大孔吸附樹脂純化胡蘆巴中原薯蕷皂苷的研究

郭清峰，王 瑋，余淑嫻，梁永利，陳建華，任怡欣

（1.包頭輕工職業技術學院，內蒙古包頭 014035；2.南昌大學理學院，江西南昌 330031）

胡蘆巴為豆科植物胡蘆巴屬胡蘆巴（Trigonella foenum-graecumL.）的種子，在我國主產于貴州、江西、河北、安徽、四川、新疆等地，且南北各地均有栽培。干燥的胡蘆巴種子有溫腎、祛寒、止痛的功效，主治腎藏虛冷、小腹冷痛、小腸疝氣、寒濕腳氣等癥[1]。胡蘆巴的主要化學成分為甾體皂苷、黃酮及其苷、三萜、生物堿、香豆素、有機酸及油脂等，其中甾體皂苷是其主要成分[2]。原薯蕷皂苷（protodioscin）屬于甾體皂苷，Hiroshige等[3]在胡蘆巴中發現含有原薯蕷皂苷，該有效成分具有增強性功能、降血脂、對癌細胞有毒殺和抗白血病等作用[4-7]。

大孔吸附樹脂是一種有機高聚物吸附劑，具有選擇性好、吸附容量大、解吸容易、再生簡便等優點?；诖罂孜綐渲奶攸c，選用大孔吸附樹脂來分離純化胡蘆巴中原薯蕷皂苷，通過對大孔吸附樹脂富集、純化胡蘆巴中原薯蕷皂苷工藝條件與參數的研究，探索其分離純化的最優工藝參數，從而確定富集、純化胡蘆巴中原薯蕷皂苷的可行工藝路線。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胡蘆巴（Trigonella foenum-graecumL.）藥材 購自江西省藥材公司（產地貴州），原薯蕷皂苷標準品（含量≥98%）購自中國藥品生物制品檢驗所；甲醇、乙腈 色譜純；其他試劑 分析純；水 二次重蒸餾水；D-101、DB-301、HP-20、HPD-400A、HPD-500、HPD-l00、HPD-600型大孔吸附樹脂 購自河北滄州寶恩化工有限公司；YWD-06、YWD-01B、NKA-9型大孔吸附樹脂 購自中國滄州遠威化工有限公司。

2695型高效液相色譜儀 美國Waters公司；Waters2996型二極管陣列檢測器，Gold SpectrumLab 54型紫外可見分光光度計 上海棱光技術有限公司；KQ2200E型超聲儀 昆山市超聲儀器有限公司；RE-52AA型旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；Sartorius型十萬分之一電子天平 德國。

1.2 實驗方法

1.2.1 葫蘆巴粗提液的制備 實驗中的胡蘆巴取當年生原藥材，去雜、洗凈、低溫干燥至恒重，取出置于干燥器內冷卻，用粉碎機粉碎，過40目網篩，分裝備用（置于陰涼干燥處密封，供研究提取分離用）。

稱取已干燥至恒重的胡蘆巴粉適量，用正己烷進行索氏脫脂2h，用75%的乙醇溶液超聲提取3次，每次15min，把提取液過濾，合并濾液，濾液再高速離心、濾過，將過濾液減壓濃縮，濃縮液移入容量瓶，并用75%的乙醇溶液定容至250mL備用[8]。

1.2.2 葫蘆巴中原薯蕷皂苷的含量測定[8]

1.2.2.1 色譜條件 Lichrospher C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：乙腈-水（8∶92）；柱溫：30℃；流速：0.5mL/min；檢測波長：203nm。

1.2.2.2 校準曲線和線性范圍考察 稱取50℃干燥2h的原薯蕷皂苷標準品2.70mg，置于25mL棕色容量瓶中，用流動相超聲溶解，并定容至刻度，搖勻，即得標準品溶液（0.108mg·mL-1）。依次精密吸取標準品溶液1、2、4、6、10、12μL進樣，記錄峰面積，以峰面積值Y對原薯蕷皂甙的進樣濃度X（mg·mL-1）進行線性回歸，得回歸方程為Y=11582.93X-16.73，r=0.9999。

1.2.3 大孔吸附樹脂的篩選 通過比較10種大孔吸附樹脂的靜態吸附和解吸的性能篩選出適合于純化原薯蕷皂苷的樹脂。精密稱取各種型號已干燥至恒重的樹脂0.5g，置于錐形瓶中，加入原薯蕷皂苷提取液25mL，放入恒溫（25℃）搖床中振蕩24h。把經過吸附后的提取液過濾，然后用高效液相色譜測定濾液中原薯蕷皂苷的濃度，從而測定各種型號大孔吸附樹脂的吸附量。將吸附平衡后的樹脂轉移至色譜柱中，用4BV的70%乙醇解吸，然后用高效液相色譜測定解吸液中原薯蕷皂苷的濃度。大孔吸附樹脂的吸附量，吸附率和解吸率按下式進行計算。

式中：C0—起始溶液中原薯蕷皂苷的質量濃度，mg/mL；C1—洗脫液中原薯蕷皂苷的質量濃度，mg/mL；Ce—吸附平衡時溶液中原薯蕷皂苷的質量濃度，mg/mL；V—葫蘆巴提取液體積，mL；m—樹脂質量，g。

1.2.4 動態吸附條件的確定 把通過靜態與解吸實驗篩選出的大孔樹脂進行濕法裝柱，分別考察上柱吸附體積流量、樹脂藥材比、樹脂柱徑高比等因素，收集不同因素下的各洗脫液，通過測定洗脫液中原薯蕷皂苷的濃度，計算出原薯蕷皂苷的吸附量，以吸附率為指標確定最佳吸附條件。

1.2.4.1 上柱吸附體積流量的確定 精密吸取10mL原薯蕷皂苷提取液分別以2、4、6、8、10BV/h的體積流量上柱吸附，收集流出液，靜置1h。然后用3BV的水以8BV/h的流速進行清洗，收集流出液。合并2次的流出液，測定原薯蕷皂苷的質量濃度，根據式（2）計算原薯蕷皂苷的吸附率。

1.2.4.2 樹脂藥材質量比的確定 調整胡蘆巴提取液的上柱量，使干樹脂藥材質量比分別為1∶1，2∶1，4∶1，8∶1和16∶1（質量比的單位為g/g），以70%乙醇作為洗脫劑，用3BV（樹脂床體積數）70%乙醇，在10BV/h下進行解吸，收集洗脫液，測定洗脫液中原薯蕷皂苷的質量濃度，根據式（2）計算原薯蕷皂苷的吸附率。

1.2.4.3 樹脂柱徑高比的確定 取HP-20型干樹脂濕法裝柱，使徑高比分別為1∶3、1∶6、1∶9、1∶12，1∶15，樹脂藥材質量比為8∶1，精密吸取胡蘆巴提取液上柱，用70%乙醇液洗脫，收集洗脫液，測定原薯蕷皂苷的質量濃度，根據式（2）計算原薯蕷皂苷的吸附率。

1.2.5 動態解吸條件的確定 把通過靜態與解吸實驗篩選出的大孔樹脂進行濕法裝柱，分別考察不同洗脫劑、洗脫劑用量、不同體積分數的洗脫劑、洗脫劑體積流量等因素，收集不同因素下的各洗脫液，通過測定洗脫液中原薯蕷皂苷的濃度，計算出原薯蕷皂苷的解吸率，以吸附量為指標確定最佳解吸條件。

1.2.5.1 洗脫劑體系的確定 最常用的洗脫劑是水、甲醇、乙醇、丙酮、醋酸乙酯以及它們的混合液等，所以考慮水、甲醇、乙醇、丙酮、醋酸乙酯以及它們的混合液來選擇。精密吸取胡蘆巴提取液裝柱、上樣，然后分別用3BV樹脂床體積數的水、甲醇、乙醇、丙酮、醋酸乙酯、70%甲醇、70%乙醇溶液分別以10BV/h的流速進行解吸，收集洗脫液，測定原薯蕷皂苷的質量濃度，根據式（3）計算原薯蕷皂苷的解吸率。

1.2.5.2 洗脫劑用量的確定 精密吸取胡蘆巴提取液上樣，然后用70%乙醇，以10BV/h的速度洗脫，按樹脂床體積1、2、3、4、5BV的70%乙醇洗脫劑分別收集洗脫液，測定洗脫液中原薯蕷皂苷的質量濃度，根據式（3）計算原薯蕷皂苷的解吸率。

1.2.5.3 洗脫劑濃度的確定 精密吸取胡蘆巴提取液上樣，然后分別用15%、30%、50%、70%、90%乙醇溶液以10BV/h的流速進行解吸，收集洗脫液，測定原薯蕷皂苷的質量濃度，根據式（3）計算原薯蕷皂苷的解吸率。

1.2.5.4 洗脫劑體積流量的確定 精密吸取胡蘆巴提取液上樣，以3BV的70%乙醇溶液作為洗脫劑，分別以4、8、10、12、15BV/h的流速進行解吸，收集洗脫液，測定，根據式（3）計算原薯蕷皂苷的解吸率。

2 結果與分析

2.1 大孔吸附樹脂的篩選

通過靜態吸附與解吸實驗測定了10種大孔樹脂對原薯蕷皂苷的的吸附量和解吸率，吸附量和解吸率的按照1.2.3項下式（1）和式（2）計算，結果見表1。

從表1可看出，不同廠家不同型號的大孔吸附樹脂對原薯蕷皂苷的吸附量與解吸率均不同，其中HP-20型大孔吸附樹脂吸附量最大，且解吸率也最高，故選用HP-20型大孔吸附樹脂作為胡蘆巴中原薯蕷皂苷的純化樹脂。

表1 不同類型大孔樹脂對原薯蕷皂苷的靜態吸附量及解吸率Table 1 Static adsorption of protodioscin capacity and desorption rate of different types of macroporous resin

2.2 動態吸附條件的確定

2.2.1 上柱吸附體積流量的確定 上柱吸附體積流量是影響吸附率的重要因素，原薯蕷皂苷在樹脂床上的吸附需要有一個過程，若藥液的上柱吸附體積流量過快，部分原薯蕷皂苷未及吸附就會泄漏，因此應適當控制吸附體積流量，實際實驗結果見圖1，圖1表明當吸附體積流量小于4BV/h時，原薯蕷皂苷吸附率均較高，考慮時間因素，綜合考慮最后選擇吸附體積流量為4BV/h，當吸附體積流量為4BV/h時，可保證原薯蕷皂苷在樹脂上有較高的吸附率。

圖1 上柱吸附體積流量對吸附率的影響Fig.1 Effect of column adsorption volume flow on adsorption rate

2.2.2 樹脂藥材質量比的確定 樹脂藥材比是影響原薯蕷皂苷轉移率的重要因素，樹脂藥材質量比值過小，會引起藥量超載，使藥物泄漏流失。樹脂藥材質量比值過大，能充分吸附原薯蕷皂甙，但卻沒有充分利用樹脂的吸附能力，實際實驗結果見圖2。圖2表明，樹脂藥材質量比在16∶1～4∶1時，吸附率均較高，考慮到樹脂藥材質量比越小，上柱時間越長，增加成本，為減少上柱時間，綜合考慮確定樹脂藥材質量比為8∶1。

2.2.3 樹脂柱徑高比的確定 通過實驗得出樹脂徑高比對吸附率影響的實驗，實驗結果見圖3，可以看出樹脂的徑高比對吸附率亦有較大影響，在樹脂柱直徑一定的條件下，樹脂高度越高，柱效越高，在一定的上樣量的情況下，隨柱長的增加，吸附率增加，柱分離次數增加，太低則柱效過低，吸附路徑過短，則會容易造成泄漏。從圖3可看出，樹脂柱徑高比在1∶9～1∶15時，原薯蕷皂苷的吸附率均較高，從工業化生產的成本考慮，樹脂徑高比確定為1∶12較為妥當。

圖2 樹脂藥材質量比對吸附率的影響Fig.2 Effect of the mass ratio between resin and herbs on adsorption rate

圖3 樹脂徑高比對吸附率的影響Fig.3 Effect of the ratio between diameter and height on adsorption rate

2.3 動態解吸條件的確定

2.3.1 洗脫劑體系的確定 通過不同洗脫劑對原薯蕷皂苷的解吸率的實驗，實驗結果見圖4，由圖4可看出，采用乙醇、甲醇-水、乙醇-水、丙酮體系對原薯蕷皂苷均有比較好的洗脫效果。其中丙酮、70%甲醇和70%乙醇的洗脫效果更好，但考慮到丙酮的的成本和其揮發性，還有甲醇的毒性，實際工作的安全、成本等問題，最后確定以70%乙醇-水作為洗脫劑體系。

圖4 洗脫劑體系對解吸率的影響Fig.4 The influence of eluent system on desorption rate

2.3.2 洗脫劑用量的確定 洗脫劑用量也是影響解吸率的重要因素，洗脫劑用量少，不能充分把原薯蕷皂苷洗脫下來，反之洗脫劑用量太多，會使工業生產成本增大。洗脫劑用量對解吸率的影響實驗結果見圖5，從圖5可以看出，當洗脫劑用量為3、4、5BV時，都可基本將提取液中原薯蕷皂苷洗脫干凈，綜合考慮時間和成本，選擇3BV的洗脫劑作為到達終點時洗脫劑的用量。

圖5 洗脫劑用量對解吸率的影響Fig.5 Effct of dosage of eluenton on desorption rate

2.3.3 洗脫劑濃度的確定 乙醇溶液濃度對解吸率的影響結果見圖6，圖6表明隨著洗脫劑中乙醇體積分數的增大，原薯蕷皂苷的解吸率逐漸增大，當乙醇體積分數大于70%時具有較高的洗脫能力，但同時觀察到隨著乙醇體積分數的增加，洗脫液顏色明顯變深，說明已將許多有色雜質洗下，因此，在保證解吸率較高的條件下，應選用較低體積分數的乙醇溶液，減少脂溶性雜質，提高洗脫液中原薯蕷皂苷的純度。另外考慮到體積分數太低，洗脫速度過慢，洗脫劑用量大，同時鑒于洗脫終點檢查的靈敏度，可能會造成洗脫不完全，因此，應選擇一個適中的體積分數，綜合考慮，選擇以70%乙醇作為洗脫劑較為妥當。

圖6 乙醇溶液濃度對解吸率的影響Fig.6 Effct of ethanol solution concentration on desorption rate

2.3.4 洗脫劑體積流量的確定 洗脫劑體積流量的對解吸率影響的實驗結果見圖7，由圖7表明，表明洗脫劑體積流量4～10BV/h轉移效果均較好，基本能將原薯蕷皂苷洗脫干凈。但同時考慮到洗脫劑流速過快會導致原薯蕷皂苷來不及解吸而造成損失，過慢會導致洗脫時間更長，綜合考慮，原薯蕷皂苷的洗脫流速選擇在10BV/h。

圖7 洗脫劑體積流量對解吸率的影響Fig.7 Effct of eluent volume flow on desorption rate

3 結論與討論

原薯蕷皂苷在植物中的含量很低，文獻報道中提取分離的主要辦法是用有機溶劑提取后，再用硅膠柱和甲醇-氯仿作為洗脫劑，反復進行層析分離得到原薯蕷皂苷[9-11]。大孔吸附樹脂用于原薯蕷皂苷的純化，國內還未見有文獻報道，是一個值得研究的課題。

HP-20型大孔吸附樹脂是高多孔性苯乙烯型樹脂，具有很好的吸附和脫附性能，鄧潔紅等篩選出HP-20樹脂作為對刺葡萄皮色素的最佳樹脂[12]，龔志華等大孔吸附樹脂分離純化兒茶素EGCg，EGCg的純度和得率分別達68.32%和72.08%[13]。

本實驗比較多種型號大孔吸附樹脂的靜態飽和吸附量和解吸率，篩選出最佳的大孔吸附樹脂是HP-20型，HP-20型大孔吸附樹脂純化原薯蕷皂苷的最佳工藝為：上柱吸附體積流量為4BV/h，樹脂藥材質量比為8∶1，樹脂柱徑高比在1∶12，以70%乙醇-水體系作為洗脫劑，洗脫劑用量為3BV，洗脫劑流量為10BV/h。

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