甘遂在不同配伍中大戟二烯醇的含量變化研究

錢金梅，閻改香

(山西省人民醫(yī)院，山西 太原 030012)

黃仰模等［1］在《金匱要略講義》中講解了甘遂半夏湯，方由甘遂、半夏、芍藥、甘草、白蜜組成，張仲景用之治療留飲。方中甘遂降逆，攻逐飲邪，善行腸間經(jīng)隧之飲邪;半夏燥濕醒脾，化飲降逆，宣暢氣機(jī);芍藥補(bǔ)血益陰緩急;甘草益氣和中;蜜性甘緩，益氣和中，緩和甘遂與甘草之相反［2］。方中甘遂配伍甘草為配伍禁忌，但從古至今不斷有醫(yī)家報(bào)道配伍使用后無明顯毒副作用［3］。以往對(duì)甘遂半夏湯的研究主要以臨床應(yīng)用為主，對(duì)其中化學(xué)成分的研究以含量變化為指標(biāo)的少，同時(shí)，對(duì)甘遂的研究主要集中在藥物炮制、化學(xué)成分分析以及藥理作用等方面。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)單味甘遂、對(duì)藥甘遂－甘草和甘遂半夏湯中大戟二烯醇的含量變化進(jìn)行研究，以確定甘遂半夏湯中甘草等對(duì)大戟二烯醇溶出程度的影響，為臨床合理應(yīng)用甘遂半夏湯提供可靠依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

高效液相色譜系統(tǒng):Altech 426HPLC Pump，UVIS-201型二極管陣列檢測(cè)器，色譜柱為Dikma Diamonsil C8 色譜柱(200 mm ×4.6 mm，5 μm)。天平:METTLERTOLEDO AB135-S型十萬分之一天平，HANPING FA2104型萬分之一電子天平(上海精科天平);KQ-500型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 藥物與試劑

甘遂、甘草(甘肅)安國市康達(dá)中藥材有限公司，半夏(四川)毫州市萬珍中藥飲片廠，白芍(安徽)安國市神禾中藥材飲片有限責(zé)任公司，大戟二烯醇標(biāo)準(zhǔn)品(購于中國藥品生物制品，批號(hào):111866-201001)，甲醇(分析純，天津市進(jìn)豐化工有限公司)，乙酸乙酯(分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司)，乙腈(色譜純，美國)，純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)。

圖1 光譜圖Fig.1 Chroma Togram Map

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Dikma Diamonsil C8色譜柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相:乙 腈 － 水 (94∶6)，流速:1.00 mL·min－1，檢測(cè)波長:210 nm(見圖1)，進(jìn)樣量:10 μL，柱溫:室溫。在此色譜條件下，各種供試品溶液大戟二烯醇與其他成分的分離度良好(見圖2～6)。

圖2 大戟二烯醇對(duì)照品色譜圖Fig.2 Chromatogram Map of Euphadienol Controls

圖3 生甘遂色譜圖Fig.3 Chromatogram Map of Raw Kansui

圖4 單藥色譜圖Fig.4 Chromatogram Map of Single Drug

圖5 對(duì)藥色譜圖Fig.5 Chromatograms Map of Medicine

圖6 群藥色譜圖Fig.6 Chromatogram Map of Groups of Medicine

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取對(duì)照品大戟二烯醇12.00 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得1.2 mg·mL－1的大戟二烯醇對(duì)照品溶液，作為母液備用。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 生甘遂供試品溶液 取本品粉末(過四號(hào)篩)約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入乙酸乙酯25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率50 KHz)40 min，放冷，再稱定重量，用乙酸乙酯補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.3.2 甘遂單煎液 稱取甘遂藥材約2 g，精密稱定，用量筒量取220 mL水，浸泡30 min，回流提取2次，每次30 min，紗布過濾，合并濾液。將濾液置于燒杯中，濃縮至100 mL，藥液放冷，加水飽和乙酸乙酯萃取4次，每次50 mL，合并萃取液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移到5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.3.3 甘遂－甘草對(duì)煎液 稱取甘遂約2 g、炙甘草約4 g，精密稱定，用量筒量取220 mL水，浸泡30 min，回流提取2次，每次30 min，紗布過濾，合并濾液。將濾液置于燒杯中，濃縮至100 mL，藥液放冷，加水飽和乙酸乙酯萃取4次，每次50 mL，合并萃取液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移到5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.3.4 甘遂半夏湯煎液 稱取甘遂約2 g、炙甘草約4 g、半夏約6 g、白芍約10 g，精密稱定，用量筒量取220 mL水，浸泡30 min，回流提取2次，每次30 min，紗布過濾，合并濾液。將濾液置于燒杯中，濃縮至100 mL，藥液放冷，加水飽和乙酸乙酯萃取4次，每次50 mL，合并萃取液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移到5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 將母液加甲醇分別稀釋至0.12 mg·mL－1，0.24 mg·mL－1，0.48 mg·mL－1，0.60 mg·mL－1，0.96 mg·mL－1，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過后，作為對(duì)照品溶液備用。

精密吸取對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下 HPLC色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積(數(shù)據(jù)見表1)，以對(duì)照品溶液的峰面積為縱坐標(biāo)，以加入的對(duì)照品量為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，作一直線，見圖7。回歸方程為y=32 180x+2 155.4，相關(guān)系數(shù)r=0.999 1。結(jié)果表明大戟二烯醇的進(jìn)樣量在1.2 ～12 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果HuTable 1 Investigation Results of Linear Relation Hu

圖7 大戟二烯醇線性關(guān)系圖Fig.7 Relationship Map of Euphadienol Controls

2.4.2 精密度考察 取濃度為0.48 mg·mL－1的大戟二烯醇對(duì)照品溶液10 μL，按照“2.1”項(xiàng)下 HPLC色譜條件進(jìn)樣，重復(fù)進(jìn)樣6次，以大戟二烯醇峰面積積分值為指標(biāo)測(cè)定其精密度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果 HuTable 2 Test Results of Precision Hu

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，6次測(cè)定值的RSD為2.58%，精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性考察 分別取同一濃度供試品溶液(生甘遂供試品溶液、甘遂單煎液、甘草－甘遂對(duì)煎液、甘遂半夏湯煎液)分別于0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，10 h進(jìn)樣分析，記錄峰面積，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)HuTable 3 Experiment Results of Stability(n=6) Hu

結(jié)果表明4種供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，RSD 分別為2.73%、1.12%、2.21%、0.68%。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 分別取生甘遂、甘遂單煎液、對(duì)藥甘遂－甘草和甘遂半夏湯各6份，按供試品溶液的制備方法制備樣品溶液，進(jìn)行HPLC測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)mg/gTable 4 Experiment Results of Repeatability(n=6) mg/g

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，各種供試品溶液測(cè)定結(jié)果的RSD值測(cè)分別為2.44%、2.24%、1.88%、2.82%。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知煎出率的單味甘遂藥材、對(duì)藥甘遂－甘草藥材、群藥材各6份，每份約相當(dāng)于甘遂1 g，精密稱定，分別加入大戟二烯醇對(duì)照品，按供試品溶液測(cè)定方法操作，計(jì)算回收率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 加樣回收率Table 5 Recovery Rate

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，本方法分析誤差較小，回收率高， 方法可靠，各種供試品溶液測(cè)定結(jié)果的RSD值分別為1.27%、0.85%、1.57%。

3 討論

3.1 提取方法的選擇

實(shí)驗(yàn)考查了萃取法、干膏超聲提取法、水提醇沉法3種方法，其中水提醇沉法提取后，儀器根本檢測(cè)不出大戟二烯醇;干膏超聲提取時(shí)考察了兩種溶劑，用甲醇作溶劑時(shí)，制進(jìn)樣后柱壓升高太多，用乙酸乙酯作溶劑時(shí)進(jìn)樣后不出峰，因?yàn)榇┩噶Σ粡?qiáng);最后采取萃取法，此法有效成分提取效果最佳。

3.2 萃取方法的選擇

在進(jìn)行樣品提取時(shí)，需要用乙酸乙酯進(jìn)行少量多次萃取。在萃取過程中，常常出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，尤其在甘遂半夏湯的藥液萃取過程中乳化程度比較嚴(yán)重。為減少乳化層，采用了如下方法進(jìn)行解決:a)將分液漏斗置于鐵架臺(tái)上靜置時(shí)，用玻璃棒攪動(dòng)乳化層，乳化層減少不明顯。b)在萃取液中加入少量無水Na2SO4晶體并用玻璃棒輕輕攪動(dòng)乳化層，乳化層的減少并不明顯。c)用吸管吸取少量甲醇，伸入乳化層滴兩滴后，用玻璃棒輕輕攪動(dòng)乳化層，同時(shí)用電吹風(fēng)吹乳化層，效果仍不理想。d)將分液漏斗下端用塑料包好，放入超聲波清洗器中超聲數(shù)分鐘，乳化層幾乎沒有變化。e)將最后一次萃取時(shí)的乳化層留在分液漏斗中，往其中加入50 mL蒸餾水，乳化層變薄，借助電吹風(fēng)吹乳化層，基本可消除乳化。

3.3 色譜條件的選擇

大戟二烯醇屬于三萜類化合物，本實(shí)驗(yàn)采用鍵合相極性較高的 C8柱(200 mm ×4.6 mm，5 μm) ，以流動(dòng)相為乙腈 －水(95∶5)進(jìn)行洗脫，檢測(cè)波長為210 nm［5］，柱溫為室溫，樣品中被測(cè)成分大戟二烯醇峰分離不完全。為出現(xiàn)較好的色譜峰型，改變流動(dòng)相的比例，以流動(dòng)相乙腈－水(94∶6)，柱溫為室溫進(jìn)行測(cè)定，峰形較好，分離較完全。

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明古代醫(yī)家所言甘草與甘遂相反是正確的，張仲景創(chuàng)立的甘遂半夏湯也有其妙處，甘遂與甘草合用后再加入半夏、白芍，緩和了甘遂甘草合用產(chǎn)生的毒性。

近年來，市面上出現(xiàn)了單味中藥的顆粒劑，為了患者方便服用，根據(jù)處方即可直接將單味顆粒合并沖服，是否對(duì)療效有太多影響有待進(jìn)一步研究。

［1］黃仰模，陳國權(quán)，喬 模，等.金貴要略講義［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2003.

［2］高永強(qiáng).甘遂半夏湯方解隨想［J］.國醫(yī)論壇，2009，24(3):3-4.

［3］楊志軍，鄧 毅，王 昕，等.甘遂與甘草配伍對(duì)小鼠肝臟組織中MDA、GSH-PX影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中醫(yī)研究，2006，19(7):15-16.

［4］程顯隆，肖新月，李廣華，等.甘遂中大戟二烯醇和表大戟二烯醇的含量測(cè)定［J］.藥物分析雜志，2009，29(9):1444-1447.

［5］中華人民共和國藥典編委會(huì).中華人民共和國藥典一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010.