LY294002靶向抑制PI3K/Akt信號通路干預K562細胞增殖的研究

耿英華，武文娟，于北凱，夏瑞祥

Akt是一類調節細胞凋亡與存活的胞質信號轉導蛋白，生理狀態下，Akt以低活性存在于細胞質中，當各種因素刺激時，Akt在PI3K作用下發生磷酸化而激活［1］。活化的Akt可促進細胞的生存、增殖、轉移以及血管的形成。研究［2－3］表明，Akt在人類多種腫瘤中常被過度活化，如在胃腸道腫瘤、胰腺癌等組織中均高表達及活化。腫瘤細胞中Akt的活化與腫瘤細胞增殖、凋亡密切相關。Akt磷酸化可被PI3K特異性抑制劑LY294002［4］所抑制。該研究以慢性髓系白血病細胞株K562為研究對象，觀察LY294002對K562細胞增殖的影響并探討其相關機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株 人慢性髓系白血病細胞株K562由蚌埠醫學院臨床檢驗診斷學實驗中心凍存。培養條件:含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，同時加入100 U/L鏈霉素和100 U/L青霉素，于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養。每2～3 d傳代1次。實驗時，取對數生長期細胞。

1.2 主要試劑 RPMI 1640培養基(美國Gibco公司);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司);MTT、DMSO(美國Sigma公司);總RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、PCR試劑盒、DNA Marker(北京天根生化科技有限公司);LY294002、PI單染周期檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司);Skp2、GAPDH引物(南京金斯瑞生物科技有限公司);β-actin、Skp2鼠抗人單克隆抗體、山羊抗小鼠二抗(美國Santa Cruz公司);細胞培養板(美國Corning公司)。

1.3 MTT比色法測定 取對數生長期K562細胞，調節細胞濃度為5×104/ml，每孔100 μl種植于96孔培養板中。實驗組LY294002終濃度分別為2.5、5、10、20、40、60 μmol/L，每個濃度設 3 個復孔，同時設陰性對照組和空白調零組，在37℃、5%CO2條件下培養24、48 h后，每孔加MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，繼續孵育 4 h 后終止培養，加 DMSO 150 μl/孔，室溫振搖10 min后，于波長570 nm處讀取吸光度(OD)值。取3孔OD值的均數按公式計算細胞增殖抑制率，細胞增殖抑制率(%)=(1－OD實驗組/OD對照組)×100%

1.4 流式細胞術檢測細胞周期 常規培養K562細胞，取對數生長期細胞調節細胞濃度為5×104/ml，2 ml每孔接種于6孔培養板，分對照組、LY294002終濃度為10、20 μmol/L的實驗組。用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液培養36 h，收集細胞，預冷PBS洗滌1次，離心去除PBS，加入預冷的70%乙醇溶液固定細胞12～24 h，離心棄去固定液，PBS洗滌1次后收集細胞于流式管，每管細胞樣品中加入預先配置好的含有RNase A和PI的染色液0.5 ml，緩慢并充分重懸細胞，37℃避光孵育30 min，隨后冰浴放置并用BD流式細胞儀在488 nm激發波長下檢測紅色熒光和光散射情況，Flowjo軟件分析細胞周期。

1.5 RT-PCR法檢測Skp2 mRNA表達 取對數生長期 K562細胞接種于6孔板，分對照組、LY294002終濃度為10、20 μmol/L的實驗組。用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養液培養36 h，收集細胞。按照試劑盒說明提取總RNA，檢測RNA提取純度及濃度，每組取2 μg RNA進行逆轉錄，并對各組細胞的目的基因Skp2和內參基因GAPDH進行PCR擴增。擴增條件為94℃預變性5 min;94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，32個循環;72℃延伸10 min。擴增產物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，BIO-RAD凝膠成像儀檢測條帶并分析灰度值，計算各組Skp2 mRNA相對量。實驗重復3次。見表1。

表1 待測基因的PCR引物序列及擴增片段長度

1.6 Western blot法檢測Skp2蛋白表達的變化取對數生長期K562細胞接種于6孔板，分對照組、LY294002終濃度為 10、20 μmol/L的實驗組，培養36 h后收集細胞，加蛋白裂解液冰上裂解30 min，采用BCA法對各組蛋白進行定量檢測。每組取25 μg蛋白，10%SDS-PAGE電泳，轉膜至PVDF膜，封閉液室溫封閉3 h;小鼠抗人Skp2一抗按1∶1 000稀釋，小鼠抗人β-actin一抗按1∶3 000稀釋，4℃搖床上孵育過夜;TBST洗膜10 min，重復3次;山羊抗小鼠二抗按1∶5 000稀釋，37℃孵育2 h;TBST洗膜10 min，重復3次;最后用ECL發光試劑盒顯影;BIO-RAD凝膠成像儀檢測條帶并進行灰度值分析，計算各組Skp2蛋白相對量。實驗重復3次。

1.7 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行分析，實驗數據以±s表示，各處理組間差異采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法。

2 結果

圖1 流式細胞術檢測LY294002作用K562細胞36 h后各組細胞周期分布情況

2.1 不同濃度LY294002對K562細胞增殖抑制作用 MTT法檢測各組細胞的增殖抑制率的結果表明:不同濃度LY294002對K562細胞的增殖均有抑制作用，在相同作用時間下，增殖抑制作用與LY294002濃度呈正比關系，濃度越高，抑制作用越強;在同一濃度下，LY294002作用時間越長，細胞增殖抑制率越高，表現出時間-劑量依賴性，見表2。

2.2 LY294002對細胞周期的影響 LY294002作用于K562細胞36 h后，流式細胞術檢測結果表明:LY294002能顯著改變G0/G1與S期細胞的比例。與對照組相比，隨著LY294002濃度的升高，S期細胞比例逐漸減少，G0/G1期細胞則呈現出逐漸增加的趨勢，差異有統計學意義(P＜0.05)，G2/M期細胞沒有顯著變化(P＞0.05)。見圖1、表3。

表2 不同濃度LY294002作用不同時間后K562細胞的增殖抑制率(n=3，±s)

表2 不同濃度LY294002作用不同時間后K562細胞的增殖抑制率(n=3，±s)

與對照組(0 μmol/L LY294002)比較:*P＜0.05;與同一濃度的24 h實驗組比較:#P＜0.05

?

表3 LY294002對K562細胞周期分布的影響(%，±s)

表3 LY294002對K562細胞周期分布的影響(%，±s)

與對照組(0 μmol/L LY294002)相比:*P ＜0.05;與 10 μmol/L LY294002組比較:#P＜0.05

?

2.3 LY294002對Skp2 mRNA表達的影響 RTPCR法結果顯示:與對照組相比，10、20 μmol/L LY294002作用K562細胞36 h后，Skp2 mRNA的表達受影響，相對表達量分別為0.367±0.035、0.242±0.025，與對照組(0.476±0.027)相比，表達量明顯降低，差異有統計學意義(P＜0.05)。見圖2。

圖2 LY294002作用于K562細胞36 h后Skp2 mRNA的表達變化

2.4 LY294002對Skp2蛋白表達的影響 Western blot法結果表明，經LY294002作用36 h后，Skp2蛋白的表達量顯著降低，10、20 μmol/L LY294002實驗組Skp2蛋白相對表達量分別為0.528±0.091和0.349±0.067，與對照組(0.695±0.077)比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。見圖3。

圖3 LY294002作用于K562細胞36 h后Skp2蛋白的表達

3 討論

白血病是一類造血干細胞的惡性克隆性疾病，是最常見的血液系統惡性疾病。當前臨床使用的治療藥物多數為細胞毒類藥物，此類藥物一般抑制細胞的DNA和蛋白質合成等基本機能，所以對正常細胞也有毒性，從而引起一系列的毒副作用等。20世紀末以來，分子靶向抗癌藥物成為腫瘤治療研究最活躍的領域之一。此類藥物一般作用于腫瘤細胞的特定分子靶點，利用腫瘤細胞與正常細胞在基因、酶、信號轉導等方面的異常，選擇性抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移等惡性生物行為，從而產生抗腫瘤作用，而對正常細胞的副作用較小。因此分子靶向抗癌藥物很少產生傳統化療的毒副作用。

PI3K為一類脂激酶，主要催化磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(PIP2)磷酸化形成磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸(PIP3)，繼而激活下游的Akt(蛋白激酶B)等促進細胞的生存、增殖、轉移以及血管生成。生理狀態下，Akt以低活性存在于細胞質中，當各種因素刺激時，Akt在PI3K作用下發生磷酸化而激活。PI3K/Akt信號通路誘導細胞的增殖、分化，避免細胞發生凋亡，此信號通路作為細胞生長增殖的重要轉導通路，在維持細胞惡性生物學特性中起重要作用［5］。因此抑制該信號通路成為腫瘤治療靶點之一。LY294002改造自槲皮素，是經典的PI3K抑制劑，其可以在上游非特異性地阻斷 PI3K/Akt信號通路，誘導腫瘤細胞凋亡［6－7］。在細胞增殖實驗中發現LY294002體外作用K562細胞后，細胞增殖抑制率隨著作用時間和作用濃度的增加而逐漸增強，為明確LY294002抑制白血病細胞增殖的機制，本研究選取36 h這個時間點通過細胞周期實驗和檢測細胞周期中重要的調節因子Skp2做進一步的探究。細胞周期調控與細胞增殖密切相關，在細胞周期調控中其增殖的速度是由G1期的長短決定的，當處于G0/G1細胞越多，S期細胞越少時細胞的增殖速度就會越低，這也是很多抗腫瘤藥物抑制腫瘤細胞增殖的機制之一，該研究顯示在不同濃度LY294002作用下，S期細胞比例減少，G0/G1期細胞增加，即表現為細胞被阻滯于G0/G1期，且這種阻滯效應隨著LY294002濃度的升高而更加明顯，而G2/M期變化不大。這與李燾等［8］在腦膠質瘤 U87細胞株的研究結果相近。因此可以認為LY294002的使用產生了周期阻滯，抑制了K562細胞的增殖過程。

Skp2是細胞周期中重要的調節因子，能特異性識別磷酸化底物并介導其泛素化降解，許多細胞周期調控因子如p27、P21、cyclinE、cyclinD 和C-myc等都是Skp2依賴性泛素蛋白酶體途徑底物。研究［9-11］表明，Skp2能夠負調控細胞周期調節因子p27，下調的p27能夠使細胞順利通過G1-S期調控點，完成G1→S期的轉變。Skp2在腫瘤細胞中異常高表達，與多種惡性腫瘤的發生和發展密切相關［12］。Skp2的表達降低能夠抑制腫瘤細胞的周期轉換，從而影響腫瘤細胞增殖［13］。本研究結果表明LY294002作用K562細胞36 h后Skp2 mRNA和Skp2蛋白水平隨藥物濃度增加而顯著下降，使細胞周期不能順利通過G1-S期的調控點，阻滯在G0/G1期，S期細胞減少。由此推測，阻斷PI3K/Akt通路的抗腫瘤細胞增殖效應可能是通過下調Skp2的表達來實現的。

綜上所述，LY294002能夠通過抑制Skp2的表達，使K562細胞的生長周期受影響，無法順利通過G1-S期限制點，形成G0/G1期阻滯，從而抑制K562細胞的增殖，為PI3K/Akt信號通路成為白血病治療靶點奠定理論與實驗基礎。

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