超聲輔助提取法提取枇杷核中的總多酚

（華南理工大學化學與化工學院，廣東廣州 510640）

枇杷是水果中的佳品，不僅果肉柔軟多汁，酸甜適口，營養豐富，而且“具秋萌、冬花、春實、夏熟，備四時之氣”，頗受醫學家的青睞。枇杷果實除鮮食之外，主要是對果肉進行加工，如加工成果脯及釀成果醋和果酒。而枇杷核往往被丟棄，造成了資源的浪費。故研究枇杷核中的功效成分為對枇杷的利用提供了一定的理論參考。

多酚類物質是廣泛存在于植物內的多元酚類化合物，具有獨特的生理活性和藥理活性[1-2]。按其結構大致可分為類黃酮、木聚素、酚酸和木酚素[3]。由于其結構各異，生物利用率、抗氧化性及對人體的影響也有差異。但多酚化合物的共同特點還是保持不變的，其良好的抗氧化活性，能預防和治療多種疾病[4]，多酚與VC、VE和胡蘿卜素等其它抗氧化物在體內一起發揮抗氧化功效，清除有害人體健康的自由基[5]。故植物多酚這一來源于綠色植物的可再生生物質材料現正逐漸成為研究的熱點，并在相關領域發揮著不可替代的作用。枇杷果實、花、葉中都含有一定量的多酚[6-7]，也有不少研究者對此進行了研究。而枇杷核中存在的多酚，鮮有人進行詳細的分析與測定。本文針對枇杷核中的多酚進行研究，為開發利用枇杷核中的多酚提供一定的理論指導。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品與試劑

枇杷核：購于福建莆田；無水乙醇（AR）：國藥集團化學試劑有限公司；福林酚：上海源聚生物科技有限公司；沒食子酸（AR）：浙江省溫州市甌油精細化工公司；無水碳酸鈉：廣州化學試劑廠；超純水：Milli-Q超純水系統。

200 mg/L沒食子酸標準溶液：稱取20.0 mg沒食子酸，用超純水溶解后定容到100 mL。

1.1.2 儀器

BS124S精密電子天平：德國賽多利斯天平公司；HR2004多功能榨汁機：飛利浦電子香港有限公司；KQ2200B型超聲清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；U3010紫外可見分光光度計：日本HITACHI。

1.2 實驗方法

1.2.1 枇杷核樣品的預處理

將枇杷核曬干后去掉外皮，放置于榨汁機中攪碎成粉末狀。

1.2.2 枇杷核中多酚的提取

稱取粉碎后的樣品1g（精確到0.1mg）置于100mL的磨口三角瓶中，按不同的料液比加入一定濃度的乙醇-水溶液，置于超聲儀器中，在一定溫度下提取一段時間，將提取液冷卻后抽濾，用相應溶劑定容到50 mL。

1.2.3 多酚的測定

準確移取一定體積的沒食子酸標準溶液或枇杷核多酚提取液于具塞比色管中，然后依次加入3.5 mL 20%的福林酚試劑和1.5 mL10%的碳酸鈉溶液，用水定容到10 mL，顯色70 min后，在670 nm處測定其吸光度。

2 結果與討論

2.1 顯色條件的選擇

2.1.1 碳酸鈉加入量的選擇

取已編號的10支具塞比色管，依次加入樣品提取溶液1.0 mL，20%的福林酚溶3.0 mL，然后按照1～9的順序分別加入10%的碳酸鈉溶液0.5、0.8、1.2、1.5、1.8、2.0、2.5、3.5、4.0 mL，用超純水定容到 10 mL，10 號為空白樣。放置2 h后測定吸光度。結果如表1。

表1 碳酸鈉加入量對顯色的影響Table 1 The effect of Na2CO3on the colored reaction

隨著碳酸鈉加入量的增加，吸光度逐漸增大，增加到1.8 mL時，達到最大，然后再增加碳酸鈉的量，吸光度不斷降低，故選擇碳酸鈉的加入量為1.8 mL。

2.1.2 福林酚加入量的選擇

取已編號的8支具塞比色管，依次加入樣品提取溶液1.0 mL，10%的碳酸鈉溶液1.8 mL，然后按照1～7的順序分別加入20%的福林酚溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL，用超純水定容到 10 mL，8 號為空白樣。放置2 h后測定吸光度。結果如表2。

表2 福林酚加入量對顯色的影響Table 2 The effect of phenol regent on the colored reaction

隨著福林酚用量的增加，吸光度逐漸增大，當達到2.5 mL的時候達到最大，然后繼續增大福林的用量，吸光度有小幅度的降低，故選擇福林酚的加入量為2.5 mL。

2.1.3 顯色時間的選擇

取已編號的11支具塞比色管，依次加入樣品提取溶液1.0 mL，10%的碳酸鈉溶液1.8 mL，20%的福林酚溶液2.5 mL，用超純水定容到10 mL，11號為空白樣。放置5 min之后測定吸光度。結果如表3。

表3 時間對顯色的影響Table 3 The effect of time on the colored reaction

隨著時間的不斷增加，吸光度緩慢增加，當時間為70 min的時候吸光度開始趨于穩定。最終選擇顯色時間為70 min。

2.1.4 顯色條件的正交試驗

多酚的顯色主要是由碳酸鈉（A）用量，福林酚（B）用量，顯色時間（C）來決定。故本文采用三因素三水平L9（33）的正交實驗選擇最佳的顯色條件，見表4。

表4 顯色反應的實驗因素與水平Table 4 The factors and levels of the colored reaction

表5 顯色反應的正交試驗結果Table 5 The orthogonal experimental results of the colored reaction

由上述極差分析得到，影響該顯色反應各因素的主次順序為10%的碳酸鈉＞20%的福林酚＞顯色時間。根據上數據得到顯色的最佳條件為：10%的碳酸鈉1.5 mL，20%的福林酚3.5 mL，顯色時間為70 min。

2.2 標準吸收曲線的繪制

取 200 mg/L的沒食子酸標準溶液 0.05、0.10、0.25、0.50、0.75 mL于10 mL的具塞比色管中，依次加入3.5 mL的20%的福林酚溶液，1.5 mL10%的碳酸鈉溶液，用超純水定容到10 mL，顯色后測定其吸光度A。以吸光度A為縱坐標，沒食子酸的濃度為橫坐標作圖，得到標準曲線圖，見圖1?；貧w方程為：Y=0.034 27+0.099 53X（R2=0.998）。

圖1 沒食子酸標準曲線圖Fig.1 Gallic acid standard curve

2.3 提取條件的優化

2.3.1 乙醇濃度的選擇

稱取1 g（精確到0.1 mg）樣品7份，分別加入乙醇濃度為20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%的乙醇溶液35 mL，在室溫下超聲90 min，抽濾，將濾液用相應的溶劑定容到50 mL，取1.00 mL按照最佳顯色條件顯色后測其吸光度，得到圖2。

圖2 乙醇濃度對提取的影響Fig.2 The effect of ethanol concentration on extraction

由圖2可知，當乙醇濃度達到60%的時候，多酚的提取量達到最大。乙醇濃度過小或者太大都會減少多酚的浸出，當乙醇濃度小于60%時，溶劑還不足以將枇杷核中的多酚完全提取出來，當乙醇濃度大于60%時，由于乙醇濃度過高，導致多酚隨著多糖一起沉淀下來，而使多酚檢出量降低。

2.3.2 提取時間的選擇

稱取1g（精確到0.1mg）樣品7份，加入35mL60%的乙醇溶液，在室溫下分別超聲 10、30、60、90、120、150、180min后抽濾，濾液用60%的乙醇定容到50 mL。移取1.00 mL樣品溶液，按最佳條件顯色后測定其吸光度，實驗結果見圖3。

圖3 時間對提取的影響Fig.3 The effect of time on extraction

由圖3可知，隨著提取時間的增加，提取出的多酚隨之增加，但當提取時間達到120 min時，提取的量基本保持不變，故提取時間120 min已經足夠。

2.3.3 料液比的選擇

稱取1 g（精確到0.1 mg）樣品6份，分別加入60%的乙醇溶液 10、20、25、30、35、40mL，室溫下超聲 120min，抽濾，濾液用60%的乙醇溶液定容到50mL。取1.00 mL的樣品溶液按照最佳顯色條件進行顯色，測對應的吸光度，得到圖4。

圖4 料液比對提取的影響Fig.4 The effect of material-liquid rate on extraction

由圖知當料液比在 1 ∶10～1 ∶25（g/mL）時，多酚的提取率隨著料液比的增加而增大，但是當料液比大于1∶25（g/mL）時，多酚的提取率隨著料液比的增加反而降低，這可能是當料液比增加時，水含量也相應增加，與樣品接觸的機會增多，阻礙了多酚與乙醇的接觸，導致多酚浸出量減少。故最終得到最佳的料液比為1∶25（g/mL）。

2.3.4 提取溫度的選擇

稱取1 g（精確到0.1 mg）樣品8份，加入60%的乙醇溶液 25 mL，分別置于 20、30、40、50、60、70、80、90℃下超聲120 min，抽濾，濾液用60%的乙醇溶液定容到50 mL。取1.00 mL的樣品溶液按照最佳顯色條件進行顯色，測對應的吸光度，得到圖5。

圖5 溫度對提取的影響Fig.5 The effect of temperature on extraction

由數據知，溫度越高，反應越劇烈，提取率越大。但是當達到90℃時，提取率降低，可能是溫度過高，導致多酚部分分解。故選擇溫度為80℃。

2.3.5 提取條件的正交試驗

多酚的提取主要受提取溫度，乙醇濃度，料液比，提取時間的影響。本文采用四因素三水平L9（43）的正交試驗選擇最佳的提取條件，正交試驗的因子水平見表6，實驗數據見表7。

表6 提取條件的實驗因素與水平Table 6 The factors and levels of the extraction

表7 超聲提取法的正交實驗結果Table 7 The orthogonal experimental results of the ultrasonic wave-assisted extraction

由以上極差分析可知，影響多酚提取的各因素中，其主次順序為乙醇濃度＞提取溫度＞提取時間＞料液比。樣品的最佳提取條件為A3B1C1D3，即提取溫度為80℃，乙醇濃度為50%，提取時間為120 min，料液比為 1 ∶20（g/mL）。

2.4 枇杷核中多酚含量的測定

稱取5份1.2.1中的枇杷核樣品1g（精確到0.1mg），按照優化后的條件即提取溫度為80℃，乙醇濃度為50%，提取時間為 120min，料液比為 1∶20（g/mL），進行超聲輔助提取。提取后定容至50 mL，用移液管取1.00 mL進行顯色測定。最終結果如表8。

表8 多酚測定的實驗結果Table 8 The experimental results of polyphenol determination

2.5 回收率實驗

稱取5份1.2.1中的枇杷核樣品1g（精確到0.1mg）放置于磨口三角瓶中，然后各加入1.00 mg的沒食子酸標準品，按照優化后的條件進行超聲輔助提取。提取后定容至50 mL，用移液管取1.00 mL進行顯色測定。最終結果如表9。

3 結論

利用超聲輔助提取法提取枇杷核中的總多酚，結果表明提取枇杷核的最優條件為提取溫度為80℃，乙醇濃度為50%，提取時間為120 min，料液比為1∶20（g/mL）。且枇杷核中的多酚的得率在0.2%左右。

表9 回收率實驗Table 9 The results of recoveries

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