Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化微波提取猴頭菇多糖工藝

（麗水學(xué)院成教學(xué)院，浙江麗水 323000）

多糖廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物組織中，它具有合成高分子所沒(méi)有的特殊生物活性，是生命有機(jī)體的重要組成部分，并且具有多種多樣的生物學(xué)功能[1]。猴頭菇是一種珍貴的食用兼藥用菌，富含多種營(yíng)養(yǎng)成分[2]。醫(yī)學(xué)研究表明：猴頭菇性平，味甘，有利五臟，助消化，滋補(bǔ)身體等功效，特別是對(duì)胃潰瘍，十二指腸潰瘍和神經(jīng)衰弱等患者有很好的保健效果[3]。

鑒于上述猴頭菇多糖的諸多優(yōu)點(diǎn)，其廣闊的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值不言而喻。關(guān)于猴頭菇多糖的提取方法的報(bào)道不斷出現(xiàn)。常用的有熱水浸提法、稀堿液浸提法、稀酸液浸提法等[4-6]。水提取法溶劑用量大、耗時(shí)且效率低，酸堿提取法又易導(dǎo)致多糖立體結(jié)構(gòu)的破壞及生物活性的改變。近年研究較多的新型提取法有超聲波輔助法[7]和酶輔助法[8]，這兩種方法比傳統(tǒng)的提取方法省時(shí)、節(jié)約溶劑、提取效率高。但由于超聲波法對(duì)儀器的要求較高較難推廣應(yīng)用，而生物酶價(jià)格昂貴阻礙了酶法提取的廣泛應(yīng)用。微波輔助熱水浸提是一種頗具發(fā)展前景的新型提取技術(shù)，微波作為一種電磁能可以大大節(jié)約提取時(shí)間，提高提取速度[9]。本文研究采用微波輔助法提取猴頭菇多糖。

在優(yōu)化提取工藝過(guò)程中，常需同時(shí)考察多個(gè)因素對(duì)結(jié)果的影響，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化。采用固定其他因素而改變某一因素（One Factor at A Time，OFAT）的單因素考察法能收到一定效果，但條件優(yōu)選憑經(jīng)驗(yàn)，且無(wú)法考察各因素間的相互作用。當(dāng)因素水平數(shù)較少時(shí)可采用析因設(shè)計(jì)（Factorial Design）；較多時(shí)，需采用實(shí)驗(yàn)次數(shù)較少的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化法。國(guó)內(nèi)常用均勻設(shè)計(jì)和正交設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化，但這兩種方法實(shí)驗(yàn)精度不夠，建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)性較差。而近年來(lái)國(guó)內(nèi)外許多藥學(xué)工作者采用Box-Behnken效應(yīng)面法（Response Surface Methodology，RSM）對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化[10-12]，它適用于多因素多水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，使用方便，優(yōu)選條件預(yù)測(cè)性好。因此，本文利用Box-Behnken效應(yīng)面法對(duì)微波提取猴頭菇多糖工藝進(jìn)行優(yōu)化，并得到最佳工藝條件，為工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

MM721AAU-PW：佛山寺順德區(qū)美的微波電器制造公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋：國(guó)華電器有限公司；DL-6000B離心機(jī)：湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司；FD-8冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；UV-3紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海精密儀器儀表有限公司。

1.2 材料與試劑

猴頭菇細(xì)粉100目：購(gòu)自浙江省方格藥業(yè)有限公司；無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)藥品生物制品檢定所；苯酚、硫酸、乙醇、乙酸鉛（均為分析純）。

1.3 方法

1.3.1 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

參照文獻(xiàn)[13] 采用苯酚-硫酸法測(cè)定猴頭菇中多糖含量。精確稱取無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品50.0mg至250mL容量瓶中，加適量水溶解，加水至刻度，搖勻，配成質(zhì)量濃度為0.2mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL 至 9 支試管中，依次加水，使最終體積均為2 mL，另取2 mL蒸餾水作空白試驗(yàn)。用移液管向每支試管各加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻。再向每支試管中緩慢加入濃硫酸5 mL，充分渦旋，冷卻至室溫。在490nm下測(cè)定吸光度，以葡萄糖的濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：C=6.317 4A-0.003 1，R=0.999 6，表明葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品在0.005 mg/mL～0.045 mg/mL內(nèi)濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

1.3.2 猴頭菇多糖提取工藝

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard curve

取2.0 g猴頭菇細(xì)粉，按一定的料液比加入蒸餾水，于微波爐中提取一定時(shí)間，取出置于100℃水浴中加熱30 min，離心取上清液，真空濃縮后按1∶4的比例加入95%乙醇，醇沉過(guò)夜，離心收集沉淀，加蒸餾水復(fù)溶，采用Sevag法與乙酸鉛相結(jié)合去除蛋白質(zhì)，用無(wú)水乙醇反復(fù)沖洗多次后，冷凍干燥，既得猴頭菇多糖。

將制備的猴頭菇多糖用蒸餾水溶解，定容于500mL容量瓶中，按照“1.3.1”項(xiàng)下處理，并在490 nm處測(cè)定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算猴頭菇多糖提取率。

多糖提取率（%）=[多糖含量（g）/原料重量（g）] ×100

1.3.3 單因素試驗(yàn)

影響微波提取多糖得率的主要因素為料液比、微波功率、微波處理時(shí)間。本文對(duì)料液比選取1∶20，1∶30，1 ∶40，1 ∶50，1 ∶60，1 ∶70（g/mL）6 個(gè)水平；微波功率選取 119、231、385、539、700 W 5 個(gè)水平；微波處理時(shí)間選取 2、4、6、8、10、12、14 min 7 個(gè)水平，分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.3.4 Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化猴頭菇多糖的提取工藝

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對(duì)猴頭菇多糖的提取工藝影響較顯著的3個(gè)因素：料液比（X1，g/mL）、微波功率（X2，W）和微波處理時(shí)間（X3，min）為考察對(duì)象，以提取率（Y，%）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，利用3因素3水平的Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化猴頭菇多糖的提取工藝，并且按最佳提取條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。因素水平見(jiàn)表1，制備工藝優(yōu)化試驗(yàn)安排及結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)水平表Table 1 Variables in the Box-Behnken design

2 結(jié)果與討論

2.1 微波提取猴頭菇多糖的單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)猴頭菇多糖提取率的影響

在微波功率為385 W、提取時(shí)間為10 min的條件下，分別按料液比為 1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60，1 ∶70（g/mL）的比例提取猴頭菇多糖，計(jì)算猴頭菇多糖提取率，結(jié)果如圖2所示。

圖2 料液比對(duì)猴頭菇多糖提取率的影響Fig.2 Effects of solid-liquid ratio on extraction rate of Hericium Erinaceus Polysaccharide

由圖2可知，猴頭菇多糖提取率隨著溶劑量增大而增大，料液比在 1 ∶40～1 ∶50（g/mL）之間提取率顯著提高，繼續(xù)提高料液比提取率略有下降，因此選擇料液比為 1 ∶50（g/mL）。

2.1.2 微波功率對(duì)多糖提取率的影響

在料液比 1∶50（g/mL）、提取時(shí)間 10 min的條件下，分別用 119、231、385、539、700 W 的微波功率進(jìn)行微波提取，計(jì)算猴頭菇多糖提取率，結(jié)果如圖3所示。

圖3 微波功率對(duì)猴頭菇多糖提取率的影響Fig.3 Effects of microwave power on extraction rate of Hericium Erinaceus Polysaccharide

由圖3可知，隨著微波功率的增大提取率增大，當(dāng)微波功率到385 W時(shí)提取率到最高值，微波功率繼續(xù)增大提取率降低。研究[14-15]表明，微波功率越大，單位時(shí)間內(nèi)微波輻射能量越高，體系溫度升高越快，從而使固定物料在單位時(shí)間內(nèi)獲得的生物能量逐步增加，加劇物料細(xì)胞的破裂和組織中多糖類物質(zhì)分子及溶劑分子的熱運(yùn)動(dòng)，因而使多糖提取率增加。而功率過(guò)大易使多糖降解，使提取率降低。而且微波功率過(guò)大會(huì)發(fā)生爆沸也影響提取率，因此最后確定微波功率為385 W。

2.1.3 微波提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

在料液比1∶50（g/mL）、提取功率385 W的條件下，分別將物料用 2、4、6、8、10、12、14 min 進(jìn)行微波提取，計(jì)算猴頭菇多糖提取率，結(jié)果如圖4所示。

圖4 微波處理提取時(shí)間對(duì)猴頭菇多糖提取率的影響Fig.4 Effects of microwave time on extraction rate of Hericium Erinaceus Polysaccharide

由圖4可知，微波處理時(shí)間加長(zhǎng)提取率升高，在10 min時(shí)提取率明顯提高，而10 min后提取率又明顯下降，可能是因?yàn)槲⒉ㄌ幚頃r(shí)間過(guò)長(zhǎng)易使多糖水解，致使提取率下降，因此微波輔助最適時(shí)間為10 min。

2.1.4 數(shù)據(jù)處理及模型擬合

采用“Design Expert 7.0”實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件，對(duì)猴頭菇多糖微波提取工藝所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以評(píng)價(jià)指標(biāo)（因變量）分別對(duì)各因素（自變量）進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式方程擬合。對(duì)二項(xiàng)式方程中的各項(xiàng)系數(shù)進(jìn)行F檢驗(yàn)，所得結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表與效應(yīng)值Table2 Box-Behnken experiment design independent（X）and dependent variables（Y）

表3 回歸方程中系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)Table 3 Significance test of coefficient in regression equation

獲得猴頭菇多糖提取率對(duì)編碼自變量的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=14.03+0.49X1+0.50X2+0.067X3-0.86X1X2-0.19X1X3-0.59X2X3-1.01X12-0.68X22-1.13X32（Pr=0.0420）

由擬合方程的相關(guān)系數(shù)（Pr=0.042 0）可知模型擬合程度良好，可以用此模型對(duì)猴頭菇多糖微波提取工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。從表3回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)可知，方程模型中X1（Pr=0.071 5）、X2（Pr=0.067 5）、X1X2（Pr=0.037 0）、X12（Pr=0.024 1）、X22（Pr=0.085 4）、X22（Pr=0.016 4）項(xiàng)極顯著，說(shuō)明料液比、微波功率及其這兩個(gè)因素之間的交互作用對(duì)多糖提取率影響較為顯著。

由圖5（A）可知，猴頭菇多糖提取率隨著料液比（X1）的增加而增大，隨著微波功率（X2）的增加先增加后降低；由圖5（B）可知，猴頭菇多糖提取率隨著料液比（X1）的增加出現(xiàn)先增加后降低趨勢(shì)，隨著微波處理時(shí)間（X3）的增加也出現(xiàn)先增加后降低趨勢(shì)；由圖5（C）可知，猴頭菇多糖提取率隨著微波功率（X2）的增加呈增加趨勢(shì)，隨著微波處理時(shí)間（X3）的增加也出現(xiàn)先增加后降低趨勢(shì)。

圖5 效應(yīng)面曲面圖Fig.5 Response surface plot

2.1.5 優(yōu)化工藝參數(shù)驗(yàn)證

以猴頭菇多糖提取率為指標(biāo)，根據(jù)“Design Expert 7.0”實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件得最佳猴頭菇多糖微波提取工藝參數(shù)為：料液比 1 ∶50.5（g/mL），微波功率 405 W，微波處理時(shí)間9.5 min。按照“2.1”項(xiàng)下以優(yōu)化后的工藝參數(shù)提取3批猴頭菇多糖，并按照“1.3.1”項(xiàng)下測(cè)定猴頭菇多糖含量，平均提取率為（13.92±0.13）%（n=3），實(shí)驗(yàn)觀測(cè)值與模型預(yù)測(cè)值偏差為3.75%，可知，實(shí)驗(yàn)觀察值和模型預(yù)測(cè)值比較接近，說(shuō)明模型預(yù)測(cè)性良好。

3 結(jié)論

Box-Behnken效應(yīng)面法是多因素3水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，是在2水平析因設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上加上極值點(diǎn)和中心點(diǎn)構(gòu)成的，可在試驗(yàn)中進(jìn)行非線性擬合，具有操作簡(jiǎn)單、試驗(yàn)次數(shù)少、精度高、預(yù)測(cè)性好等優(yōu)點(diǎn)。因此，Box-Behnken效應(yīng)面法在提取工藝領(lǐng)域具有較好的推廣應(yīng)用價(jià)值。需要注意的是Box-Behnken效應(yīng)面法因素一般為2～5個(gè)，因素不能太多，否則試驗(yàn)次數(shù)無(wú)法接受，一般不宜采用。

本實(shí)驗(yàn)利用微波提取法對(duì)猴頭菇多糖提取工藝進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)Box-Behnken效應(yīng)面法分析與優(yōu)化，模型擬合程度良好，確定的最佳提取工藝條件分別為：料液比 1 ∶50.5（g/mL），微波功率 405 W，微波處理時(shí)間 9.5 min，平均提取率為（13.92±0.13）%（n=3），實(shí)驗(yàn)觀測(cè)值與模型預(yù)測(cè)值偏差為3.75%，由此可知，Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化猴頭菇多糖提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確，具有實(shí)際可操作性。

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