乙肝病毒HBx基因穩轉細胞系的建立及其誘導的內質網應激

陸 鵬，姜同翠，陳 露，沈玉君，沈玉先，方圣云

乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)感染引起的慢性乙型肝炎被普遍認為是導致肝癌發生的重要因素。據統計，我國半數以上的肝癌患者有慢性乙肝病史。研究［1－3］顯示亞洲和北美地區乙肝抗原陽性攜帶者罹患肝癌的比例是非感染人群的25～37倍。HBV是嗜肝DNA病毒家族的溶原性病毒，基因組呈雙鏈環狀結構，含有4個開放讀碼框架，分別為S、P、C、X區，其中 X區所編碼的產物 HBx蛋白(hepatitis B virus X protein)是一種多功能的調節蛋白，具有廣泛的反式激活功能。內質網(endoplasmic reticulum，ER)應激是真核細胞的一種保護性應激反應，是通過激活未折疊蛋白反應通路，以此來減少細胞內蛋白的異常聚集，起到細胞保護作用。近年來ER應激相關調節因子參與腫瘤的發生和發展受到廣泛關注，但關于HBV病毒HBx蛋白的過度表達在肝癌的發生發展中的作用，目前仍不清楚。該實驗通過克隆HBx基因并建立穩定表達HBx蛋白的肝癌細胞系，觀察HBx的過度表達是否可引起ER應激及對肝癌細胞增殖活性的影響，為后續相關機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株、菌株及質粒 人肝癌細胞株HepG2購自中國科學院上海細胞庫;表達HBV全基因組的肝癌細胞株HepG2.2.15為沈繼龍教授惠贈;菌株E.coli DH5α 為本實驗室保存;質粒 pcDNA3.1 Vector為美國馬里蘭大學方圣云教授惠贈;真核表達重組質粒pcDNA3.1-HBx由本實驗室構建。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養基、opti-MEM購自美國Gibco公司;胎牛血清購自杭州四季青公司;膠回收試劑盒、質粒小量提取試劑盒購自美國Axygen公司;質粒大量提取試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司;G418購自上海生工生物工程有限公司;脂質體Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司;DNA連接酶、ExTaq和各種限制性內切酶購自日本TaKaRa公司;其他試劑均為國產或進口分析純。

1.1.3 引物 引物均由上海生工生物工程有限公司合成，見表1。

1.1.4 抗體 乙型肝炎病毒X蛋白(HBxAg)抗體購自美國BBI公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物設計 實驗所需的引物使用Primer premier 5.0軟件設計，由上海生工生物工程有限公司合成。根據GenBank上HBx基因序列設計一對引物，HBx-F包含了HindⅢ酶切位點(表1中下劃線標注)，引物HBx-R包含了EcoRⅠ酶切位點，見表1。

1.2.2 質粒構建 以 HepG2.2.15細胞 DNA 為模板，使用上游引物HBxF和下游引物HBxR，PCR擴增HBx序列。反應條件:95℃預變性5 min，95℃45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共 35 個循環，末次循環后72℃10 min反應結束。將PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，用膠回收試劑盒進行純化。將回收的PCR產物和pcDNA3.1載體分別進行雙酶切，限制性內切酶為HindⅢ和EcoRⅠ。酶切后將擴增片段連接入pcDNA3.1載體并轉化DH5α感受態細胞，提取質粒后再使用HindⅢ和EcoRⅠ酶切鑒定。酶切片段正確的pcDNA3.1-HBx質粒由美國Invitrogen公司測序。

表1 PCR引物序列

1.2.3 穩轉細胞株的建立及HBx蛋白表達的鑒定將HepG2細胞接種到培養板上，待匯合度達80%～90%進行轉染。50 μl Opti-MEM 稀釋 1 μg pcDNA3.1-HBx質粒混勻，同樣稀釋 2 μl脂質體 lipofectamine 2000于Opti-MEM中，具體操作按說明書進行。48 h后用G418進行篩選，濃度選擇0.5 g/L。同理轉染pcDNA3.1空載體作對照。該細胞系生長穩定后收集細胞進行Western blot實驗，用HBx抗體進行檢測。

1.2.4 HBx對HepG2細胞增殖的影響 將處于對數生長期的HepG2細胞、穩轉空載體的HepG2細胞、穩轉HBx蛋白的HepG2細胞按1×104/孔的密度接種到96孔板里，設立不接種細胞的空白對照，每組設6個復孔，置于37℃ CO2培養箱中培養72 h后，每孔各加入100 μl MTT(5 g/L)，37 ℃繼續培養，4 h后終止培養。小心吸去培養液，每孔加入150 μl DMSO，測定前震蕩10 min，使結晶充分溶解。以空白對照調零，于酶聯免疫檢測儀570 nm波長處測定各孔的光密度(optical density，OD)值。

1.2.5 HBx誘導的ER應激 選取ER應激相關基因，包括 PERK、BIP、MANF、ATF-6、XBP-1 和 CHOP，用RT-PCR方法檢測其在HepG2細胞中和過表達HBx蛋白的HepG2細胞中的表達量。

1.3 統計學處理 采用SPSS 16.0統計軟件分析，數據以±s表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett’s T法，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 HBx基因的克隆及真核表達質粒的構建 收集培養的HepG2.2.15細胞，提取DNA，PCR擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳后，在約500 bp處可見明顯的擴增產物條帶，見圖1A，該電泳結果和理論預測值相符。將PCR產物進行EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，然后連接到pcDNA3.1載體上以構建pcDNA3.1-HBx真核表達質粒，pcDNA3.1載體上有氨芐青霉素抗性基因(AmpR)，見圖2。該質粒轉化DH5α，收集細菌抽提質粒，經過EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切后，在465 bp處有一條帶，見圖1B，與基因PCR產物的大小一致，表明目的基因已成功插入pcDNA3.1質粒中，重組表達質粒 pcDNA3.1-HBx構建成功。測得的序列在Pubmed里用BLAST檢測與預期序列一致。

圖1 PCR產物瓊脂糖凝膠電泳及重組質粒酶切鑒定

圖2 質粒pcDNA3.1-HBx的圖譜

2.2 HBx穩轉細胞系的建立及HBx蛋白表達的鑒定 將構建的pcDNA3.1-HBx質粒轉染 HepG2細胞，用G418(0.5 g/L)篩選，然后將細胞充分稀釋以便克隆挑選。挑取單個克隆，見圖3A，轉至6孔板中培養，用G418維持篩選以建立穩轉細胞系。收集細胞并提取蛋白質進行PAGE膠電泳，用抗HBx抗體檢測，結果顯示，轉染HBx的HepG2細胞和HepG2.2.15細胞中有HBx蛋白表達，見圖3B。

圖3 HBx穩轉細胞株的建立及HBx蛋白表達的鑒定

2.3 HBx的表達對HepG2細胞增殖活性的影響用MTT法對各組細胞的增殖活性進行檢查，結果顯示，HepG2.2.15細胞和轉染空白載體的 HepG2細胞在培養72 h時，其增殖活性與HepG2細胞差異無統計學意義(P＞0.05)，而穩轉HBx的HepG2細胞在培養72 h時其增殖活性明顯高于穩轉空白載體的HepG2細胞，差異有統計學意義(F=13.542，P ＜0.01)，見圖4。

2.4 HBx對ER應激相關基因表達的影響 用RT-PCR方法檢測穩轉細胞系中ER應激相關基因的表達情況，結果顯示，穩定表達 HBx蛋白的HepG2 細胞中，BIP、PERK、ATF-6、XBP-1 和 MANF表達上調，而CHOP則表達下調，見圖5。這些結果提示HBx蛋白的過表達可能引起ER應激。

3 討論

圖4 HBx的表達對HepG2細胞增殖活性的影響

圖5 HBx的表達對ER應激相關基因表達的影響

HBx蛋白在激活HBV轉錄調控過程中發揮重要的作用［4］，其能夠參與肝細胞轉化，在細胞周期調控、細胞信號傳導通路和DNA修復中發揮多種功能［5－7］。然而，關于HBV感染導致肝硬化和肝癌的分子機制仍存在爭議，包括HBx蛋白如何促進肝硬化和肝癌的發生發展。HBV基因組編碼的X蛋白被認為是肝炎病毒侵入宿主后介導HBV基因組整合和促進HBV復制過程的主要調節因子［8］。X蛋白轉基因動物可發生肝癌;患者體內X蛋白的表達量與肝癌的發生呈明顯的相關性;這些研究［1，8－9］結果提示X蛋白是促進肝癌發生的主要因素之一。研究［8，10］表明X蛋白在某種狀況下入核，影響體內多種轉錄因子的活性，如 AP-1、NF-κB、STAT3 和CREB/ATF等，使得TNF、TGF-β等基因的表達發生變化，以此促進炎癥向腫瘤的轉化、增殖和轉移。其中TGF-β被認為是促進肝臟纖維化乃至肝硬化的重要調節因子［11］。但也有研究［12］顯示 HBx蛋白可以通過影響細胞凋亡蛋白酶的活性和線粒體的功能促進細胞的凋亡。

HBV表達可以誘發ER應激反應并激活IRE1-XBP1 通路［13－14］。進一步研究［15］顯示，HBV 表面抗原pre-S2突變體蛋白會引起ER應激。pre-S是HBV的一種表面蛋白，其突變型可以逃避宿主免疫攻擊，在ER腔內大量聚集，產生嚴重而持久的ER應激反應，其存在使患者發展為肝癌的概率大大增加，這也提示ER應激反應與肝癌發生之間的密切關系［16］。炎癥反應、氧化應激和ER應激間會相互促進，HBV感染后引起宿主的先天免疫反應和炎癥反應，其炎癥細胞分泌大量的細胞因子、趨化因子、糖類或脂類代謝產物，并產生大量活性氧成分，可引起ER應激反應。而ER應激反應又可通過釋放鈣離子作用于線粒體促進活性氧的產生，加重炎癥反應，氧化應激和炎癥反應的加劇可促進正常肝細胞的惡性轉化［17］。

本研究顯示，HBx的過表達可促進肝癌細胞的增殖。同時也發現UPR相關基因對過表達HBx的反應性不同，HBx蛋白可引起 PERK、BIP、MANF、ATF-6和XBP-1表達升高，而使CHOP表達降低，提示HBx通過作用于不同的UPR通路介導肝細胞的損傷和促使肝細胞的惡性轉化。CHOP是一個促凋亡基因，其低表達可能參與了肝癌細胞的過度增殖。至于HBx對UPR基因差異性調節的原因，可能與ER應激本身具有促增殖和促凋亡的兩重性有關。由此推測ER應激及UPR通路的激活/抑制貫穿于肝炎到肝癌的全過程，各通路間可能存在平衡和補償機制。

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