細菌纖維素膜對木醋桿菌發(fā)酵制備蘋果醋的影響研究

傅 亮，彭 英，陳宇哲

（暨南大學食品科學與工程系，廣東廣州 510632）

蘋果醋是一種在國內(nèi)廣受歡迎的保健型飲品，主要由蘋果汁與食醋調(diào)配而成。全發(fā)酵型蘋果醋風味更自然，功能性更好，但工藝及質(zhì)量控制較調(diào)配型產(chǎn)品復雜，目前尚未形成市場主流，是該產(chǎn)品發(fā)展的方向[1]。

前期工藝研究發(fā)現(xiàn)，以蘋果汁為原料，使用葡萄酒酵母和自行從廣式米醋車間分離的木醋桿菌（Gluconacetobacter xylinus）RF4為菌種制備的全發(fā)酵型蘋果醋，風味特征顯著優(yōu)于配制型產(chǎn)品。目前，采用木醋桿菌進行表面好氧發(fā)酵釀制蘋果醋的工藝、設備和質(zhì)量控制研究未見報道，值得深入探討。上述工藝實施中發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵中后期液體表面會形成一層細菌纖維素膜，并隨發(fā)酵時間的延長繼續(xù)增厚，屬于典型的表面好氧發(fā)酵形式。本文主要探討細菌纖維素膜的形成、存在狀態(tài)和完整性對蘋果醋釀制產(chǎn)酸的影響，并初步探討其機理，研究結(jié)果可為生產(chǎn)工藝的優(yōu)化和設備設計提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

木醋桿菌（Gluconacetobacter xylinus）RF4[2]廣州如豐果子食品公司分離的產(chǎn)酸菌；安琪果酒專用酵母 安琪酵母股份有限公司；都樂100%蘋果汁 百事飲料廣州公司；乙醇、氫氧化鈉等 分析純，天津市大茂生產(chǎn)。

HR-120型電子天平 上海精密；YQX-SG46-280S型高壓蒸汽滅菌器 上海博迅；SW-CJ-1BU型超凈工作臺 蘇州安泰；PYX-190-A型生化培養(yǎng)箱 上海躍進；UV-9200型可見光分光光度計 北京瑞利；AZ8403型便攜式氧濃度測定儀 臺灣衡欣；酸堿滴定裝置。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種液及蘋果酒的制備

1.2.1.1 木醋桿菌RF4菌種液的制備[3]1g/100mL葡萄糖、1g/100mL酵母粉，121℃滅菌20min，冷卻至70℃左右加入5%的無水乙醇（V/V），冷卻至室溫后接種木醋桿菌RF4，30℃下培養(yǎng)7d（檢測菌落數(shù)為7×103CFU/mL）。

1.2.1.2 蘋果酒的釀制 稱取干酵母按1∶10（w/w）的比例接于5%的無菌蔗糖液中，40℃活化20～30min。將蘋果汁滅菌冷卻至室溫接種0.3%（w/w）的酵母液，30℃培養(yǎng)4d，糖度不再變化，酒精發(fā)酵結(jié)束，蘋果酒釀制完成，測得酒精度為5.5%（v/v）。

1.2.2 分析測定方法

1.2.2.1 總糖測定 手持糖度計。

1.2.2.2 酒精度的測定[4]化學氧化法。

1.2.2.3 總酸的測定 參照GB/T 5009.41-2003。

1.2.2.4 乙醇脫氫酶（ADH）活力的測定[5]參照WOOD氏法。

1.2.2.5 溶氧量的測定 使用便攜式溶氧儀。

1.2.3 細菌纖維素的形成對表面發(fā)酵產(chǎn)酸的影響向釀制好的蘋果酒中接入10%（w/w）的RF4菌種液，30℃進行發(fā)酵，發(fā)酵分A、B、C、D四組方式進行。A、B、C三組靜置發(fā)酵5d后，酸度達1.80g/100mL，發(fā)酵液面均形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的細菌纖維素膜，A組繼續(xù)保持靜置培養(yǎng)；B組輕搖瓶身使膜沉入發(fā)酵液底部并靜置培養(yǎng)；C組用無菌玻璃棒取出纖維素膜后靜置培養(yǎng)。D組從發(fā)酵第1d開始每隔1h攪拌一次發(fā)酵液，阻止細菌纖維素在發(fā)酵液表面聚合成膜，因膜不能漂浮聚合發(fā)酵液呈渾濁狀態(tài)。以上四組發(fā)酵方式每隔8h測一次酸度。

1.2.4 細菌纖維素膜與發(fā)酵液中乙醇脫氫酶活力的測定 培養(yǎng)7d后，分別測定A組的浮膜，B組沉入發(fā)酵液底部2d的膜，以及A組發(fā)酵液中乙醇脫氫酶的活性。

纖維素膜酶解液制備[6]：準確稱量上述A、B兩組發(fā)酵液中漂浮于液面和沉入液下的濕狀纖維素膜0.25g，加入0.1%已活化好的纖維素酶溶液（最適條件下測得的酶活力為1556IU/g），用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液調(diào)至pH5.0，蒸餾水定容至10mL，35℃水浴24h至膜完全水解。

乙醇脫氫酶活性測定：參照WOOD氏法，各取pH4.0的Mcllvaine緩沖液1.0mL，體積分數(shù)10%TritonX-100溶液0.2mL，1.0mol/L乙醇溶液0.2mL，0.1mol/L鐵氰化鉀溶液0.2mL，分別加入乙醇培養(yǎng)發(fā)酵液及纖維素膜酶解液各0.4mL，置于25mL比色管，25℃保溫5min，然后加入硫酸鐵-Dupanol溶液（5g硫酸鐵、3g十二醇硫酸鈉、95mL 85%磷酸，蒸餾水定容至1L）1.0mL，再與7mL蒸餾水混合后，測定660nm處吸光度。25℃水浴20min后，再次測量，重復三次，取算術平均值。

酶活力單位定義：1min氧化1μmol的乙醇為1U；在上述條件下1g樣品吸光度增加4.0等于氧化lμmol的乙醇，即1U/g。

酶活計算公式（U/g）：

式中，k：放大系數(shù)，發(fā)酵液為2.5，纖維素膜酶解液為100；ΔA：吸光度讀數(shù)變化的絕對值；t：反應時間[7]。

1.2.5 兩種不同接種方式對產(chǎn)酸的影響 將釀制好的蘋果酒發(fā)酵液分成2組：A組接種發(fā)酵液重量10%的菌種液，B組接種發(fā)酵液重量的10%濕狀菌纖維素膜，30℃靜置培養(yǎng)，測量酸度的變化。

1.2.6 取膜后產(chǎn)酸速率與耗氧和ADH酶活力之間的關系 靜置發(fā)酵5d后，酸度達到1.80g/100mL，以無菌玻棒將發(fā)酵液表面形成完整穩(wěn)定的細菌纖維素膜取出，用鋁箔和紗布將錐形瓶瓶口密封，每隔4h測定酸度、液面上空頂隙氧含量、發(fā)酵液ADH酶活力、發(fā)酵液與纖維素膜ADH酶總活力。由于發(fā)酵過程中細菌纖維素懸浮在液中并緩慢絮凝于液面上方，測定發(fā)酵液ADH酶活力時取樣需來自底部澄清部分；ADH酶總活力測定，則需將細菌纖維素攪碎，使發(fā)酵液和細菌纖維素混合均勻后取樣。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗均做3次平行，以3倍標準差法剔除異常值。實驗結(jié)果以算術平均值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌纖維素膜的形成及對產(chǎn)酸的影響

發(fā)酵過程中，D組每隔1h攪拌一下發(fā)酵液，一開始就阻止了纖維素膜的形成，酸度一直維持在初始的0.36g/100mL，產(chǎn)酸停滯；A組的細菌纖維素膜逐漸加厚；B和C組靜置培養(yǎng)24h后可以觀察到重新形成的完整纖維素薄膜浮于液面。

A、B、C三組重新計時后產(chǎn)酸情況如圖1所示。

圖1 發(fā)酵5d后纖維素膜的狀態(tài)對酸度的影響Fig.1 The influence of states of the cellulose pellicle to acid production after fermentation 5 days

由圖1可知，A組的纖維素膜沒有被破壞，產(chǎn)酸能力一直保持較高水平，酸度逐漸上升，最高達4.32g/100mL，之后酸度開始下降；B與C組前16h幾乎不產(chǎn)酸，之后酸度緩慢上升，在16～24h開始有肉眼可見的纖維素膜浮于液面，24h后B和C組可形成完整的纖維素膜，同時產(chǎn)酸能力迅速上升，這兩組發(fā)酵液最高酸度同時達4.32g/100mL，但比A組慢8h左右。由此可知纖維素膜沉于液底或取出后都會抑制產(chǎn)酸，直到液面重新成膜后才恢復較高的產(chǎn)酸速度，纖維素膜的取出或下沉不會影響產(chǎn)酸的最高值，但是會影響達到最高酸度所需時間。

上述結(jié)果表明，纖維素膜的生成并且浮于發(fā)酵液表面對產(chǎn)酸有直接的相關關系，其存在與狀態(tài)對產(chǎn)酸起重要作用。

2.2 纖維素膜內(nèi)與發(fā)酵液中乙醇脫氫酶活性對比

圖2 纖維素膜內(nèi)與發(fā)酵液中乙醇脫氫酶活性對比Fig.2 The comparison of ADH enzyme activity in the cellulose pellicle and fermented liquor

由圖2可知，纖維素膜內(nèi)的乙醇脫氫酶活性遠高于發(fā)酵液中，浮在液面的膜內(nèi)乙醇脫氫酶的活力最大為0.7340U/g，而發(fā)酵液中酶活只有0.0132U/g；二者相差56倍。沉入液下的膜內(nèi)乙醇脫氫酶活性為浮在液面的74.1%，為0.5440U/g。結(jié)果說明，將乙醇氧化生成乙酸起主要作用的乙醇脫氫酶主要集中在細菌纖維素膜內(nèi)。

2.3 兩種不同的接種方式對產(chǎn)酸的影響

圖3 兩種接種方式對產(chǎn)酸的影響Fig.3 The influence of the two inoculated methods to acid production

兩種接種方式對產(chǎn)酸的影響如圖3所示，發(fā)酵前3d木醋桿菌處于遲滯期，A、B兩組的酸度幾乎保持不變，但是從第4d開始，隨著二者都在液面形成新的纖維素膜，接入含菌纖維素膜的B組產(chǎn)酸速度明顯高于接入菌種液的A組，B組在第7d酸度達到4.32g/100mL，而A組在酒精發(fā)酵第8d才達到同樣酸度，之后酸度均開始下降。結(jié)果表明，接入纖維素膜達到最高酸度的時間比接入液態(tài)菌種快。

2.4 取膜后繼續(xù)發(fā)酵產(chǎn)酸速率、耗氧和ADH酶活力之間的關系

由表1可看出，在取出細菌纖維素膜的前16h，幾乎不產(chǎn)酸，耗氧速率較慢，發(fā)酵液中ADH酶活力幾乎不變，但ADH酶總活力在緩慢上升，伴隨發(fā)酵液中渾濁度增加，顯示纖維素產(chǎn)量增加，但細菌纖維素尚未在表面完整聚集。

16～20h，酸度上升明顯，耗氧速率加快，發(fā)酵液中ADH酶活力緩慢上升，ADH酶總活力上升迅速。在20h時觀察到纖維素在發(fā)酵液面開始聚集成膜，此時發(fā)酵液中ADH酶活力達到最高值0.333U/g，之后緩慢減弱。說明膜的形成伴隨著ADH酶活向膜聚集，證據(jù)指向了膜為產(chǎn)酸的主要場所。

20～24h，ADH酶總活力繼續(xù)增加，產(chǎn)酸速率達到最高的0.065g/100mL·h，耗氧速率也達到最大為0.383mg/L·h，24h時發(fā)酵液清澈透明，渾濁消失，清晰的觀察到完整結(jié)實的細菌纖維素薄膜漂浮于液面，這說明完整而結(jié)實的細菌纖維素薄膜起著聚集支撐菌體和ADH酶的作用，并改善溶氧，強化產(chǎn)酸。

24h后，隨著ADH酶總活力的提高，酸度繼續(xù)上升，但是產(chǎn)酸速率和耗氧速率開始下降，應為瓶口密封，頂隙供氧不夠所致。此時發(fā)酵液幾乎完全透明，液面薄膜逐漸加厚。

3 結(jié)論與討論

采用木醋桿菌進行表面發(fā)酵法釀制全發(fā)酵型蘋果醋，產(chǎn)品品質(zhì)良好，所使用的菌種及工藝尚未見文獻報道。伴隨蘋果醋的發(fā)酵，形成的細菌纖維素膜是發(fā)酵的典型特征，本文對細菌纖維素膜在發(fā)酵產(chǎn)酸中的作用、機理進行了初步探討，揭示了成膜對發(fā)酵的影響。

研究表明，浮于發(fā)酵液表面的灰白色細菌纖維素膜內(nèi)ADH酶活力比發(fā)酵液中的高56倍，說明發(fā)酵產(chǎn)酸主要在膜內(nèi)進行，膜的存在及在發(fā)酵液內(nèi)所處狀態(tài)也會極大的影響產(chǎn)酸，當膜浮在液體表面并保持完整時可使產(chǎn)酸狀態(tài)達到最佳。接種含菌纖維素膜比接種液態(tài)菌種能減少產(chǎn)酸遲滯期，提早達到最高酸度也證實了這一點。

表1 產(chǎn)酸速率與耗氧、ADH酶活力之間的關系Table 1 The relationship of acid production rate，oxygen consumption and the ADH enzyme activity

與細胞膜結(jié)合的乙醇脫氫酶（ADH）是產(chǎn)酸過程中將乙醇氧化成乙醛，并進一步轉(zhuǎn)化成乙酸的標志性酶，ADH活力的大小對產(chǎn)酸能力的評價起著最為關鍵的作用[8]。研究結(jié)果證實，纖維素在液體表面的聚集并成膜與產(chǎn)酸速率、耗氧速率及總ADH酶活力直接關聯(lián)，膜形成的過程伴隨著這些參數(shù)的顯著性變化，更進一步證實了膜對發(fā)酵產(chǎn)酸的重要性。成膜及保持完整應是菌體及ADH的支撐系統(tǒng)，更有可能改變了發(fā)酵液表面特性，有助于溶氧。

根據(jù)本文的研究結(jié)果，以木醋桿菌RF4進行表面發(fā)酵制備蘋果醋，工藝中應特別考慮維持膜的快速形成并維持完整。該結(jié)論在設備設計及選型過程中有重要的指導作用。常用的好氧發(fā)酵設備，如深層液態(tài)攪拌式發(fā)酵罐或氣升式反應器，因其生產(chǎn)過程中發(fā)酵液內(nèi)存在較大剪切力可能導致細菌纖維素膜不能良好形成或被破壞導致發(fā)酵失敗。維持纖維素膜完整條件下連續(xù)好氧發(fā)酵罐的設計是新型表面好氧發(fā)酵設備設計的新課題。

[1]王云陽，岳田利，袁亞紅，等.蘋果醋及果醋飲料的研制[J].食品工業(yè)科技，2005（4）：118-120.

[2]傅亮，易九龍，陳思謙，等.傳統(tǒng)廣式米醋中醋酸菌的分離與鑒定[J].中國調(diào)味品，2012，37（6）：57-60.

[3]傅亮，易九龍，陳思謙，等.木醋桿菌RF4分批補料發(fā)酵法生產(chǎn)廣式米醋[J].食品與機械，2013，29（1）：202-204.

[4]郭美利，馬美范.飲料酒中酒精含量的分析方法研究[J].東輕工業(yè)學院學報，2008，22（3）：14-17.

[5]Willis A.Wood：Methods in Enzymology[M].Washington，D C：Acodenic Press，982：450-451.

[6]賈士儒，歐竑宇，馬霞，等.細菌纖維素結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的初步研究[J].纖維素科學與技術，2002，10（3）：25-29.

[7]傅亮，陳思謙，易九龍，等.細菌纖維素膜對木醋桿菌發(fā)酵生產(chǎn)廣式米醋的影響[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38（4）：123-125.

[8]周秉承.食醋生產(chǎn)中醋酸菌乙醇脫氫酶的活性與產(chǎn)酸速率關系的研究[J].中國釀造，2009（11）：58-59.