大豆粕堿性蛋白酶水解肽及A C E抑制活性的研究

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（1.天津市動植物抗性重點實驗室，天津師范大學生命科學學院，天津 300387；2.天津科技大學，天津 300222）

豆粕是大豆榨油的副產物，一般用做飼料。豆粕蛋白含量很高，以其為底物，用酶解法可以制備具有降血壓作用的ACE（血管緊張素轉換酶angiotensinconverting enzyme，ACE）抑制肽[1]。ACE 對血壓起著重要的調節作用，它可以水解血管緊張素I（Angiotensin I，Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-Pro-His-Leu），生成的血管緊張素II具有升高血壓作用，同時還可以水解舒緩激肽（Bradykinin，Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Arg），使其失去降壓作用[2]。中國高血壓防病指南將血管緊張素轉換酶抑制劑（ACEI）明確列為五種最常用的降壓藥物之一[3]，自1977年ACEI問世以來已成為防治心血管疾病的“基石”藥物[4]。有關試驗表明，人工合成的ACE抑制劑會產生一些副作用，而食品級蛋白源降壓肽由于其安全性很高，只對高血壓患者起到降壓效果，對血壓正常者無降壓作用，且降壓作用平穩而溫和。因此，具有降壓作用的大豆ACE抑制肽備受關注[5-6]，但以食品級豆粕為原料制備ACE抑制肽的研究相對較少。開發大豆降壓食品不僅可以為心腦血管病患者提供一種物美價廉，安全可靠的保健食品還可以大幅度提高大豆產品的附加值，拓寬大豆的用途。同時，伴隨生物技術的不斷進步與生命科學的巨大發展，人們發掘出越來越多有關大豆多肽的功能，而某些抑制肽的結構與生理功能也逐漸被人們所認識和了解，推動了人類對大豆抑制肽進行研究與開發[7]。據此，實驗以食品級大豆粕為原料制備具有降血壓作用的大豆多肽并對其性質和ACE抑制活性進行研究，為大豆降壓肽的開發應用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食用級豆粕：市購；堿性蛋白酶：天津市諾奧科技發展有限公司；硼酸（分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司；硼砂（分析純）：天津市元立化工有限公司；三氟乙酸（分析純）：上海市科豐試劑廠；甲醇（色譜純）：美國迪馬科技公司；馬尿酰組氨酰亮氨酸（Hippury-L-histidyl-L-leucine，Hip-His-Leu）：美國sigma公司；ACE（來自兔肺）：美國sigma公司。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀1200、超高壓液相色譜/四極桿-飛行時間串聯質譜聯用儀配有電噴霧離子源（ESI）：美國安捷倫。

1.3 方法

1.3.1 酶解抑制肽樣品的制備

稱取豆粕，分別配制成20、40和60 g/L水溶液，50℃恒溫攪拌20 min。1 mol/L NaOH調pH8.0，同時加入3%（E/S）的堿性蛋白酶。為保證溶液pH穩定，需不斷向體系加入NaOH，同時記錄加入量，用于計算水解度。分別于 1、2、3、4、5、6、9、12 h 取樣，立即于 90 ℃水浴15 min，鈍化蛋白酶。流水冷卻后4℃12 500 r/min離心15 min，取上清液凍干得到抑制肽樣品。

水解度的測定采用pH-STAT法[8]。

1.3.2 色譜及質譜儀器條件、

1.3.2.1 色譜條件

色譜柱：Zorbax300SB-C18，5 μm，4.6×150 mm；檢測波長：228 nm，流動相：50%甲醇-超純水，各含0.1%的三氟乙酸；流速：0.7 mL/min；柱溫：26℃；進樣量：10 μL。

1.3.2.1 色譜條件

離子源：ESI；掃描模式：正離子掃描；檢測方式：多反應監測（MRM）；電噴霧電壓：5 500 V；離子源溫度：500℃；正離子模式下噴霧毛細管電壓為4.0 KV，霧化氣為N2氣流量為11 L/min，干燥氣壓力為45 Pa，IT 真空為 2.8×10-5Tor；TOF 真空為 2.56×10-7，干燥氣溫度為200℃，質譜采集范圍m/z 50-3000。

1.3.3 ACE抑制肽活性檢測方法

1.3.3.1 試劑的配制

1）馬尿酸標準液：取一定量的馬尿酸標準品，加去離子水溶解配成濃度為25 μg/mL的馬尿酸標準液，并逐級稀釋成一系列濃度 20、15、10、5、2、1、0.5、0.1 μg/mL。

2）硼酸緩沖液（pH8.3，含 0.3 mol/L NaCl）：溶液A：稱取硼酸3.092 5 g，用去離子水溶解定容至500 mL；溶液B：稱取硼砂4.767 5 g，用去離子水溶解定容至500 mL；取 A 液 120 mL，B 液 80 mL，NaCl 3.51 g，混合至完全溶解，即為0.1 mmol/L的硼酸緩沖溶液。

3）ACE溶液：將0.25 U ACE溶于2.5 mL 0.1 mol/L硼酸緩沖液（pH8.3，含 0.3 mol/L NaCl）即得。

4）HHL溶液（5 mmol/L）：取適量 HHL 溶解于0.1 mol/L硼酸鈉緩沖液（pH8.3含0.3 mol/L NaCl）中，配置成5 mmol/L HHL溶液。

5）稱取適量冷凍干燥后的抑制肽粉末，將其溶于一定量的0.1 mol/L硼酸緩沖溶液（pH8.3，含0.3 mol/L NaCl）中，制成0.5 mg/mL抑制肽溶液。

1.3.3.2 ACE抑制肽活性測定

反應體系總體積為120 μL。

測定管：取抑制肽樣品60 μL與ACE溶液10 μL混合，37℃水浴10 min后加入HHL溶液50 μL；整個反應體系37℃水浴60 min后加入1 mol/L HCL 100 μL終止反應；過0.45 μm濾膜，進行液相色譜分析。

對照管：用60μL硼酸緩沖液（pH8.30.3mol/LNaCl）替代測定組抑制肽溶液，用同樣方法制備反應液。

空白對照管：用10 μL硼酸緩沖液（pH8.3 0.3 mol/L NaCl）替代對照組ACE溶液，同樣方法制備反應液（平行3次）。

計算公式為 ACE 抑制率（%）=（[HA] c–[HA] s）/（[HA] c–[HA] H）×100%

式中：[HA] c：對照樣品馬尿酸濃度；[HA] s：測定樣品馬尿酸濃度；[HA] H：空白對照中馬尿酸濃度。

2 結果與分析

2.1 檢測波長的測定

分別以0.1mol/L的硼酸緩沖液（pH8.3，含0.3mol/L NaCl）和去離子水為參比，在190 nm～300 nm波長處掃描馬尿酸溶液和HHL溶液的紫外吸收光譜，如圖1所示。

圖1 馬尿酸與HHL紫外吸收光譜Fig.1 UV scanning spectrum of hippuric acid and HHL

從圖可以看出三肽HHL在210 nm～250 nm波長范圍內有一定的吸收，而馬尿酸在228 nm波長處有一特征吸收峰。因此可以用228 nm作為HPLC的檢測波長。

2.2 流動相的選擇及保留時間的確定

在1.3.2.1節選定的條件下馬尿酸及HHL的液相色譜圖如圖2和圖3所示。

圖2 HHL液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of HHL

圖3 馬尿酸液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of hippuric acid

此色譜條件下，樣品、馬尿酸、HHL能夠實現很好的區分，各峰區分度較好，馬尿酸峰能和其它峰獨立區分不受干擾。對加樣品后的多組反應液檢測后，馬尿酸的峰面積減小，且出峰時間也很穩定。HHL的保留時間為Rt=6.168 min，馬尿酸的保留時間為Rt=3.023 min。

2.3 抑制肽活性測定結果

2.3.1 馬尿酸標準曲線及回歸方程

將配置好的不同濃度的馬尿酸溶液過0.45 μm濾膜后進行液相分析，結果表明馬尿酸的峰面積（mAU·S）及其濃度C（μg/mL）呈現良好的線性關系，線性回歸方程是：y=92.695 8x-13.91，如圖4所示。

圖4 馬尿酸峰面積標準曲線Fig.4 The standard curve of hippuric acid

因此，馬尿酸的峰面積可以很好的反映體系中馬尿酸的濃度，進一步體現出ACEI的抑制活性。試驗中所有樣品反應體系中馬尿酸的濃度全部在標準曲線范圍內。

2.3.2 不同底物濃度的酶解產物ACE抑制效果

隨著底物濃度的增加，酶解大豆肽的活性略有升高，并且同時在3 h時獲得最高活性產物。但是考慮到生產成本以及前期處理和后期分離濃縮的困難，應盡量提高底物濃度。綜合考慮下，確定40 g/L底物濃度下進行水解較適宜。（見圖5）

圖5 堿性蛋白酶制備的ACE抑制肽活性Fig.5 Inhibition of ACE peptide made by alcalase

2.3.3 水解度與ACE抑制活性關系

圖6 水解度與抑制率的關系Fig.6 The diversification for DH and ACE inhibitory ratio

從圖6可以看出，在水解反應的0 h～9 h內，水解度一直呈上升的趨勢。在水解的初始階段0 h～3 h，ACE抑制肽活性隨著水解度的增加而增強[9]，隨后便逐漸下降。這是因為在水解反應的后期，ACE抑制肽被水解成小分子的氨基酸，使得其活性被破壞。因此酶解3 h的產物活性最高，為64.21%，對應水解度14.86%。這與Mullally[10-11]等的研究結果是一致的，他認為在酶解反應初始階段，ACE抑制肽被大量生成，但之后被逐步降解，從而導致ACE抑制活性下降。

2.4 高活性肽性質初步分析及測定

很多具有生理活性的生物活性肽都與其分子量有一定的關系[12]。為了明確酶解產物所含物質的分子量，對ACE抑制活性最高的3 h酶解產物進行液質分析，結果如圖7。

圖7 堿性蛋白酶3 h酶解產物LC-MS離子峰Fig.7 LC-MS ion peak of the alcalase hydrolysates（3 h）

結果顯示樣品中主要含有兩種主要物質，分子量分別為 359和 441，對應分子式為 C15H30N6O4和C24H36N6O2。經SciFinder檢測顯示C15H30N6O4是三肽物質，由異亮氨酸、精氨酸和丙氨酸構成[13-14]。

3 結論

在pH8.0，溫度50℃，底物濃度40 g/L的條件下，食品級豆粕經堿性蛋白酶水解3 h產生的ACE抑制肽活性最高為64.21%，對應水解度14.86%。Lin等從魷魚皮膚胃蛋白酶水解肽中獲得的分子量小于2 KDa的物質，其ACE抑制IC50值為0.33mg/mL[15]。小麥胚芽蛋白脫脂后的酶解物ACE抑制IC50值0.452 mg/mL[16]。與已有文獻報道相比，本實驗條件下所制備的0.5mg/mL ACE抑制肽表現出了相當ACE抑制活性，經液質檢測其中含有的三肽物質為C15H30N6O4。因此，本研究為開發食品級豆粕作為具有抗高血壓作用的保健食品提供了理論依據，具有很大的發展前景。

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