T細(xì)胞亞群與慢性丙型肝炎病毒相關(guān)性分析

殷先堯，鄭美娟，徐元宏

慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C，CHC)是全球范圍的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，全世界約2億人口感染丙肝病毒(hepatitis C virus，HCV)，其中54%～86%的感染者6個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)感染慢性化，形成持續(xù)性感染。我國(guó)是該病的高發(fā)地區(qū)，感染率約為3.2%［1］。患者病程變化與T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量和功能的相關(guān)性，已被多項(xiàng)研究證明可能是致病及慢性化因素［2］。CHC慢性化的機(jī)制，尤其是宿主的免疫因素引起的免疫反應(yīng)已成為研究的熱點(diǎn)之一。該研究對(duì)患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群及血清中HCV RNA復(fù)制載量水平進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)其之間相互關(guān)系進(jìn)行了分析，以了解CHC患者機(jī)體的免疫功能紊亂情況，旨在對(duì)CHC發(fā)病機(jī)制及其防治提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例資料 收集2012年10月～2013年7月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診及住院的69例CHC患者，其中男23例，女46例，年齡17～67(45.8±13.8)歲，診斷均符合2011年《丙型肝炎防治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］，并排除合并其他病毒性肝炎、自身免疫性疾病、酒精性肝病、肝硬化、腫瘤、代謝性疾病及嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病，實(shí)驗(yàn)檢查前6個(gè)月均無(wú)抗病毒和免疫調(diào)節(jié)藥物治療。按照不同的HCV RNA載量水平分為高載量組、中載量組、低載量組作為實(shí)驗(yàn)組，其中高載量組的HCV RNA載量為＞1.00×105copies/ml;中載量組的HCV RNA載量為1.00×103～1.00×105copies/ml;低載量組的 HCV RNA載量為＜1.00×103copies/ml。另選年齡和性別匹配的健康體檢者20例作為正常對(duì)照組，年齡36～59(44.6±6.6)歲。實(shí)驗(yàn)組及正常對(duì)照組肝腎功能各項(xiàng)指標(biāo)處于正常范圍。

1.2 儀器和試劑 COULTER Epics XL MCL流式細(xì)胞儀為美國(guó)BECKMAN COULTER公司;CD3/CD4/CD8熒光標(biāo)記單克隆抗體及紅細(xì)胞裂解液為Opti-Clone原裝配套試劑;PCR擴(kuò)增儀為瑞士Roche公司的Light-Cycler熒光定量核酸擴(kuò)增儀;HCV核酸定量試劑盒為上海科華生物工程股份有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 HCV RNA載量檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書步驟進(jìn)行，HCV RNA檢測(cè)單位用copies/ml表示。

1.3.2 T細(xì)胞亞群檢測(cè) 取CHC患者及正常健康者外周靜脈血1 ml，EDTA-K2抗凝。于干凈試管中加入20 μl三標(biāo)記單克隆抗體CD4-PE/CD8-ECD/CD3-PC5，再加入100 μl抗凝靜脈血，充分混勻，25℃避光孵育15 min，加入紅細(xì)胞溶解液250 μl，充分溶解紅細(xì)胞20 min后，以1 200 r/min的速度離心5 min，去上清液，PBS緩沖液沖洗2次，最后以500 μl的PBS緩沖液懸浮細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)10 000個(gè)淋巴細(xì)胞，各細(xì)胞亞群用百分比表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較用t檢驗(yàn)分析。多組間兩兩比較用方差檢驗(yàn)分析，相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 CHC患者外周血T細(xì)胞亞群分布 CHC患者外周血T細(xì)胞亞群與正常健康者之間關(guān)系見表1。CHC患者外周血T細(xì)胞亞群的流式散點(diǎn)圖見圖1。

表1 CHC患者和正常健康者T細(xì)胞亞群分布(±s)

表1 CHC患者和正常健康者T細(xì)胞亞群分布(±s)

?

圖1 CHC患者CD4+、CD8+細(xì)胞流式散點(diǎn)圖

2.2CHC患者HCV RNA載量與外周血T細(xì)胞亞群的相關(guān)性分析 從表2可看出各組之間比較，通過(guò)Spearman等級(jí)相關(guān)分析得知，CD3+T細(xì)胞百分率與 HCV RNA載量無(wú)相關(guān)性(r=0.068，P=0.576);CD4+T細(xì)胞百分率、CD8+T細(xì)胞百分率及CD4+/CD8+比值均與 HCV RNA載量相關(guān)(r=0.477，P ＜0.01;r=0.599，P ＜0.01;r=0.896，P ＜0.01)。即隨著HCV RNA載量的增加，CD8+T細(xì)胞百分率逐漸增加，而 CD4+T細(xì)胞百分率及CD4+/CD8+比值逐漸降低，見圖2。

表2 不同HCV RNA載量CHC患者外周血T細(xì)胞亞群分布(±s)

表2 不同HCV RNA載量CHC患者外周血T細(xì)胞亞群分布(±s)

與高載量組比較:＊＊P＜0.01;與中載量組比較:＆P＜0.05，＆＆P＜0.01;與正常對(duì)照組比較:#P＜0.05，##P＜0.01

?

圖2 HCV RNA載量與外周血T細(xì)胞亞群的相關(guān)性分析

3 討論

研究［4－5］顯示細(xì)胞免疫應(yīng)答對(duì)CHC患者病情發(fā)展及轉(zhuǎn)歸起主要作用，淋巴細(xì)胞是人體主要的免疫細(xì)胞也是機(jī)體免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)，其數(shù)量的變化在一定程度上反映了機(jī)體的免疫水平。當(dāng)HCV侵犯肝臟時(shí)，由于肝臟及機(jī)體本身有極強(qiáng)的代償能力，導(dǎo)致臨床上往往并不體現(xiàn)為血清生化指標(biāo)的上升，而免疫功能紊亂才是造成肝損傷的重要因素［6］。外周血T淋巴細(xì)胞各亞群水平間的相對(duì)穩(wěn)定是機(jī)體發(fā)揮正常免疫功能的重要基礎(chǔ)。T淋巴細(xì)胞的數(shù)量和各亞群比例是反映機(jī)體免疫水平的主要標(biāo)志，CD3+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞除在免疫應(yīng)答中起輔助、誘導(dǎo)作用外，還可分泌淋巴因子，啟動(dòng)遲發(fā)性超敏反應(yīng)，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化，引起肝細(xì)胞損傷的效應(yīng)［5］;CD4+T細(xì)胞還能促進(jìn)B細(xì)胞、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞的增殖及分化，調(diào)節(jié)體液免疫和細(xì)胞免疫。CD8+T細(xì)胞由細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和少許抑制性T細(xì)胞組成，正常情況下，兩者保持一定的比例，維持機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。

本研究顯示，CHC患者CD8+比例高于正常健康者，而CD4+細(xì)胞、CD4+/CD8+比值均低于正常健康者，CD3+T細(xì)胞與正常健康者之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與國(guó)內(nèi)學(xué)者的報(bào)道［7－8］一致。HCV感染后引起外周血T細(xì)胞亞群的這種變化可能是CHC慢性化的重要原因之一，迄今為止，HCV的致病機(jī)制仍不明確，細(xì)胞免疫可能是HCV發(fā)病的主要機(jī)制，CHC患者在抗原提呈細(xì)胞的作用下HCV致敏的CD8+T細(xì)胞攻擊肝細(xì)胞從而導(dǎo)致自身肝細(xì)胞的溶解。最近，研究［9］顯示HCV特異性CD8+T細(xì)胞上存在多種抑制性受體的表達(dá)。具有抗原特異性的CD4+T細(xì)胞在清除HCV及致病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。兩者比例發(fā)生變化后有可能導(dǎo)致兩種細(xì)胞不能很好地協(xié)調(diào)作用，從而影響了機(jī)體清除HCV的能力，導(dǎo)致感染的持續(xù)［10］。CD4+T細(xì)胞在激發(fā)抗原提呈細(xì)胞活性及誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞的免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。強(qiáng)而持久的CD4+T細(xì)胞免疫反應(yīng)能增強(qiáng)機(jī)體清除病毒的能力。在HCV感染黑猩猩的動(dòng)物試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，即使在CD8+T細(xì)胞免疫反應(yīng)正常的情況下，CD4+T細(xì)胞的消耗也將導(dǎo)致HCV感染慢性化［11－13］。有學(xué)者［14］認(rèn)為，CD4+、CD8+T 細(xì)胞的相互協(xié)調(diào)能有效控制病毒感染，有效控制HCV感染需要一個(gè)持久、廣泛的輔助和細(xì)胞毒細(xì)胞反應(yīng)，如果患者不能產(chǎn)生或不能維持持久的CD4+T細(xì)胞反應(yīng)，通常不能有效清除病毒，導(dǎo)致感染慢性化。

血清HCV RNA含量反映了病毒復(fù)制的活躍程度和病情變化，從基因診斷角度直接反映了血清HCV存在的情況，也是反映CHC傳染性的指標(biāo)。血清中的HCV RNA載量與肝組織HCV RNA呈正相關(guān)［15］。血清HCV RNA的檢測(cè)能直接反映CHC的病毒血癥水平。同時(shí)檢測(cè)了CHC患者血清中HCV RNA的載量，研究病毒復(fù)制程度與細(xì)胞免疫功能的關(guān)系。結(jié)果表明隨著病毒拷貝數(shù)的增加，CD4+T細(xì)胞百分率及CD4+/CD8+比值明顯減少;CD8+T細(xì)胞百分率則與HCV RNA拷貝數(shù)的增加成正比。說(shuō)明免疫功能紊亂，導(dǎo)致循環(huán)病毒量增加，免疫應(yīng)答低下使機(jī)體難以清除病毒。檢測(cè)顯示，HCV RNA陰性組CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞百分率與中載量組和高載量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與正常健康者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但其CD4+/CD8+比值卻明顯低于正常對(duì)照組。說(shuō)明HCV感染后，機(jī)體免疫功能的改變首先反映在CD4+/CD8+比值下降，推斷該值的持續(xù)下降與HCV持續(xù)存在和復(fù)制水平有關(guān)。

綜上所述，CHC患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群比例改變，可能是導(dǎo)致HCV感染慢性化的重要原因之一。HCV RNA復(fù)制增加進(jìn)一步加重CHC患者外周血T細(xì)胞亞群的紊亂，CD4+/CD8+比值的動(dòng)態(tài)變化可及時(shí)提示臨床HCV感染者細(xì)胞免疫功能的變化并加強(qiáng)臨床的預(yù)測(cè)。因此聯(lián)合檢測(cè)血清HCV RNA和外周血T淋巴細(xì)胞亞群對(duì)觀察CHC患者的病毒復(fù)制程度及判斷細(xì)胞免疫功能具有一定的臨床價(jià)值。

［1］Post J J，Ratnarajah S，Lioyd A R.Immunological determinants oftheoutcomes from primary hepatitis C infection［J］.Cell Mol Life Sci，2009，66(1):733 －56.

［2］陳淑蘭，邊 靜，張 鋒，等.慢性丙型肝炎患者的細(xì)胞免疫功能［J］.醫(yī)學(xué)研究與教育，2009，26(6):8 －10.

［3］European Association for the Study of the Liver.EASL Clinical Practice Guidelines:management of hepatitis C virus infection［J］.J Hepatol，2011，55(2):245 －64.

［4］Hiroishi K，Ito T，Imawari M.Immune responses in hepatitis C virus infection and mechanisms of hepatitis C virus persistence［J］.J Gastroenterol Hepatol，2008，23(1):473 －82.

［5］Satake S，Nagaki M，Kimura K.Significant effect of hepatitis C virus specific CTLs on viral clearance in patients with type C chronic hepatitis treated with antiviral agents［J］.Hepatol Res，2008，38(5):491－500.

［6］董西華，周 霞，周立平，等.丙肝患者血清HCV RNA與TNF-α之間的關(guān)系及其與肝損傷程度相關(guān)性的研究［J］.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，2011，26(6):21 －7.

［7］王九平，張 野，聶青和.PD-1分子對(duì)慢性丙型肝炎患者T細(xì)胞免疫功能的影響［J］.肝臟，2009，14(3):200 －3.

［8］梁 騎，焦艷梅，計(jì)云霞，等.慢性丙型肝炎患者DNT細(xì)胞及T細(xì)胞亞群的研究［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，33(2):214－7.

［9］劉毓剛，王天然，李國(guó)良.HCV感染者外周血T淋巴細(xì)胞亞群的變化［J］.四川醫(yī)學(xué)，2010，31(2):241 －2.

［10］Bengsch B，Seigel B，Ruhl M，et al.Coexpression of PD-1，2B4，CD160 and KLRG1 on exhausted HCV-specific CD8+T cell is linked to antigen recognitionand T cell differntiation［J］.Jplos Pathog，2010，6(6):e1000947.

［11］Mccaughan G W，Bowen D G.Pathogenesis of cholestatic hepatitis C ［J］.J Hepatol，2011，54(2):392 －4.

［12］Accapezzato D，F(xiàn)rancavilla，Paroli M，et al.Hepatic expansion of a virus-specific regulatory CD8(+)T cell population in chronic hepatitis C virusinfection［J］.J Clin Invest，2004，113(7):963 －72.

［13］Spangenberg H C，Viazov S，Kersting N，et al.Intrahepatic CD8+T cell failure during chronic hepatitis C virus infection［J］.Hepatology，2005，42(4):828 －37.

［14］Sugimoto K，Stadanlick J，Ikeda F，et al.Influence of ethnicity in the outcome of hepatitis C virus infection and cellular immune response［J］.Hepatology，2003，37(3):590 －9.

［15］Lemon S M，Mckeating J A，Pietschmann T，et al.Development of novel therapies for hepatitis C ［J］.Antiviral Res，2010，86(1):79－92.