菌生長狀態對轉化率的影響主要是由于分裂時酵母細胞壁的結構發生變化[5]。在電壓1 500 V、外源DNA濃度5.0 mg/L的條件下，取處于不同階段（OD600 nm為0.2～1.5）的酵母YPH 500感受態細胞80 μL進行電轉化。通過統計發現，不同階段的感受態細胞對轉化率的影響差異較大，在對數初期和對數末期效率較低，是由于在初期菌量較少，外源DNA進入細胞的概率較小，而在對數末期其細胞壁較為致密不利于電穿孔。所以酵母菌生長狀態主要受2個因素控制，即細胞數和細胞壁的結構。其中OD600 nm為1.3時的酵母YPH 500細胞電轉化率最高，達到19.5×102轉化子數/μg DNA（圖3）。

2.4 外源DNA濃度對酵母電轉化效果的影響

在電壓為1 500 V，感受態細胞OD600 nm為1.1，用量為80 μL的條件下，分別加入不同濃度的外源DNA進行電轉化。結果如圖4所示，當外源DNA濃度在7.5 mg/L時轉化率最高，但在2.5～10.0 mg/L 的范圍內其轉化率差異較小。當外源DNA濃度較少時，有效電擊會減少[6]，而當量多時反應原理尚未弄清。有研究者猜想[7]可能是由于DNA較多時，會對細胞表面點位造成影響或者是由于堵塞轉化孔道所致。當外源DNA量低于2.5 mg/L或高于10.0 mg/L時其轉化率明顯下降。本試驗中，外源DNA在一定范圍內（2.5～10.0 mg/L）酵母電轉化率變化不大，而超出此范圍，轉化率則明顯減少。

2.5 電場強度對酵母電轉化效果的影響

采用1 mm寬度的電轉化杯，在OD600 nm為1.1的感受態細胞，用量為80 μL，外源DNA 濃度5.0 mg/L的條件下，分別施以不同的電壓進行電轉化，結果如圖5所示。在不同電壓下酵母轉化率差異較大，其中在電場強度為1 500 V時轉化率最高，1 800 V時次之，當電場強度大于1 800 V時，會造成細胞形成難以自愈的較大孔道，細胞內大分子容易溢出，造成細胞死亡，轉化率下降。而當電場強度過小時，在細胞表面形成的孔道較小，外源DNA難以進入，使轉化率降低。在本試驗中電場強度對酵母轉化率的影響較為明顯，其閾值范圍較?。? 500～1 800 V），超出此范圍，酵母轉化率明顯降低。

2.6 均勻設計試驗結果

為進一步探討電場強度、外源DNA濃度、感受態細胞狀態3個參數及其交互作用對酵母電轉化率的影響，以轉化率為考核指標進行優化試驗。優化試驗結果見表2。

利用SPSS 17.0數據處理軟件對試驗數據進行回歸分析處理，得到轉化率與各因素的回歸方程為：Y=321.4+46.75X1-32.54X2-12.9X3-26.151X12+103.48X22+1 343.5X32。其中相關系數R為0.999 9，F值為987，作F 檢驗，F>F0.05（8，1）=238.9，回歸方程顯著。將試驗中的數據通過回歸方程進行預測，結果如表3所示，觀測值與擬合值誤差較小，準確度高。通過單因素分析，其通徑系數為X1（0.827 6）>X3（-0.364 9）>X2（-0.283 4）。在3個參數中，感受態細胞狀態對酵母轉化率的影響最大，電場強度次之，外源DNA濃度最小。通過對回歸方程進行極值分析，發現酵母感受態細胞OD600 nm為1.3，電場強度為1 750 V，外源DNA濃度為7.5 mg/L時可得到較高的電轉化效率，約為24×102轉化子數/μg DNA。

3 小結與討論

本試驗通過電場強度、外源DNA濃度、感受態細胞狀態進行單因素試驗，發現各因素對酵母電轉化率的影響較大，其中酵母感受態細胞OD600 nm達到1.3，電場強度達1 500～1 800V，DNA濃度達到7.5 mg/L時可在各自水平中取得較好的試驗結果。

對以上3個因素進行均勻設計，研究各因素的交互作用對酵母轉化率的影響，發現3個因素對酵母轉化率的影響各不相同，感受態細胞狀態影響最大，電場強度次之，外源DNA濃度最小。通過對回歸方程的極值運算，可預測酵母感受態細胞OD600 nm達到1.3，電場強度達到1 750 V，外源DNA濃度達到7.5 mg/L時可得到較高的電轉化效率。本研究結果表明電轉化效率的條件優化利用均勻設計試驗簡單、可信度較高。如果加入其他條件的研究，將大大降低試驗組數，節省試驗材料。

參考文獻：

[1] HASHIMOTO H， MORIJAWA H， YAMATA Y， et al. A novel method for transformation of intact yeast cells by electroinjection of plasmid DNA[J]. Applied Microbiol Biotechnol，1985， 21（5）：336-339.

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