安徽省漢族人群Miltenberger血型調查分析

周 娟，呂 蓉，朱幫強，韓婷婷，劉 忠，4

MNS血型系統是第2個被發現的血型系統，其復雜程度僅次于Rh血型系統［1］。MNS系統包括一些變異的低頻率抗原，這些抗原聯系在一起組成Miltenberger血型系統，其中Mur抗原是該血型系統中最常見的一種抗原，在中國人中具有相對較高的頻率。Miltenberger血型系統在輸血醫學中具有重要意義。有報道［2－3］表明，抗Mur抗體能引起嚴重的溶血性輸血反應及新生兒溶血病，因此，對中國人群Miltenberger血型分布進行調查，評估因Miltenberger血型不配合引起輸血反應的風險，有一定的臨床意義。該研究采用序列特異性引物PCR(PCRSSP)法對安徽省2 660例漢族人群Miltenberger血型進行了檢測，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 樣本 隨機選取安徽省血液中心2 660例非血緣關系的漢族無償志愿獻血者，經外周靜脈采血5 ml并用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝。標準標本和血清:Mur抗原陽性標本6份、陰性標本2份以及抗-Mur標準血清1份，均由中山市紅十字中心血站提供。

1.2 主要試劑與儀器 ① PCR試劑:血液基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技北京有限公司，批號:M1218);dNTPs(批號:CBH801A)、DL2000 Marker(批號:B7001A)(大連TaKaRa公司);SYBR Green I核苷酸膠體染料(美國 Invitrogen公司，批號:416154);MgCl2、10 × PCR Buffer、AmpliTaq 金牌酶 (美 國 ABI公 司，批 號:R01012、R02959、R04816);測序反應及純化試劑:ExoSAP-1T蝦堿磷酸酶(美國Promega公司);BigDye V3.1測序試劑盒(美國ABI公司);② 主要儀器:Biophotometer型DNA濃度測定儀(德國Eppendorf公司);PCT-200 PCR擴增儀(美國MJ Research公司);PRISM 3730測序儀(美國ABI公司)。

1.3 引物 按照文獻［4］設計并委托上海英俊生物技術公司合成包括GYP.Mur基因在內的序列特異性引物，測序引物同擴增引物。可以檢測到Miltenberger血型系統的表型有 GP.Mur、GP.Hop、GP.Bun、GP.Hut、GP.HF，人類生長激素(HGH)基因引物作為對照，引物序列見表1。

表1 引物序列及擴增長度

1.4 基因組DNA提取 采用離心柱法，使用天根血液基因組提取試劑盒從EDTA抗凝血中提取基因組DNA，并通過DNA濃度測定儀對其濃度、純度進行測定。

1.5 PCR-SSP法檢測Miltenberger血型系統 ①PCR 擴增體系:反應總體積為 50 μl，其中含 2 μl模板 DNA，5 μl 10 × PCR Buffer，1.5 mmol/L MgCl2，0.1 mmol/L dNTPs，10 μmol/L 引物各 1 μl，Ampli-Taq金牌酶0.75 U。②PCR擴增條件:95℃預變性15 min;然后94℃變性20 s，65℃退火20 s，72℃延伸20 s，35個循環后72℃延伸10 min。③ 產物分析:取擴增產物10 μl與已加SYBR Green染料的6×Loading Buffer 2 μl混合，直接點樣至2%瓊脂糖凝膠(不含EB)，95 V電泳30 min，用凝膠成像儀觀察結果并作出判斷。

1.6 Mur血型血清學鑒定 采用鹽水法，抗-Mur標準血清2滴，加3% ～5%PCR-SSP陽性標本的紅細胞1滴，混勻，3 000 r/min離心18 s。若鹽水法無凝集，再做凝聚胺法進一步加強，并觀察結果。

1.7 測序驗證 ① PCR擴增產物的純化:在每5 μl PCR產物中加入2 μl ExoSAP-1T蝦堿磷酸酶，消化條件為37℃ 30 min，80℃ 15 min，然后冷卻至4℃。②PCR純化產物的直接測序:PCR純化產物為測序反應模板，使用BigDye V3.1測序試劑盒進行雙向測序，測序引物即擴增引物;采用醋酸鈉/乙醇法純化測序PCR產物，取純化產物上測序儀進行電泳測序，Sequencing Analysis軟件進行序列分析。

2 結果

2.1 PCR-SSP檢測Miltenberger血型系統 采用PCR-SSP法對2 660份獻血者樣本進行篩查，有24份陽性(0.9%)。擴增結果見圖1。

圖1 PCR-SSP產物電泳結果

2.2 血清學試驗驗證 鹽水法檢測PCR-SSP陽性標本的紅細胞均與抗-Mur標準血清發生凝集反應，表明存在Mur抗原。

2.3 基因測序結果分析 應用特異性引物對24例陽性標本進行PCR擴增，擴增后產物進行測序，測序結果與GenBank中Miltenberger血型系統基因參照序列比較，結果與GenBank的JN201202序列(即GP.Mur序列)一致(圖2)，表明這24例標本均為GP.Mur表型。

圖2 陽性標本的測序情況

3 討論

Miltenberger血型系統中Mur抗原的臨床意義最大，而其在不同種族中的分布差異較大，在人類學研究中也是一個有用的工具。本組實驗結果顯示安徽省漢族人群GP.Mur表型頻率為0.9%。GP.Mur表型在東南亞人群中有較高的頻率，泰國人為9.7%，臺灣一般人群平均頻率為7.3%［5］。Mur抗原在我國不同地區的漢族人群中的頻率分布有差異，在廣州番禺地區的頻率為7.16%［6］，上海市的頻率為0.67%［7］。Mur抗原在我國一些少數民族地區的分布頻率更高，調查發現在云南怒族的頻率高達22.65%［8］，廣西侗族、壯族分別占15.4%［9］和11.29%［10］。

Miltenberger血型系統存在11個低頻抗原，即Mia、Vw、Hut、Mur、MUT、Hil、TSEN、MINY、Hop、Nob和DANE，這些抗原交叉組成11種不同表型，即GP.Vw、GP.Hut、GP.Mur、GP.Hop、GP.Hil、GP.Bun、GP.Nob、GP.Joh、GP.Dane、GP.HF 以及 GP.JL。Miltenberger血型系統產生的機制為血型糖蛋白A(GPA)和血型糖蛋白B(GPB)的基因發生重組，即GYP(A－B)、GYP(A－B－A)、GYP(B－AB)雜交基因所致，其編碼基因GYPA、GYPB位于染色體4q28 －31［11］。GYP(A －B)雜交基因編碼 GP.Hil和 GP.JL［12］。對于 GYP.Hil、GYPA 與 GYPB 的交換位點位于GYPA內含子3的5'端，而GYP.JL交換位點位于內含子3的3'端，并包括GYPB外顯子4的 7 個核苷酸。GP.Vw、GP.Hut、GP.Nob、GP.Joh以及GP.Dane都是由GYP(A－B－A)雜交基因所編碼［12］。在這些雜交基因中，GYPB假外顯子不同大小(1～16 bp)的插入片段替換了相同數目GYPA外顯子3的核苷酸。GYP(B－A－B)雜交基因所編碼 GP.Mur、GP.Hop、GP.Bun 以及 GP.HF［12］。在這些雜交基因中，通常沉默的GYPB假外顯子3表達。在亞洲人群中，Mur抗原是其中最常見的一種抗原。該抗原是由于GYPB的假外顯子3的部分片段被同源GYPA的外顯子3替代，從而形成GYP(B－AB)結構，導致外顯子3的剪切位點被激活而表達Mur抗原，其特異的氨基酸序列為(34TPAHANE41)［13］。

由于Mur抗原在臍帶血中有很好的表達，易引起新生兒溶血病，也可引起嚴重的輸血反應。因此，在輸血反應原因分析時應考慮Mur抗原抗體反應。Miltenberger血型的分布和獻血者資料是建立當地紅細胞庫的前提。此外，Mur抗原在安徽省的頻率較高，輸入這種血型的血液是否產生抗體，需要后續的進一步研究來證實。

［1］Daniels G.Human blood groups［M］.2nd ed.Oxford:Blackwell Science，2002:125 －40.

［2］莫秋紅，劉金蓮，周先果，等.引起溶血性輸血反應3例低頻率抗-Mur抗體特征探析［J］.內科，2009，4(4):572－3.

［3］Wu K H，Chang J G，Lin M，et al.Hydrops foetails caused by anti-Mur in first pregnancy-a case report［J］.Transfus Med，2002，12(5):325－7.

［4］Palacajornsuk P，Nathalang O，Tantimavanich S，et al.Detection of MNS hybrid molecules in the Thai population using PCR-SSP technique［J］.Transfus Med，2007，17(3):169 －74.

［5］Shih M C，Yang L H，Wang N M，et al.Genomic typing of human red cell miltenberger glycophorins in a Taiwanese population［J］.Transfusion，2000，40(1):54 －61.

［6］嚴康峰，鄧詩楨，謝敬文.番禺地區Mur抗原與抗-Mur頻率調查［J］.中國輸血雜志，2010，23(3):218.

［7］朱自嚴，沈 偉，陳和平，等.上海地區部分人群Jk(a-b-)、Dib-、Wrb-、K0、Ena-、Tja-、Ge-稀有血型篩選 ［J］.中國輸血雜志，2002，15(4):232－3.

［8］黃秀瓊，陳麗瓊，朱自嚴，等.云南怒族稀有血型MNSs系統-(Mur)抗原抽樣調查分析［J］.大理學院學報，2004，3(1):39－40.

［9］焦 偉，黎海瀾，朱自嚴，等.廣西侗族人群稀有血型Mur抗原的調查研究［J］.廣西醫科大學學報，2010，27(6):962.

［10］焦 偉，黎海瀾，朱自嚴，等.廣西壯族人群稀有血型篩選［J］.現代免疫學，2011，31(5):401－4.

［11］Reid M E，Lamont R E，Zelinski T，et al.Human blood group genes 2004:chromosomal locations and cloning strategies［J］.Transf Med Rev，2005，19(1):45 －57.

［12］Palacajornsuk P.Review:molecular basis of MNS blood group variants［J］.Immunohematology，2006，22(4):171 －82.

［13］Storry J R，Poole J，Condon J，et al.Identification of a novel hybrid glycophorin gene encoding GP.Hop［J］.Transfusion，2000，40(5):560－5.