ADAMTS-4與TAK1在骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中表達的相關(guān)性研究

張琪琪，胡 勇，周 定，丁 輝，闕玉康，魏 偉

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種進行性關(guān)節(jié)軟骨退變性疾病，其病理特征為關(guān)節(jié)軟骨破壞和關(guān)節(jié)周圍骨贅的形成。聚蛋白多糖的丟失引起軟骨細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)合成與分解代謝的失衡是OA軟骨破壞的重要機制之一［1］。近年來研究［2］顯示ADAMTS-4，即帶有血小板凝血酶敏感蛋白樣模體的解整鏈蛋白金屬蛋白酶-4，在人OA的聚蛋白多糖的降解中起著主要作用。許多信號通路參與OA的發(fā)病過程，這些信號通路通過級聯(lián)放大作用，導(dǎo)致ECM中相關(guān)蛋白酶及炎性成分變化引起軟骨破壞;其中絲裂原活性蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPKs)途徑和核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)途徑在 OA 發(fā)病中發(fā)揮重要作用［3］。轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶1(mitogen-activated protein kinase，TAK1)是 MAP3K 家族的成員之一，其處于這兩條信號通路的上游分支點上，可被多種促炎性細(xì)胞因子激活［4］。該研究旨在探討ADAMTS-4、TAK1在OA和正常軟骨中的表達情況，了解二者在OA軟骨中的發(fā)病作用及相互關(guān)系，探討OA發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2012年8月～2013年4月在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科二病區(qū)的住院患者。①OA組:因膝骨關(guān)節(jié)炎而行全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)中取材的關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本，共20例(男5例，女15例)，年齡49～82(65.9±9.22)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):OA患者診斷符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(ACR)2001年推薦的膝關(guān)節(jié)OA診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］。② 正常對照組:因股骨頸骨折而行全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)或者因急性外傷致下肢截肢術(shù)中取材的軟骨標(biāo)本，共10例(男3例，女7例)，年齡52～76(64.2±9.44)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):術(shù)前X線檢查關(guān)節(jié)軟骨面光滑，并術(shù)后病理學(xué)診斷關(guān)節(jié)無病變。所有新鮮標(biāo)本一部分以10%中性福爾馬林液固定，另外一部分標(biāo)本離體后置于生理鹽水的標(biāo)本盒中，迅速轉(zhuǎn)移到－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與儀器 兔抗ADAMTS-4多克隆抗體(英國Abcam公司);兔抗TAK1多克隆抗體(美國Santa Cruz公司);Elivision免疫組化兩步法檢測試劑盒(福建邁新公司);RIPA組織裂解液和SDSPAGE加樣緩沖液(中國碧云天生物技術(shù)研究所);山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);ECL顯影液(美國Thermo公司);Bioshine ChemiQ4600熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(中國Bioshine公司);Motic BA600 Mot-7.5型自動顯微鏡(中國Motic公司)。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測ADAMTS-4、TAK1表達及分布特點

1.3.1 免疫組化步驟 福爾馬林固定后的關(guān)節(jié)軟骨經(jīng)10%EDTA脫鈣后，常規(guī)脫水，石蠟包埋，以3～4 μm厚度連續(xù)切片，制備HE及免疫組化切片。其中免疫組化操作步驟如下:65℃烤箱烤24 h，二甲苯、梯度乙醇脫蠟水化;胰酶37℃下行抗原修復(fù)30 min，滴加內(nèi)源性過氧化物阻滯劑過氧化氫(H2O2)、分別滴加一抗(ADAMTS-4稀釋濃度為1∶200，TAK1稀釋濃度為1∶300)，4℃冰箱過夜;滴加生物素標(biāo)記的二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，封片，鏡下觀察。

1.3.2 免疫組化結(jié)果判斷 使用 Motic BA600 Mot-7.5型自動顯微鏡對各組免疫組化結(jié)果進行掃描拍照，再采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對各免疫組化結(jié)果圖片進行積分光密度(integral optical density，IOD)檢測和分析。每張切片隨機選取5個高倍鏡視野(×200)，選取細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色顆粒的軟骨細(xì)胞為陽性結(jié)果進行標(biāo)記，以此自動檢測所有視野的陽性結(jié)果。以參數(shù)平均積分光密度(integrated optical density average，IA)代表蛋白的顆粒密度。

1.4 Western blot法檢測軟骨中 ADAMTS-4、TAK1表達 在冰浴條件下，0.05 g軟骨組織在499 μl RIPA組織裂解液、1 μl苯甲磺酰氟中研磨、裂解30 min。將裂解液移至1.5 ml EP管中，14 000 r/min 離心15 min，取上清液 100 μl，加入 25 μl 5 ×SDS上樣緩沖液，煮沸10 min，用10%的SDS-PAGE凝膠電泳2 h，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶37℃封閉1.5 h，加入兔抗 ADAMTS-4一抗(1∶200)、兔抗TAK1一抗(1∶300)及鼠抗β-actin一抗(1∶500)孵育，4℃過夜，加入山羊抗兔標(biāo)記二抗(1∶40 000)、山羊抗鼠標(biāo)記二抗(1∶50 000)孵育2 h，TPBS清洗3次及PBS清洗1次后加ECL液顯影，掃描儀中成像。運用Image J軟件分析各組Western blot條帶計算灰度值。以β-actin蛋白的灰度值為內(nèi)參，計算二者比值即為灰度值比值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)分析結(jié)果以±s表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗，兩種指標(biāo)之間的關(guān)系采用Spearman秩相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1ADAMTS-4和TAK1在軟骨組織中的表達HE染色結(jié)果顯示:正常對照組軟骨表面光滑，軟骨細(xì)胞位于軟骨陷窩內(nèi)，逐層呈規(guī)則排列。而OA組軟骨表面不平整，有裂隙，軟骨細(xì)胞排列紊亂，外形不規(guī)則，可見簇集的軟骨細(xì)胞和退變肥大的軟骨細(xì)胞。免疫組化結(jié)果顯示:在OA軟骨組織中，ADAMTS-4主要表達于軟骨細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，可見大量棕黃色顆粒，細(xì)胞膜黃染，特別是固縮退變的軟骨細(xì)胞更明顯。而正常對照組陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，其表達量較低，二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.81，P＜0.01)。TAK1在OA軟骨細(xì)胞、一些炎性細(xì)胞內(nèi)均有表達，細(xì)胞內(nèi)可見棕黃色顆粒。在正常對照組軟骨的分布部位與OA組相似，但數(shù)量明顯減少，染色強度明顯降低，二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.58，P ＜0.01)。見圖1、2 和表1。

圖1 正常對照組和OA組軟骨HE染色結(jié)果 HE×200

圖2 正常對照組和OA組軟骨中ADAMTS-4和TAK1的表達 Elivision×200

表1 ADAMTS-4和TAK1在正常對照組及OA組軟骨中的表達(IA，±s)

表1 ADAMTS-4和TAK1在正常對照組及OA組軟骨中的表達(IA，±s)

與正常對照組比較:＊＊P＜0.01

?

Western blot法結(jié)果提示:OA患者軟骨組織中ADAMTS-4表達高于正常對照組，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，OA組與正常對照組灰度值比值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.27，P＜0.01);TAK1在OA軟骨組織中表達也高于正常對照組，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，兩組灰度值比值比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.25，P＜0.01)。部分OA組和正常對照組電泳結(jié)果見圖3。

圖3 Western blot法檢測ADAMTS-4和TAK1在正常對照組及OA組軟骨中的表達

2.2ADAMTS-4和TAK1在OA軟骨組織中表達的相關(guān)性分析 OA軟骨中ADAMTS-4及TAK1的IA值明顯高于正常對照組(P＜0.01)。20例OA患者軟骨組織中，TAK1陽性表達的IA值為0.30±0.11，ADAMTS-4陽性表達的IA值為0.42±0.12，經(jīng)相關(guān)分析結(jié)果表明，在OA軟骨組織中TAK1和ADAMTS-4的表達呈正相關(guān)(r=0.469，P＜0.05)。見表1。

3 討論

多因素造成ECM構(gòu)成成分的改變引起關(guān)節(jié)軟骨的退變及破壞是OA發(fā)病機制之一。而ECM主要由膠原纖維和聚蛋白多糖構(gòu)成。有文獻［1］報道，聚蛋白多糖使關(guān)節(jié)軟骨具有很好的彈性和抗壓性，聚蛋白多糖的丟失被認(rèn)為在OA的發(fā)病中起著重要的啟動作用。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)能夠特異性的降解關(guān)節(jié)軟骨ECM中的Ⅱ型膠原、彈力纖維等，長期以來被認(rèn)為在OA進展中起著重要作用［6］;隨著對OA發(fā)病機制的深入研究，發(fā)現(xiàn)早期引起軟骨降解的酶是聚蛋白多糖酶，而MMPs在晚期才起作用。其中ADAMTS-4是被廣泛認(rèn)可，具有強大的聚蛋白多糖降解能力［7］。ADAMTS-4主要通過作用于軟骨蛋白聚糖核心蛋白球間區(qū)(IGD)的蛋白水解分裂位點Glu373-Ala374發(fā)揮作用。有研究［8］顯示，正常者和OA患者的軟骨組織中均有ADAMTS-4表達，且在OA軟骨組織中表達明顯增多，此外ADAMTS-4與關(guān)節(jié)軟骨破壞的程度有直接的關(guān)系，因此認(rèn)為ADAMTS-4是引起人OA軟骨降解的主要聚蛋白多糖酶。本研究結(jié)果表明ADAMTS-4在OA組較正常對照組高表達，陽性細(xì)胞主要分布于關(guān)節(jié)軟骨淺層及中層退變軟骨細(xì)胞中;提示ADAMTS-4在OA的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。通過特異性抑制ADAMTS-4能夠有效控制OA的病情進展。

在OA病程中，白細(xì)胞介素1(interleukin-1，IL-1)、IL-6、IL-17、IL-18、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等是參與關(guān)節(jié)病變的主要促炎性細(xì)胞因子［9］。這些促炎性細(xì)胞因子主要是通過多條細(xì)胞內(nèi)信號通路的級聯(lián)放大作用導(dǎo)致蛋白酶、前炎癥因子變化，使軟骨ECM分解代謝超過合成代謝，引起關(guān)節(jié)軟骨破壞。而在眾多的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，MAPKs信號通路和NF-κB信號通路在OA發(fā)生發(fā)展中起了很重要的作用。Lea et al［10］研究發(fā)現(xiàn) TAK1 是 MAPKs信號通路和骨形態(tài)蛋白(BMP)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子并且在骨和關(guān)節(jié)發(fā)育中起著一定作用。TAK1可被上述多種促炎性細(xì)胞因子應(yīng)激信號刺激所激活。在MAPKs信號通路中，激活的TAK1通過MEKK3/6、MEKK4/7調(diào)節(jié)JNK和p38蛋白激酶的活性，最終活化核轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1(AP-1)，從而引起靶基因的表達;而在NF-κB信號通路中，活化的TAK1激活NF-κB誘導(dǎo)激酶(NIK)和 IKB激酶(IKK)，進而磷酸化IκB介導(dǎo)NF-κB進入細(xì)胞核內(nèi)，影響目的基因的表達。

研究［11－14］顯示在人軟骨細(xì)胞內(nèi)，NF-κB 和MAPKs可以上調(diào)由TNF-α或IL-1β介導(dǎo)的MMP-1、MMP-13、ADAMTS-4基因和蛋白的表達，抑制MAPK-ERK1/2活性可以降低ADAMTs和MMPs的高表達。Klatt et al［15］研究發(fā)現(xiàn)在OA軟骨細(xì)胞中TAK1有一定的表達，抑制TAK1基因可以減少下游炎性細(xì)胞因子及相關(guān)蛋白酶的表達，TAK1對AP-1及NF-κB的活性起著更關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果顯示，20例OA患者TAK1表達明顯高于正常對照組，且發(fā)現(xiàn)淺層軟骨細(xì)胞呈陽性反應(yīng)較多，而深層軟骨細(xì)胞只有少數(shù)呈陽性反應(yīng)或者未見陽性細(xì)胞。由此可以推斷，TAK1作為炎癥反應(yīng)中MAPKs細(xì)胞信號通路和NF-κB信號通路上游重要的激酶，在OA發(fā)病中可能起著重要作用。

本研究對OA軟骨組織中的ADAMTS-4和TAK1的表達進行了相關(guān)性分析，初步證實兩者呈正相關(guān)，提示ADAMTS-4與TAK1在OA軟骨病變的發(fā)生發(fā)展中具有協(xié)同作用，這可能與活化的TAK1具有調(diào)節(jié)ADAMTS-4表達作用有關(guān)。通過干預(yù)上游信號分子TAK1的活性，將有助于減少相關(guān)炎性細(xì)胞因子和蛋白酶類等對OA病理生理的影響，因此TAK1可以作為OA治療的新靶點，為OA的治療提供新的思路。

綜上所述，軟骨組織中ADAMTS-4和TAK1的高表達與OA的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，活化的TAK1可能致OA軟骨中ADAMTS-4的高表達。但ADAMTS-4和TAK1之間具體的相互作用機制尚不清楚，且OA是多因素作用的結(jié)果，有待進一步研究。

［1］Martel-Pelletier J，Boileau C，Pelletier J P，et al.Cartilage in normal and osteoarthritis conditions［J］.Best Pract Res Clin Rheumatol，2008，22(2):351 －84.

［2］Naito S，Shiomi T，Okada A，et al.Expression of ADAMTS4(aggrecanas-1)in human osteoarthritic cartilage［J］.Pathol Int，2007，57(11):703－11.

［3］Berenbaum F.Signaling transduction:target in osteoarthritis［J］.Curr OpinRheum，2004，16(5):616－22.

［4］Johnson G L，Lapadat R.Mitogen-activated protein kinase pathways mediaed by ERK，JNK，and p38 protein kinases［J］.Science，2002，298(5600):1911－2.

［5］陳百成，張 靜.骨關(guān)節(jié)炎［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2004:18.

［6］Takaishi H，Kimura T，Dalal S，et al.Joint diseases and matrix metallopro teinases:a role for MMP-13［J］.Curr Pharm Biotech，2008，9(1):47－54.

［7］Verma P，Dalal K.ADAMTS-4 and ADAMTS-5:key enzymes in osteoarthritis［J］.Cell Biochem，2011，112(12):3507－14.

［8］Yatabe T，Mochizuki S，Takizawa M，et al.Hyaluronan inhibits expression of ADAMTS4(aggrecanase-1)in human osteoarthritic chondrocytes［J］.Ann Rheum Dis，2009，68(6):1051 － 8.

［9］Charles J M.Anticytokine therapy for osteoarthritis［J］.Drug Aging，2010，27(2):95 －115.

［10］Lea M G，Jennifer H J，Loiselle A E，et al.TAK1 regulate’s cartilage and joint development via the MAPK and BMP signaling pathways［J］.J Bone Miner Res，2010，25(8):1784 －97.

［11］Sondergaard B C，Schultz N，Madsen S H，et al.MAPKs are essential upstream signaling pathways in proteolytic cartilage degradation-divergence in pathways leading to aggrecanase and MMP-mediated articular cartilage degradation［J］.Osteoarthritis Cartilage，2010，18(3):279－88.

［12］Da Silva M A，Yamada N，Clarke N M，et al.Cellular and epigenetic features of a young healthy and a young osteoarthritic cartilage compared with aged control and OA cartilage［J］.J Orthop Res，2009，27(5):593 －601.

［13］Rasheed A，Judith A，Sylvester J，et al.Adaptor Proteins and Ras synergistically regulate IL-1-induced ADAMTS-4 expression in Human chondrocytes［J］.J Immunol，2009，182(8):5081 －7.

［14］Prasadam I，Crawford R，Xiao Y.Aggravation of ADAMTS and matrix metalloproteinas production and role of ERK1/2 pathway in the interaction of osteoarthritic subchondral bone osteoblasts and articular cartilage chondrocytes-possible pathogenic role in osteoarthritis［J］.J Rheumatol，2012，39(3):621 －34.

［15］Klatt A R，Klinger G，Neumüller O，et al.TAK1 downregulation reduces IL-1β induced expression of MMP13，MMP1 and TNF-alpha［J］.Biomed Pharmacother，2006，60(2):55 －61.