基質金屬蛋白酶-8在急性Stanford A型主動脈夾層中的表達及臨床意義

王 巒，嚴中亞，章慶春，宋曉蓉

急性Stanford A型主動脈夾層是一種病情兇險、病死率極高的心血管疾病。隨著生活水平提升及檢測手段的增加，其發病率呈上升趨勢，但其發病機制目前仍不清楚［1］。基質金屬酶是一個Zn2+依賴性，參與細胞外基質降解代謝的酶家族。其在血管重塑過程中發揮重要作用［2］。研究［3］表明，在主動脈夾層中金屬蛋白酶家族許多成員表達升高，而關于基質金屬蛋白酶8(matrix metalloproteinase-8，MMP-8)在主動脈夾層中的相關表達報道較少。該研究分析MMP-8在實驗組和對照組血漿及主動脈壁中層的表達，初步探討其在急性Stanford A型主動脈夾層發生發展中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例資料 收集2011年8月～2013年6月安徽醫科大學附屬省立醫院心臟外科Stanford A型主動脈夾層患者30例為實驗組，其中男18例，女12例，年齡34～67(49.7±11.2)歲。選取同期住院單純主動脈瓣病變患者30例為對照組，男16例，女14例，年齡35～74(49±11.1)歲。患者經主動脈CTA、超聲心動、冠脈造影檢查確診。入選患者標準:排除胸部損傷感染、炎癥、主動脈瓣二葉畸形、馬凡綜合征、冠心病、升主動脈內徑＞40 mm。以上研究對象在年齡、性別方面等均匹配，具有可比性。術前所有患者均簽署知情同意書，并報我院倫理委員會批準。

1.1.2 主要試劑 ELISA試劑盒購自武漢優爾生科技股份有限公司;兔抗人MMP-8多克隆抗體購自武漢博士德生物有限公司;通用型二抗PV6000工作液購自北京中杉金橋生物技術有限公司;β-actin抗體和兔抗人MMP-8單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 ELISA法檢測血漿中MMP-8的含量 采集患者入院首次空腹靜脈血，所有血液樣本均4℃、4 000 r/min離心20 min分離血清，－80℃冰箱中保存備用。所有樣本按ELISA試劑盒說明書提供的方法檢測血清中MMP-8的含量。

1.2.2 HE染色 Stanford A型主動脈夾層手術標本取材方法:經右腋動脈聯合右心房上下腔靜脈建立體外循環。術中可見升主動脈內膜撕裂，升主動脈壁二層分離。根據主動脈瓣瓣葉受累及程度行單純升主動脈置換(或Bentall術或David術)聯合單分支覆膜支架置入術。取材位置距主動脈瓣瓣環約3 cm處，取材包括與主動脈壁撕裂部位相延續的2 cm正常血管壁組織。對照組取材相應部位的血管壁全層組織。手術標本取下后立即放入4%甲醛溶液中固定24 h后，沖洗、脫水、浸蠟、包埋，以4 μm厚度連續切片備用。HE染色:觀察對照組主動脈壁的組織學形態與實驗組主動脈壁的病理改變。

1.2.3 Western blot法檢測主動脈夾層主動脈及正

常主動脈血管組織中MMP-8表達水平 取約5 g凍存升主動脈組織冰上裂解后煮沸5 min，于4℃、10 000 r/min離心5 min，取上清液備用。上樣，聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，電轉至PVDF膜上，室溫下TBS洗膜5 min，膜置于含5%脫脂奶粉的TBS-T封閉1 h，TBS-T洗3次(5 min/次)。加入一抗(1∶500)4℃過夜，取出膜在TBS-T洗3次(5 min/次)，加入辣根過氧化物酶耦聯的二抗(1∶1 000)，室溫下振蕩孵育1 h，室溫下TBS-T洗3次(5 min/次)，TBS洗1次，增強的化學發光劑顯色曝光。

1.2.4 免疫組化法檢測MMP-8的表達 采用免疫組化SP法，嚴格按照試劑盒說明書操作。烘片后脫蠟，PBS洗滌，滅除內源性過氧化物酶，滴加正常山羊血清封閉液。滴加一抗4℃過夜，PBS洗滌后加入二抗，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素，DAB顯色。蘇木精復染，鹽酸酒精分化，脫水、透明、封片、烤片、顯微鏡拍照。使用Nikon80i熒光顯微鏡及圖像采集軟件進行圖像采集分析。400倍顯微視野下分別選取10個視野，計算陽性細胞占整個視野細胞百分比。評估標準［4］:0～5%為陰性(－)，6% ～25%為弱陽性(+)，26% ～50%為陽性()，＞50%為強陽性()。

1.3 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件包進行分析，數據以±s表示，定量變量組間差異采用t檢驗，定性變量組間差異采用秩和檢驗。

2 結果

2.1 血漿中MMP-8的含量 實驗組患者血漿中MMP-8的表達［(106.51±28.27)ng/ml］明顯高于對照組［(25.65±12.95)ng/ml］，差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.2 升主動脈組織HE染色 實驗組主動脈壁彈性纖維與膠原纖維層變性，排列雜亂無序，并伴有不同程度的炎性細胞浸潤。而對照組主動脈壁結構完整，彈性纖維與膠原纖維排列緊密有序。見圖1。

圖1 升主動脈壁HE染色 ×40

2.3 MMP-8的蛋白表達

2.3.1 Western blot法檢測 Western blot結果顯示，MMP-8在實驗組及對照組患者血管組織中均有表達，但實驗組患者升主動脈中MMP-8(灰度相對值1.04±0.11)水平明顯高于對照組(灰度相對值0.60±0.16)，差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖2。

圖2 MMP-8在升主動脈中的表達

2.3.2 免疫組織化學檢測 免疫組化陽性表達為細胞胞質棕黃色顆粒樣或片狀陰影。30例主動脈夾層中有24例MMP-8陽性表達，陽性率80%，其中強陽性表達4例。病變在彈力纖維與膠原纖維變性、排列紊亂的升主動脈壁中層，MMP-8高表達，可見大量棕黃色物質呈片狀分布，而在殘余的正常組織內MMP-8低表達。對照組30例中4例陽性表達，陽性率13.3%，且陽性表達為弱陽性。升主動脈壁中層彈力纖維與膠原纖維排列整齊有序，MMP-8低表達或不表達，僅散在染色點。見圖3。兩組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 MMP-8在實驗組與對照組主動脈壁中的表達(例，n=30)

3 討論

目前研究［5］顯示血流動力學因素與主動脈壁薄弱因素共同作用導致夾層的發生。升主動脈壁中層在維持主動脈力學結構中最重要，其完整性依賴于細胞外基質(extracellular matrix，ECM)合成與降解的動態平衡。升主動脈中層ECM主要由膠原纖維與彈性纖維組成，彈性纖維維持血管的擴張與收縮，膠原纖維韌性大，抗拉力強，起維持血管張力作用［6］。研究［7］顯示彈性蛋白酶的減少是引起主動脈瘤形成的重要原因，而膠原蛋白酶的減少引起主動脈的破裂。報道［8］表明主動脈壁病理改變與主動脈機械性能改變的主因是ECM的改變，而MMPs是降解ECM最主要的酶，MMP-8屬膠原酶，能裂解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型間質膠原蛋白的天然螺旋結構，參與并促進主動脈中層膠原蛋白與彈性蛋白的降解。本研究表明，主動脈夾層患者升主動脈壁中層彈性纖維與膠原纖維稀疏斷裂，雜亂無序，病變區MMP-8高表達。推測其可能在升主動脈夾層的發生發展中發揮作用。

本研究中急性Stanford A型主動脈夾層患者組織切片中，24例為陽性表達，陽性率80%，其中陽性15例，強陽性4例。而30例對照組組織切片中，4例為陽性表達，陽性率13.3%，且表達為弱陽性。實驗組免疫組化顯示，MMP-8的強陽性表達主要集中于主動脈壁中膜，夾層撕裂邊緣。主動脈壁中Ⅰ型膠原蛋白的含量遠高于其他型，且MMP-8降解Ⅰ型膠原蛋白的能力是最強的［9］。各種病理因素作用下MMP-8表達增加，活性增強，導致主動脈壁中層膠原纖維與彈性纖維降解增加，使主動脈壁纖維網絡受損，抗張力下降，主動脈發生中層退行性變或囊性壞死，升主動脈血管結構完整性受損，在高壓、高速的血流沖擊下，夾層發生易感性增加。根據本實驗結果，MMP-8在病變升主動脈中膜層表達明顯升高，且其高表達處膠原纖維與彈性纖維破壞嚴重，雜亂無序。由此推測MMP-8的含量升高與升主動脈結構的破壞存在相關性。Rahkonen et al［10］認為摘除小鼠調控Ⅰ型膠原纖維生長的Collal基因，小鼠主動脈夾層的發生率上升。也與本研究觀點一致。MMP-8不僅作用于ECM還可以通過活化MMP-2、MMP-3及MMP-9等其他蛋白，加速ECM的降解［11］。而對照組中MMP-8不表達或僅有少量表達，則反映生理狀態下，MMP/TIMPs(金屬蛋白酶組織抑制因子)存在平衡。本實驗顯示實驗組患者血清中MMP-8水平明顯高于對照組。MMP-8在主動脈患者血漿中表達增高，其也可以作為急性Stanford A型主動脈夾層診斷的一個指標因子。

綜上所述，主動脈夾層患者血清及主動脈壁中MMP-8的表達升高，此種改變直接影響ECM的結構改變。因此推測MMP-8可作為急性Stanford A型主動脈夾層診斷的一個指標，而MMP-8特異性抑制劑可能有助于修復或保持升主動脈中層結構完整性，對于升主動脈增寬的患者，可預防主動脈病或夾層的形成，具有一定的臨床意義。

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