烏司他丁對大鼠呼吸機相關性肺損傷的影響

戚志超，朱小兵，劉志群，吳論，常龍海

(中山市中醫院麻醉科，廣東中山528411)

·論著·

烏司他丁對大鼠呼吸機相關性肺損傷的影響

戚志超，朱小兵，劉志群，吳論，常龍海

(中山市中醫院麻醉科，廣東中山528411)

目的評價烏司他丁對大鼠呼吸機相關性肺損傷(VILI)的影響及機制。方法36只成年雄性SD大鼠，體重300～350 g，隨機分為三組(n=12)：對照組(C組)、機械通氣組(V組)和烏司他丁組(U組)。采用大潮氣量(VT=40 ml/kg)機械通氣2.5 h制備大鼠VILI模型。U組實驗前30 min腹腔注射烏司他丁10 000 U/100 g，V組和C組給予等容量生理鹽水。實驗結束時抽取3 ml動脈血離心取上清液，置于-80℃冰箱凍存待測。然后處死大鼠，取肺組織，測定肺組織濕/干重(W/D)比，光鏡下觀察肺組織病理學結果；收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)并測定其中的蛋白含量、白細胞計數以及采用雙抗體夾心ELISA法測定血清和BALF中腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素8(IL-8)的水平。計算肺的通透指數(LPI)。結果與C組比較，V組血清TNF-α、IL-8濃度，肺組織TNF-α、IL-8含量、W/D比、LPI、白細胞顯著升高(P＜0.05)；與V組比較，U組血清TNF-α、IL-8濃度，肺組織TNF-α、IL-8含量、W/D比、LPI、白細胞顯著減少(P＜0.05)。U組肺組織病理學損傷較V組減輕。結論烏司他丁可減輕VILI，其機制與抑制炎性反應有關。

烏司他丁；肺損傷；呼吸窘迫綜合征；成人；炎性細胞因子

呼吸機相關性肺損傷(Ventilator induced lung injury，VILI)是由機械通氣引起的嚴重肺部并發癥，探索減輕VILI的有效措施，具有重要的臨床意義。近年來的研究證明，VILI不僅是一種機械性的損傷，還是一種生物傷；肺內異常激活和放大的炎癥反應，即生物傷才是VILI的基礎[1-2]。烏司他丁(Ulinastatin)是一種廣譜蛋白酶抑制劑，能抑制多種蛋白、糖和脂類水解酶的活性，減少炎性介質的過度釋放，改善微循環和組織灌注[3]，但其對呼吸機相關性肺損傷的影響有待于進一步研究。本研究通過動物實驗擬評價烏司他丁對大鼠VILI的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 動物選擇及分組成年雄性SD大鼠36只(廣東省醫學實驗動物中心提供)，體重300～350 g，隨機分為三組(n=12)：對照組(C組)，不行機械通氣；機械通氣組(V組)；烏司他丁組(U組)。U組于實驗前30 min給予腹腔注射烏司他丁1萬U/100 g(廣東天普生化醫藥股份有限公司批號：031012052)，V組和C組給予等容量生理鹽水。

1.2 VILI模型的制備根據何海軍等[4]的實驗方法，制備大鼠VILI模型。20%烏拉坦溶液(1.4 g/kg)腹腔注射麻醉，22#動脈穿刺針行股動脈和股靜脈穿刺置管，股動脈連接8500Q小動物生理監測儀(CSl公司，美國)；靜脈輸注乳酸鈉林格氏液10 ml·kg-1·h-1；完成氣管切開并置入氣管導管，機械通氣2.5 h。呼吸參數設置：潮氣量(VT)=40 ml/kg，呼吸頻率(RR)= 40次/min，吸呼比(I:E)=1:1，吸入氧濃度(FiO2)= 21%。實驗過程中維持室溫26℃～28℃。

1.3 標本采集及處理實驗結束時抽取3 ml動脈血；然后處死大鼠，立即開胸小心分離兩側肺組織，分離氣管并結扎右側主支氣管，取出右肺上葉放入4%中性甲醛中固定24 h，剩余右肺組織稱濕重(W)，然后放入80℃電熱恒溫干燥箱烘烤至恒重后稱干重(D)，計算肺組織W/D比。用冰生理鹽水對左肺進行肺泡灌洗，2 ml×3次，收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)，將BALF和動脈血離心(15 min，4℃)，分別留取上清液及細胞沉淀，上清液置于-80℃冰箱凍存待測。BALF上清液及血清，以全自動生化分析儀測定其中的蛋白含量，計算兩者比值，即是肺的通透指數(Lung permeability index，LPI)。BALF沉渣用預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋，瑞氏染色后光鏡下行白細胞(WBC)計數。采用雙抗體夾心ELISA法(Santa Cruz公司，美國)測定血清和BALF中TNF-α、IL-8的水平。右肺上葉組織行切片、HE染色，光鏡下觀察肺組織病理學改變。

1.4 統計學方法采用SPSS13.0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺組織病理學改變對照組：C組肺泡和支氣管上內皮細胞結構完整，未見炎性細胞浸潤。模型組：V組肺泡破裂、融合，肺泡間隔明顯增厚，肺間質水腫，肺血管旁、肺泡間隔和肺泡內都有大量炎性細胞浸潤。烏司他丁組：U組肺泡破裂減少，肺泡間隔增厚減輕，炎性細胞的浸潤也明顯減少。病理切片觀察結果：比較400倍鏡下炎癥細胞和100倍鏡下肺泡結構的變化；見圖1～圖3。

圖1 對照組C組

圖2 模型組V組

圖3 烏司他丁組U組

2.2 各組大鼠肺W/D比值、LPI和BALF中白細胞計數通氣結束時，V組肺組織W/D比值、LPI及BALF中白細胞總數均明顯高于C組和U組，差異有統計學意義(P＜0.05)；U組與C組比較差異無統計學意義，見表1。

表1 BALF白細胞計數(109/L)、肺組織W/D比值以及LPI變化比較

表1 BALF白細胞計數(109/L)、肺組織W/D比值以及LPI變化比較

注：與C組比較，aP＜0.05；與V組比較bP＜0.05。

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2.3 血清及BALF中TNF-α、IL-8的變化V組大鼠血清和BALF中TNF-α水平較C組與U組顯著升高，差異有統計學意義(P＜0.05)，而C組與U組比較差異無統計學意義；V組大鼠血清和BALF中IL-8含量較C組與U組顯著升高，差異有統計學意義(P＜0.05)，而C組與U組比較差異無統計學意義，見表2、表3。

表2 血清和BALF中TNF-α的比較

表2 血清和BALF中TNF-α的比較

注：與C組比較，aP＜0.05；與V組比較bP＜0.05。

表3 血清和BALF中IL-8的比較

表3 血清和BALF中IL-8的比較

注：與C組比較，aP＜0.05；與V組比較bP＜0.05。

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3 討論

本研究采用大潮氣量(VT=40 ml/kg)機械通氣2.5 h制備VILI模型，病理結果顯示：模型組肺泡破裂、融合，肺泡間隔明顯增厚，肺間質水腫，肺血管旁、肺泡間隔和肺泡內都有大量炎性細胞浸潤。提示模型制備成功。

評估肺水腫動物模型效果的最簡單的測定指標是肺組織濕干重(W/D)比值，W/D的變化可反映肺間質及肺泡血管通透性改變的程度；WBC計數可反映白細胞的浸潤水平。本研究結果表明，V組W/D、BALF中TP含量及WBC計數都顯著高于C組；而U組與C組差異無統計學意義。結果說明大潮氣量機械通氣模式能夠明顯引起肺內微循環通透性增加，出現肺水腫及滲出增加，導致肺損傷的發生，而烏司他丁的應用能夠抑制肺部微循環通透性的增加，通過抑制炎癥反應減輕大潮氣量所致VILI，從而對肺組織起到保護作用。

TNF-α是肺泡巨噬細胞和中性粒細胞釋放的炎性介質。TNF-α除直接對肺組織細胞造成損傷外，還可以激活巨噬細胞釋放其他炎性因子，誘導血管內皮細胞釋放ICAM-1等趨化因子。IL-8為血小板β球蛋白超家族成員，在化學結構上與血小板因子有關，能刺激中性粒細胞和T淋巴細胞的釋放，被認為是炎癥反應中導致肺組織損傷的特異性細胞因子[5]。本研究結果表明，V組大鼠BALF和血清中TNF-α水平顯著高于C組和U組，提示大潮氣量機械通氣不但誘導了肺組織局部的促炎因子的過度表達，引起肺生物傷，也會引起血中促炎細胞因子的增加，誘發局部炎癥向全身炎性反應發展的趨勢，腹腔注射烏司他丁可抑制呼吸機相關性肺損傷大鼠炎性因子的釋放，減輕肺損傷，至于其抑制炎性反應的具體機制有待于進一步研究。

綜上所述，烏司他丁可減輕大鼠VILI，其機制與抑制炎性反應有關。

[1]Pinhu L,Whitehead T,Evans T,et a1.Ventilator-associated lung injury[J].Lancet,2003,361:332-340.

[2]Slutsky AS.Ventilator-induced lung injury:from barotraumas to biotrauma[J].Respir Care,2005,50(5):646-659.

[3]Yu JB,Yao SL.Protective effects of hemin pretreatment combined with ulinastatin on septic shock in rats[J].Chin Med J(Engl), 2008,121:49-55.

[4]何海軍,粱小飛,顏福斌,等.呼吸機相關性肺損傷模型構建的最佳潮氣量[J].現代生物醫學進展,2008,8(9):1643-1645.

[5]Takeyama Y.Significance of apoptotic cell death in systemic complications with severe acute pancreatitis[J].J Gastroenterol,2005, 40(1):1-10.

Effects of ulinastatin on ventilator-induced lung injury in rats.

QI Zhi-chao,ZHU Xiao-bing,LIU Zhi-qun,WU Lun, CHANG Long-hai.Department of Anesthesiology,Hospital of Traditional Chinese Medicine of Zhongshan,Zhongshan 528411, Cuangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of ulinastatin on the ventilator-induced lung injury in rats.MethodsThirty-six healthy male SD rats,weighting 300～350 g,were randomly divided into 3 groups(n=12 every group), control group(group C);mechanical ventilation group(group V)and ulinastatin group(group U).The animals were anesthetized with intraperitoneal 20%urethane solution 1.4g/kg and tracheostomized.The femoral artery and vein were cannulated for blood sampling and drug administration.The animals were mechanically ventilated for 2.5 h(VT=40 ml/kg,RR 40 bpm,I: E=1:1,FiO22l%).group U was given ulinastatin about 10 000 u/100 g intraperitoneally 30 minutes before the experiment start,while in groups V and C，the rats were given equal volume of normal saline nstead of ulinastatin.Aterial blood samples were collected at the end of ventilation.The animals were then sacrificed and the lungs were removed for microscopic examination and determination of the content of TNF-α,IL-8,and W/D lung weight ratio,WBC count，total protein(TP)，TNF-α,IL-8,concentrations in broncho-alveolar lavage nuid(BALF).ResultsCompared with those in group C，the contents of TNF-α,IL-8,1ung permeability index(LPI),WBC count and W/D ratio in group V were significantly increased(All theP＜0.05).Compared with those in group V,the contents of TNF-α,IL-8,LPI,WBC count and W/D ratio in group U were significantly decreased(All theP＜0.05).The pathological damage was attenuated in group U compared with that in group V.ConclusionUlinastatin can attenuate the ventilator-induced lung injury through inhibition of inflammatory response in rats.

Ulinastatin;Lung injury;Respiratory distress syndrome;Adult;Inflammatory cytokines

R-332

A

1003—6350（2014）01—0010—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.01.0003

2013-07-29)

廣東省中醫藥管理局科研立項(編號：20112051)；中山市科技計劃項目(編號：20113A066)

戚志超。E-mail：qzc99@21cn.com