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Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化微波提取猴頭菇多糖工藝

2014-07-27 01:13:50
食品研究與開(kāi)發(fā) 2014年9期
關(guān)鍵詞:工藝優(yōu)化

(麗水學(xué)院成教學(xué)院,浙江麗水 323000)

多糖廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物組織中,它具有合成高分子所沒(méi)有的特殊生物活性,是生命有機(jī)體的重要組成部分,并且具有多種多樣的生物學(xué)功能[1]。猴頭菇是一種珍貴的食用兼藥用菌,富含多種營(yíng)養(yǎng)成分[2]。醫(yī)學(xué)研究表明:猴頭菇性平,味甘,有利五臟,助消化,滋補(bǔ)身體等功效,特別是對(duì)胃潰瘍,十二指腸潰瘍和神經(jīng)衰弱等患者有很好的保健效果[3]。

鑒于上述猴頭菇多糖的諸多優(yōu)點(diǎn),其廣闊的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值不言而喻。關(guān)于猴頭菇多糖的提取方法的報(bào)道不斷出現(xiàn)。常用的有熱水浸提法、稀堿液浸提法、稀酸液浸提法等[4-6]。水提取法溶劑用量大、耗時(shí)且效率低,酸堿提取法又易導(dǎo)致多糖立體結(jié)構(gòu)的破壞及生物活性的改變。近年研究較多的新型提取法有超聲波輔助法[7]和酶輔助法[8],這兩種方法比傳統(tǒng)的提取方法省時(shí)、節(jié)約溶劑、提取效率高。但由于超聲波法對(duì)儀器的要求較高較難推廣應(yīng)用,而生物酶價(jià)格昂貴阻礙了酶法提取的廣泛應(yīng)用。微波輔助熱水浸提是一種頗具發(fā)展前景的新型提取技術(shù),微波作為一種電磁能可以大大節(jié)約提取時(shí)間,提高提取速度[9]。本文研究采用微波輔助法提取猴頭菇多糖。

在優(yōu)化提取工藝過(guò)程中,常需同時(shí)考察多個(gè)因素對(duì)結(jié)果的影響,并對(duì)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化。采用固定其他因素而改變某一因素(One Factor at A Time,OFAT)的單因素考察法能收到一定效果,但條件優(yōu)選憑經(jīng)驗(yàn),且無(wú)法考察各因素間的相互作用。當(dāng)因素水平數(shù)較少時(shí)可采用析因設(shè)計(jì)(Factorial Design);較多時(shí),需采用實(shí)驗(yàn)次數(shù)較少的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化法。國(guó)內(nèi)常用均勻設(shè)計(jì)和正交設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化,但這兩種方法實(shí)驗(yàn)精度不夠,建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)性較差。而近年來(lái)國(guó)內(nèi)外許多藥學(xué)工作者采用Box-Behnken效應(yīng)面法(Response Surface Methodology,RSM)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化[10-12],它適用于多因素多水平試驗(yàn)設(shè)計(jì),使用方便,優(yōu)選條件預(yù)測(cè)性好。因此,本文利用Box-Behnken效應(yīng)面法對(duì)微波提取猴頭菇多糖工藝進(jìn)行優(yōu)化,并得到最佳工藝條件,為工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

MM721AAU-PW:佛山寺順德區(qū)美的微波電器制造公司;HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋:國(guó)華電器有限公司;DL-6000B離心機(jī):湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司;FD-8冷凍干燥機(jī):北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;UV-3紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):上海精密儀器儀表有限公司。

1.2 材料與試劑

猴頭菇細(xì)粉100目:購(gòu)自浙江省方格藥業(yè)有限公司;無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品:中國(guó)藥品生物制品檢定所;苯酚、硫酸、乙醇、乙酸鉛(均為分析純)。

1.3 方法

1.3.1 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

參照文獻(xiàn)[13] 采用苯酚-硫酸法測(cè)定猴頭菇中多糖含量。精確稱取無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品50.0mg至250mL容量瓶中,加適量水溶解,加水至刻度,搖勻,配成質(zhì)量濃度為0.2mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL 至 9 支試管中,依次加水,使最終體積均為2 mL,另取2 mL蒸餾水作空白試驗(yàn)。用移液管向每支試管各加入5%苯酚溶液1 mL,搖勻。再向每支試管中緩慢加入濃硫酸5 mL,充分渦旋,冷卻至室溫。在490nm下測(cè)定吸光度,以葡萄糖的濃度(C)為橫坐標(biāo),吸光度(A)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程:C=6.317 4A-0.003 1,R=0.999 6,表明葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品在0.005 mg/mL~0.045 mg/mL內(nèi)濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

1.3.2 猴頭菇多糖提取工藝

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard curve

取2.0 g猴頭菇細(xì)粉,按一定的料液比加入蒸餾水,于微波爐中提取一定時(shí)間,取出置于100℃水浴中加熱30 min,離心取上清液,真空濃縮后按1∶4的比例加入95%乙醇,醇沉過(guò)夜,離心收集沉淀,加蒸餾水復(fù)溶,采用Sevag法與乙酸鉛相結(jié)合去除蛋白質(zhì),用無(wú)水乙醇反復(fù)沖洗多次后,冷凍干燥,既得猴頭菇多糖。

將制備的猴頭菇多糖用蒸餾水溶解,定容于500mL容量瓶中,按照“1.3.1”項(xiàng)下處理,并在490 nm處測(cè)定吸光度,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,計(jì)算猴頭菇多糖提取率。

多糖提取率(%)=[多糖含量(g)/原料重量(g)] ×100

1.3.3 單因素試驗(yàn)

影響微波提取多糖得率的主要因素為料液比、微波功率、微波處理時(shí)間。本文對(duì)料液比選取1∶20,1∶30,1 ∶40,1 ∶50,1 ∶60,1 ∶70(g/mL)6 個(gè)水平;微波功率選取 119、231、385、539、700 W 5 個(gè)水平;微波處理時(shí)間選取 2、4、6、8、10、12、14 min 7 個(gè)水平,分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.3.4 Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化猴頭菇多糖的提取工藝

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取對(duì)猴頭菇多糖的提取工藝影響較顯著的3個(gè)因素:料液比(X1,g/mL)、微波功率(X2,W)和微波處理時(shí)間(X3,min)為考察對(duì)象,以提取率(Y,%)為評(píng)價(jià)指標(biāo),利用3因素3水平的Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化猴頭菇多糖的提取工藝,并且按最佳提取條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。因素水平見(jiàn)表1,制備工藝優(yōu)化試驗(yàn)安排及結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)水平表Table 1 Variables in the Box-Behnken design

2 結(jié)果與討論

2.1 微波提取猴頭菇多糖的單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)猴頭菇多糖提取率的影響

在微波功率為385 W、提取時(shí)間為10 min的條件下,分別按料液比為 1∶20,1∶30,1∶40,1∶50,1∶60,1 ∶70(g/mL)的比例提取猴頭菇多糖,計(jì)算猴頭菇多糖提取率,結(jié)果如圖2所示。

圖2 料液比對(duì)猴頭菇多糖提取率的影響Fig.2 Effects of solid-liquid ratio on extraction rate of Hericium Erinaceus Polysaccharide

由圖2可知,猴頭菇多糖提取率隨著溶劑量增大而增大,料液比在 1 ∶40~1 ∶50(g/mL)之間提取率顯著提高,繼續(xù)提高料液比提取率略有下降,因此選擇料液比為 1 ∶50(g/mL)。

2.1.2 微波功率對(duì)多糖提取率的影響

在料液比 1∶50(g/mL)、提取時(shí)間 10 min的條件下,分別用 119、231、385、539、700 W 的微波功率進(jìn)行微波提取,計(jì)算猴頭菇多糖提取率,結(jié)果如圖3所示。

圖3 微波功率對(duì)猴頭菇多糖提取率的影響Fig.3 Effects of microwave power on extraction rate of Hericium Erinaceus Polysaccharide

由圖3可知,隨著微波功率的增大提取率增大,當(dāng)微波功率到385 W時(shí)提取率到最高值,微波功率繼續(xù)增大提取率降低。研究[14-15]表明,微波功率越大,單位時(shí)間內(nèi)微波輻射能量越高,體系溫度升高越快,從而使固定物料在單位時(shí)間內(nèi)獲得的生物能量逐步增加,加劇物料細(xì)胞的破裂和組織中多糖類物質(zhì)分子及溶劑分子的熱運(yùn)動(dòng),因而使多糖提取率增加。而功率過(guò)大易使多糖降解,使提取率降低。而且微波功率過(guò)大會(huì)發(fā)生爆沸也影響提取率,因此最后確定微波功率為385 W。

2.1.3 微波提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

在料液比1∶50(g/mL)、提取功率385 W的條件下,分別將物料用 2、4、6、8、10、12、14 min 進(jìn)行微波提取,計(jì)算猴頭菇多糖提取率,結(jié)果如圖4所示。

圖4 微波處理提取時(shí)間對(duì)猴頭菇多糖提取率的影響Fig.4 Effects of microwave time on extraction rate of Hericium Erinaceus Polysaccharide

由圖4可知,微波處理時(shí)間加長(zhǎng)提取率升高,在10 min時(shí)提取率明顯提高,而10 min后提取率又明顯下降,可能是因?yàn)槲⒉ㄌ幚頃r(shí)間過(guò)長(zhǎng)易使多糖水解,致使提取率下降,因此微波輔助最適時(shí)間為10 min。

2.1.4 數(shù)據(jù)處理及模型擬合

采用“Design Expert 7.0”實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件,對(duì)猴頭菇多糖微波提取工藝所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,以評(píng)價(jià)指標(biāo)(因變量)分別對(duì)各因素(自變量)進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式方程擬合。對(duì)二項(xiàng)式方程中的各項(xiàng)系數(shù)進(jìn)行F檢驗(yàn),所得結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表與效應(yīng)值Table2 Box-Behnken experiment design independent(X)and dependent variables(Y)

表3 回歸方程中系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)Table 3 Significance test of coefficient in regression equation

獲得猴頭菇多糖提取率對(duì)編碼自變量的二次多項(xiàng)回歸方程:

Y=14.03+0.49X1+0.50X2+0.067X3-0.86X1X2-0.19X1X3-0.59X2X3-1.01X12-0.68X22-1.13X32(Pr=0.0420)

由擬合方程的相關(guān)系數(shù)(Pr=0.042 0)可知模型擬合程度良好,可以用此模型對(duì)猴頭菇多糖微波提取工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。從表3回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)可知,方程模型中X1(Pr=0.071 5)、X2(Pr=0.067 5)、X1X2(Pr=0.037 0)、X12(Pr=0.024 1)、X22(Pr=0.085 4)、X22(Pr=0.016 4)項(xiàng)極顯著,說(shuō)明料液比、微波功率及其這兩個(gè)因素之間的交互作用對(duì)多糖提取率影響較為顯著。

由圖5(A)可知,猴頭菇多糖提取率隨著料液比(X1)的增加而增大,隨著微波功率(X2)的增加先增加后降低;由圖5(B)可知,猴頭菇多糖提取率隨著料液比(X1)的增加出現(xiàn)先增加后降低趨勢(shì),隨著微波處理時(shí)間(X3)的增加也出現(xiàn)先增加后降低趨勢(shì);由圖5(C)可知,猴頭菇多糖提取率隨著微波功率(X2)的增加呈增加趨勢(shì),隨著微波處理時(shí)間(X3)的增加也出現(xiàn)先增加后降低趨勢(shì)。

圖5 效應(yīng)面曲面圖Fig.5 Response surface plot

2.1.5 優(yōu)化工藝參數(shù)驗(yàn)證

以猴頭菇多糖提取率為指標(biāo),根據(jù)“Design Expert 7.0”實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件得最佳猴頭菇多糖微波提取工藝參數(shù)為:料液比 1 ∶50.5(g/mL),微波功率 405 W,微波處理時(shí)間9.5 min。按照“2.1”項(xiàng)下以優(yōu)化后的工藝參數(shù)提取3批猴頭菇多糖,并按照“1.3.1”項(xiàng)下測(cè)定猴頭菇多糖含量,平均提取率為(13.92±0.13)%(n=3),實(shí)驗(yàn)觀測(cè)值與模型預(yù)測(cè)值偏差為3.75%,可知,實(shí)驗(yàn)觀察值和模型預(yù)測(cè)值比較接近,說(shuō)明模型預(yù)測(cè)性良好。

3 結(jié)論

Box-Behnken效應(yīng)面法是多因素3水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),是在2水平析因設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上加上極值點(diǎn)和中心點(diǎn)構(gòu)成的,可在試驗(yàn)中進(jìn)行非線性擬合,具有操作簡(jiǎn)單、試驗(yàn)次數(shù)少、精度高、預(yù)測(cè)性好等優(yōu)點(diǎn)。因此,Box-Behnken效應(yīng)面法在提取工藝領(lǐng)域具有較好的推廣應(yīng)用價(jià)值。需要注意的是Box-Behnken效應(yīng)面法因素一般為2~5個(gè),因素不能太多,否則試驗(yàn)次數(shù)無(wú)法接受,一般不宜采用。

本實(shí)驗(yàn)利用微波提取法對(duì)猴頭菇多糖提取工藝進(jìn)行研究,實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)Box-Behnken效應(yīng)面法分析與優(yōu)化,模型擬合程度良好,確定的最佳提取工藝條件分別為:料液比 1 ∶50.5(g/mL),微波功率 405 W,微波處理時(shí)間 9.5 min,平均提取率為(13.92±0.13)%(n=3),實(shí)驗(yàn)觀測(cè)值與模型預(yù)測(cè)值偏差為3.75%,由此可知,Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化猴頭菇多糖提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確,具有實(shí)際可操作性。

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