響應面法優化杏汁的微波殺菌工藝研究

嚴雅慧，黃文書，白羽嘉，馮作山

（新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊 830052）

杏屬薔薇科，又名甜梅、杏子[1]。杏果中含有豐富的營養物質，如多酚、多糖、維生素、氨基酸和礦物質元素等[2]。杏是新疆的主栽果樹之一，其栽培面積和產量均居全國各省（區）之首[3]，據2012年新疆統計年鑒[4]，杏果實產量為173.34萬噸，占新疆水果總量的23.53%。杏汁就是新鮮杏果實經過挑選、清洗，榨出的汁液，是水果中最有營養價值的部分，其色澤艷麗、香味馥郁，甜味適度，新鮮爽口，容易被人體吸收，在風味和營養上接近于新鮮杏果。

熱殺菌一直是杏汁加工的傳統殺菌方法，其殺菌溫度一般在90℃[5]以上，高溫處理導致杏汁變味、變色及營養成分損失[6]。微波作為一種新的殺菌方式也開始應用于液態食品中，不僅具有低溫、短時的特點[7]，還對食品營養成分和風味物質有更多的保留，同時對鈍化酶和殺滅微生物也有較好的效果。

微波殺菌技術已廣泛應用，一般具有以下特點：微波殺菌終止溫度大多是85～158℃[8]；微波殺菌的起始溫度是常溫[9-10]；采用一次微波殺菌處理。與傳統微波殺菌方法相比，本文的創新點是以杏汁為原料，控制杏汁微波終止溫度不超過75℃，也同時降低杏汁微波殺菌的起始溫度，再多次進行冷凍和微波交替處理，并選用Box-Behnken設計實驗和響應曲面法分析實驗結果，最終得到杏汁微波殺菌的最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

輪臺小白杏 新疆烏魯木齊市北園春市場；平板計數瓊脂 北京奧博生物技術有限責任公司；無菌生理鹽水 濃度0.8%NaCl水溶液。

WD900B型微波爐 順德市格蘭仕電器實業有限公司；偉豐WF-A3000型榨汁機 永康市天歌電器有限公司；FE20型pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；NCJJ-0.1/100型納米超高壓均質機 廊坊通用機械有限公司；JM-L880型膠體磨 溫州市七星乳品設備廠；HF-D88型封杯機 浙江省瑞安市宏福包裝機械廠；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；超凈工作臺 上海鴻都電子科技有限公司；電子天平 上海越平科學儀器有限公司；LHS-150SC型恒溫恒濕培養箱 上海一恒科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 杏汁的制備 杏→挑選→清洗→去核→榨汁→膠體磨→納米均質機→調pH→封裝。

1.2.2 殺菌處理流程 研究微波殺菌處理對杏汁的影響。將100mL的杏汁置于260mL的塑料封杯中，用封杯機封口，再放在頻率為2450MHz、額定功率為900W的家用微波爐的托盤正中央，微波處理一定時間，取出立即用溫度計測量，控制杯內杏汁的微波終止溫度最高溫度不超過75℃。一次微波處理完后，杏汁置于冰柜中冷卻至設定的起始溫度后，再進行下一次的微波處理。

1.2.3 微生物菌落總數的測定 按《食品安全國家標準食品微生物學檢驗-菌落總數測定》[11]，采用平板傾注計數法進行菌落總數的測定，以無菌生理鹽水適當稀釋微波處理前后和未處理作為對照的杏汁，于平板計數培養基上在37℃培養48h，然后進行菌落計數。

根據GB 19297-2003果、蔬汁飲料衛生標準[12]中的微生物指標規定中，限定菌落總數（CFU/mL）≤100個，大腸菌群（MPN/100mL）≤3個，霉菌（CFU/mL）≤20個，酵母菌（CFU/mL）≤20個，致病菌都不得檢出。致死率計算公式[13]：

式中，N0-冷凍處理后1mL杏汁中活菌數；N-微波處理后1mL杏汁中活菌數。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 杏汁的微波起始溫度對細菌致死率的影響

用0.3%檸檬酸將已制備好的杏汁pH調至3.5，微波次數為3次，杏汁的微波終止溫度為55℃，考慮到冷凍會使微生物的細胞大量脫水，導致蛋白質等生物大分子發生不可逆變性，還會在微生物細胞內形成冰晶體，對細胞產生機械破壞作用，從而導致微生物死亡的作用，故考察杏汁的微波起始溫度降到零下，分別為-20、-10、0、10、20℃時對細菌致死率的影響，微波殺菌每一次的溫度都要重新降至起始溫度。

1.2.4.2 pH對細菌致死率的影響 將已制備好的杏汁的微波起始溫度設為-10℃，微波次數為3次，杏汁的微波終止溫度為55℃，考察pH分別為3、3.5、4、4.5、5時對細菌的致死率的影響，微波殺菌每一次的溫度都要重新降至起始溫度。

1.2.4.3 微波次數對細菌致死率的影響 用0.3%檸檬酸將已制備好杏汁pH調至3.5，杏汁的微波起始溫度設為-10℃，杏汁的微波終止溫度為55℃，考察微波次數分別為1、2、3、4、5、6次時對細菌的致死率的影響，微波殺菌每一次的溫度都要重新降至起始溫度。

1.2.4.4 杏汁的微波終止溫度對細菌致死率的影響

用0.3%檸檬酸將已制備好杏汁pH調至3.5，杏汁的微波起始溫度設為-10℃，微波次數為3次，考察杏汁的微波終止溫度分別為35、45、55、65、75℃時對細菌致死率影響，微波殺菌每一次的溫度都要重新降至起始溫度。

1.2.5 Box-Behnken實驗設計 在單因素實驗基礎上，根據中心組合實驗設計原理，以微波殺菌的細菌的致死率（Y%）為指標，設計四因素三水平響應面分析實驗，確定最優微波殺菌工藝參數。實驗因素編碼表如表1所示。

表1 響應面設計的因素水平及編碼Table 1 Corresponding actual values of variables and coded values in response surface design

1.3 數據處理

每個處理重復3次，取平均值，數據以平均值±標準差的形式給出。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 杏汁的微波起始溫度對細菌致死率的影響 杏汁的微波起始溫度對細菌致死率的影響結果如圖1所示。

圖1 微波起始溫度對細菌致死率的影響Fig.1 Effect of starting temperature of microwave on bacterial mortality rate

由圖1可知，在杏汁的微波起始溫度為-20～-10℃范圍內，細菌致死率隨著杏汁微波起始溫度的升高而增大，-10℃時達到最大，隨后又減小。可能是因為杏汁在-20～0℃冷凍過程中，冰晶體的形成不僅使微生物細胞遭到機械性破壞，使微生物細胞內原生質或膠體脫水，最后導致不可逆的蛋白質變性[14]，使得微生物的存活率迅速下降，從而增強了微波輻射處理對杏汁中微生物的殺滅能力。同時，微波非熱殺菌效應與介質獲取的微波能量有密切關系，在微波發生器輸出能量恒定的條件，微波處理時間越長，介質獲得的微波輻射能量越多，產生的殺菌效果就越好[15]，把杏汁的起始溫度降到零下，可擴寬杏汁升溫空間，延長杏汁的微波處理時間，使杏汁在低的殺菌溫度下反復多次獲得更多的微波輻射能，從而增強對微生物的殺傷作用。當微波起始溫度0～20℃時，由于冷凍作用消失，微波終止溫度不高，使得杏汁的微波處理時間縮短，獲得的微波輻射能減少，所以致死率大幅度降低。

2.1.2 pH對細菌致死率的影響 pH對細菌致死率的影響結果如圖2所示。

圖2 pH對細菌致死率的影響Fig.2 Effect of pH on bacterial mortality rate

由圖2可知，隨著pH的增加，細菌致死率呈現出先增加后減小的趨勢。微生物通常可以在一個較寬的pH范圍內生長，但都有一個最適pH，但隨著環境pH的不斷變化，使得微生物繼續生長受阻，當超過最低或最高pH時微生物就死亡[16]。在pH3.5時，微波殺菌效果最好，推測可能由于杏汁中大部分微生物的最適pH＞3.5，超出微生物生長的pH范圍，使維持細胞內外pH動態平衡的氫離子泵功能受到嚴重破壞，影響細胞產能過程，細胞耗能得不到及時補充而致死[17]。

2.1.3 微波次數對細菌致死率的影響 微波次數對細菌致死率的影響結果如圖3所示。

圖3 微波次數對細菌致死率的影響Fig.3 Effect of microwave times on bacterial mortality rate

從圖3能看出，當微波次數1～3次，隨著微波次數的增加，細菌致死率也隨之增加，當微波次數超過3次后，致死率無明顯變化，可能是1～3次微波輻射處理，殺滅了杏汁中大部分由于反復冷凍使得細胞遭到機械破壞以及pH3.5已經超出能生長范圍的微生物，超過3次后，有可能是因為把對微波輻射敏感的大部分微生物都殺死，之后殘存的微生物對微波輻射不敏感。

2.1.4 微波終止溫度對細菌致死率的影響 微波終止溫度對細菌致死率的影響結果如圖4所示。

圖4 微波終止溫度對細菌致死率的影響Fig.4 Effect of terminating temperature of microwave on bacterial mortality rate

由圖4可知，隨著杏汁微波終止溫度的升高，細菌致死率增加，當杏汁的微波終止溫度到65℃時，細菌致死率達到最大，超過65℃后，細菌致死率的升高幅度開始平緩。分析原因可能是微生物細胞在微波輻射場的作用下，其分子也被極化并作高頻振蕩，產生熱效應，溫度的快速升高使微生物蛋白質等生物大分子變性失活，細菌代謝異常，使菌體死亡或受到嚴重干擾而無法繁殖[18-19]，但超過65℃后，微波處理把大部分對電磁輻射敏感的微生物都殺滅，殘存的是對輻射有一定耐受力的細菌，所以75℃的細菌致死率與65℃相比無明顯變化。

2.2 響應面法優化微波殺菌條件的結果分析

根據單因素實驗結果用Design-Expert 8.0.6軟件統計，應用四因素三水平的Box-Behnken組合設計進行微波殺菌工藝的優化研究，選擇微波起始溫度、pH、微波次數與微波終止溫度為自變量，以微波作用于細菌的致死率（Y%）作為實驗指標，實驗方案與結果如表2所示。

2.3 回歸模型的建立及顯著性檢驗

用軟件Design Expert 8.0.6對表2中的數據進行多元回歸擬合，選擇對響應值影響顯著的各項，可得杏汁的微波起始溫度、pH、杏汁的微波終止溫度、微波次數與細菌致死率的多項回歸方程，回歸方程為：

對回歸方程進行顯著性檢驗、方差分析及各因素最佳值分析，結果見表3。

F檢驗反映的是回歸模型的有效性，包括失擬項檢驗和回歸方程顯著性檢驗。由方差分析表3可見，該模型p＜0.0001，表明該模型極顯著；失擬項在α=0.05水平上不顯著（p=0.1689＞0.05）。方程模擬的復相關系數R2=0.9922，修正相關系數R2Adj=0.9843，說明建立的模型能理解響應值變化的98.43%，表明此模型擬合度較好，回歸方程能很好地描述各因素與響應值之間的關系，該實驗方法可靠。

由回歸方程系數顯著性檢驗可知，模型的一次項X1、X3和X4（p＜0.01）影響極顯著，X2（p＞0.05）影響不顯著；二次項（p＜0.01）影響均極顯著；交互項X1X4（p＜0.01）影響極顯著，X1X2、X1X3、X2X3、X2X4、X3X4影響都不顯著。對一次項回歸系數的絕對值大小進行比較可知，影響微波殺菌過程的因素作用大小為：X3＞X1＞X4＞X2，即杏汁的微波終止溫度＞杏汁的微波起始溫度＞微波次數＞pH。

表2 響應面分析實驗設計及結果Table 2 Experimental design for response surface analysis and corresponding experimental data

用Design Expert 8.0.6軟件優化，分析得到微波殺菌的最佳工藝條件為：pH3.50，微波次數3.20，微波起始溫度為-10.87℃，微波終止溫度為67.02℃，此條件下細菌的致死率理論可達99.5644%。

2.4 因素間的交互作用

采用Design Expert 8.06軟件分析并繪制相應的響應面圖，如圖5～圖10所示。

圖5～圖10直觀地反映了各因素對響應值的影響，比較6個圖可知：微波終止溫度（X3）對細菌致死率的影響最為顯著，表現為曲線相對較陡；其次為微波起始溫度（X1），微波次數（X4）、pH（X2）表現為曲線相對較為平滑，隨其數值的增加或減少，響應值變化較小。

2.5 驗證實驗

為檢驗實驗結果與真實情況的一致性，對上述優化條件進行驗證實驗。同時考慮到實際操作的便利，將最佳工藝條件修正為：pH3.5、微波次數為3次、微波終止溫度為67℃、微波起始溫度為-11℃。杏汁的原始細菌總數為9400CFU/mL，在修正后的工藝條件下進行3次平行實驗，得到殘存的細菌總數5個/CFU/mL，酵母菌3個/CFU/mL，大腸菌群、霉菌和致病菌都無檢出，即微波對細菌的致死率是99.68%，比理論預測值99.5644%效果還好。因此，經響應面法優化所得的微波殺菌最佳工藝參數準確可靠，具有實際應用價值。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model equation

圖5 微波起始溫度與pH對細菌致死率交互影響的響應面分析圖Fig.5 Response surface for bacterial mortality rate as the interaction of microwave starting temperature and pH

圖6 微波起始溫度與微波終止溫度對細菌致死率交互影響的響應面分析圖Fig.6 Response surface for bacterial mortality rate as the interaction of microwave starting temperature and microwave terminating temperature

圖7 微波起始溫度與微波次數對細菌致死率交互影響的響應面分析圖Fig.7 Response surface for bacterial mortality rate as the interaction of microwave starting temperature and microwave times

圖8 pH與微波終止溫度對細菌致死率交互影響的響應面分析圖Fig.8 Response surface for bacterial mortality rate as the interaction of pH and microwave terminating temperature

圖9 pH與微波次數對細菌致死率交互影響的響應面分析圖Fig.9 Response surface for bacterial mortality rate as the interaction of pH and microwave times

3 結論與討論

圖10 微波終止溫度與微波次數對細菌致死率交互影響的響應面分析圖Fig.10 Response surface for bacterial mortality rate as the interaction of microwave terminating temperature and microwave times

本實驗通過單因素和Box-Behnken響應面實驗，建立了模型，預測了微波的最佳殺菌條件：pH為3.5、微波次數為3次、微波終止溫度為67℃、微波起始溫度為-11℃。

在此條件下的杏汁微波殺菌工藝，微波輻射對細菌的致死率可達到99.68%，使得原始細菌總數為9400CFU/mL的杏汁經過微波殺菌工藝后，殘余細菌總數5個/CFU/mL，酵母菌3個/CFU/mL，大腸菌群、霉菌和致病菌都無檢出，得到殺菌后的杏汁不僅符合GB 19297-2003果、蔬汁飲料衛生標準，又由于微波處理杏汁的溫度低，時間短，還能很好地保持杏汁原有的色澤、風味、營養和功效成分，所以該方法殺菌效果好，可用于生產高品質的杏汁產品。

本實驗創造性地利用冷凍和微波的交替處理，有效殺滅杏汁中的各類酶活性和絕大多數微生物，達到商業無菌的要求，并且本實驗中選用的響應值-細菌致死率（Y%），已經消除了冷凍對微生物的作用，更能精確的反映微波殺菌對微生物的影響。

[1]錢龍.新疆庫買提杏子貯藏保鮮商品化處理技術關鍵點研究[D].烏魯木齊：新疆農業大學，2010：1-2.

[2]Ali S，Masud T，Abbasi KS.Physico-chemical characteristics of apricot grown in northern areas of Pakistan[J].Scientia Horticulturae，2011，130（2）：386-392.

[3]張青，趙峰.新疆杏資源與產業化發展[J].北方果樹，2009（4）：11-12.

[4]新疆維吾爾自治區統計局.新疆統計年鑒[M].北京：中國統計出版社，2012：375-376.

[5]胡廣洲.小白杏汁飲料的開發及其生產工藝研究[J].飲料工業，2010，13（11）：8-11.

[6]Kuo-Chiang Hsu.Evaluation of processing qualities of tomato juice induced by thermal and pressure processing[J].LWT-Food Science and Technology，2008，41（3）：450-459.

[7]Juan A Canumir，Jose’E Celis，Johannes de Bruijn，et al.Pasteurization of apple juice by using microwaves[J].Lebensmittel-Wissenschaft und-Technologie，2002，35（5）：389-392.

[8]張盛貴，韓舜愈，張珍，等.澄清杏汁飲料生產工藝[J].食品工業與機械，2003（3）：23-24.

[9]劉麗，遲玉杰，夏寧，等.豆醬微波殺菌工藝[J].食品與發酵工業，2011，37（5）：88-91.

[10]周先漢，蒲傳奮，阮少鈞.乳化蜂蜜微波殺菌工藝研究[J].食品科學，2006，27（12）：469-472.

[11]中國疾病預防控制中心營養與食品安全所.GB 4789.2-2010食品微生物檢驗：菌落總數測定[S].北京：中國標準出版社，2010.

[12]中華人民共和國衛生部.GB 19297-2003果、蔬汁飲料衛生標準[S].北京：中國標準出版社，2003.

[13]張玲.微生物學實驗指導[M].北京：北京交通大學出版社，2007：110.

[14]何嬌.冷凍對果蔬制品的影響[J].農產品加工，2011（9）：11.

[15]鄒訓重，張莉杰，劉亞杰，等.微波滅菌的研究進展[J].廣東微量元素科學，2013，20（6）：67-70.

[16]Prescott L M.微生物學[M].第5版.沈萍譯.北京：高等教育出版社，2003：125-126.

[17]陳燕飛.pH對微生物的影響[J].太原師范學院學報：自然科學版，2009，8（3）：121-124.

[18]沈海亮，宋平，楊雅利，等.微波殺菌技術在食品工業中的研究進展[J].食品工業科技，2012，33（13）：361-365.

[19]Wilfried Schleged.Commercial pasteurization and sterilization of food products using microwave technology[J].Food Technology，1992（12）：62-63.