大豆乳清蛋白提取工藝的研究

（河南城建學院生命科學與工程學院，河南平頂山 467036）

蛋白質是人們日常生活中必需的重要營養物質，而大豆是目前蛋白含量最為豐富的一種（蛋白質含量在40%以上）植物，大豆蛋白中含有人體必需的8種氨基酸，特別是大豆中賴氨酸、亮氨酸、蘇氨酸含量較高，對人體有很高的利用價值。大豆蛋白制品包括大豆蛋白粉、濃縮大豆蛋白、大豆分離蛋白等，大豆分離蛋白含量在90%以上，被廣泛用來加工豆制產品[1]。目前以提取大豆分離蛋白為目的的大豆深加工企業每天都要排放大量的乳清廢水。在典型的堿溶酸沉工藝中，每生產1 t大豆分離蛋白會排放30 m2～50 m2的乳清廢水[2]，其中大部分直接排入了自然水體，造成了嚴重的資源浪費和環境污染[3-5]。由于乳清蛋白具有很好的酸溶解性和優越的乳化性和起泡性，長期食用還具有抗腫瘤效果及增強免疫作用，因此在食品加工中有廣泛的應用前景[6-7]。為了更好地開發和回收利用大豆乳清廢水中的乳清蛋白，本文以生產大豆分離蛋白產生的大豆乳清廢水為原料，對大豆乳清蛋白的提取工藝進行了詳細的描述。采用殼聚糖作為絮凝劑將大豆乳清蛋白沉降，得到的大豆乳清蛋白-殼聚糖復合物用水溶解離心后可除去殼聚糖，得到可溶性大豆乳清蛋白。回收大豆廢水中的乳清蛋白不僅節約資源，生產附加值產品，而且有效的控制了污染，對延長大豆產業鏈、推動大豆產業發展、有效控制污染具有重要的意義[8]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

大豆乳清廢水：平頂山市天晶植物蛋白有限公司；牛血清蛋白，考馬斯亮藍：北京索萊寶科技有限公司；溴酚藍：北京中生瑞泰科技有限公司；無水氯化鈣：分析純，濰坊祥坤化工有限公司；殼聚糖：上海鶴善實業有限責任公司。

1.1.2 主要儀器設備

循環水式多用真空泵（SHB-III）：鄭州長城科工貿有限公司；低速離心機（KDC-1044）：科大創新股份有限公司中佳分公司；pH計（pHSJ-3SJ）：上海精密科學儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋（HWS28）：上海一恒科學儀器有限公司；紫外可見分光光度計（T6）：北京普希通用通用儀器有限責任公司；冷凍干燥機（AIpHAl-2LD）：德國 Christ。

1.2 方法

1.2.1 實驗流程

大豆廢液→離心→真空抽濾泵抽濾→CaCl2預處理→離心→殼聚糖處理→離心→除鹽→冷凍干燥→大豆乳清蛋白粉

1.2.3 蛋白質含量檢測

根據文獻[9] ，操作步驟如下。

1）蛋白質標準曲線測定：分別取 0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mL 的 1 mg/mL 牛血清蛋白標準溶液于試管中，再加蒸餾水至0.10 mL，然后取5 mL考馬斯亮藍試劑于試管中，搖勻，并在2 min～5 min內，測其595 nm下的光吸收值，以標準牛血清蛋白的濃度為橫坐標，以對應的595 nm下的光吸收值為縱坐標，繪制標準曲線。

2）取0.10 mL乳清廢液于試管中，然后取5 mL考馬斯亮藍試劑于試管中搖勻，在2 min～5 min內，測其595 nm下的光吸收值，同時做2個平行組。空白對照用蒸餾水代替廢液。最后將測得的光吸收值代入標準曲線，換算出蛋白含量。

1.2.4 大豆乳清廢液的預處理

1）離心。由于大豆廢液中含有比較明顯的固體雜質，不利于抽濾的順利進行，所以首先在4 000 r/min的條件下對廢液進行離心處理，時間15 min。

2）抽濾。用循環水式多用真空泵對離心后得到的上清液進行抽濾，以除去大豆廢液中殘余的蛋白質和其它雜質，取其濾液。

3）CaCl2處理。根據前人多次對絮凝效果的實驗研究[10]，本課題選擇氯化鈣作為絮凝劑，預處理大豆廢液。實驗選取1 mol/L CaCl2對抽濾過的廢水進行處理，除去廢水中未完全沉降的大豆分離蛋白。首先對其加入量進行研究，選取 15、16、17、18、19 mL/L 5 個水平，將抽濾后的廢液分裝5瓶（每瓶各40 mL），在如下條件下進行處理：pH8、溫度50℃、緩慢攪拌時間15 min對大豆廢液進行預處理，選取最佳條件。

1.2.5 殼聚糖沉淀大豆乳清蛋白

本實驗以殼聚糖為絮凝劑將大豆乳清蛋白沉淀下來，將殼聚糖溶液以一定的用量加到經氯化鈣預處理的大豆廢液中，在一定的溫度下絮凝一定時間。以得率為指標，考察處理溫度（15、20、25、30、35、40 ℃）、廢液 pH（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）、殼聚糖加入量（0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L） 和處理時間（20、25、30、35、40、45 min）這4個因素對葡萄糖異構效果的影響。首先進行單因素實驗，在此基礎上，通過四因素三水平的正交實驗確定最佳工藝條件。實驗中每次廢液處理量為40 mL，每組實驗平行3次。

在本實驗中，殼聚糖使用前用3%醋酸進行溶解。然后絮凝預處理之后的大豆廢液，得到大豆乳清蛋白-殼聚糖復合物之后，烘干稱重。大豆乳清蛋白-殼聚糖復合物加蒸餾水攪拌，由于大豆乳清蛋白可溶于水，而殼聚糖不溶于水，沉淀下來，再經過離心，實現絮凝劑的去除。

1.2.6 離心

用正交試驗得出的殼聚糖最佳沉淀效果對大豆廢液進行處理，在4 000 r/min條件下離心20 min，留沉淀棄上清。

1.2.7 除鹽

將離心得到的沉淀用水溶解（溶于水部分是可溶性乳清蛋白），4 000 r/min條件下離心20 min（除去不溶性的雜質和殼聚糖），棄沉淀，上清液在4℃條件下透析24 h。

1.2.8 冷凍干燥

采用真空冷凍干燥法得到可溶性大豆乳清蛋白粉。

1.2.9 得率計算

大豆乳清蛋白得率/%=（大豆乳清蛋白-殼聚糖復合物質量）/氯化鈣絮凝后廢水蛋白含量×殼聚糖絮凝所用廢液體積×100%

2 結果與討論

2.1 蛋白質標準曲線

采用考馬斯亮藍G-250法測廢水中蛋白質含量，得到的蛋白質標準曲線如圖1所示。

圖1 蛋白質標準曲線Fig.1 The standard curve of protein

通過做標準曲線，得到直線方程y=0.641 4x-0.005 1，相關系數R2=0.999 6。根據此標準曲線測得大豆廢液中含蛋白質1.62 mg/mL，用CaCl2預處理除去大豆分離蛋白及部分雜質后上清液蛋白質含量為1.49 mg/mL。

2.2 不同CaCl2用量對大豆分離蛋白除去效果

大豆廢水經不同用量氯化鈣處理，除去大豆分離蛋白得到的結果如圖2所示。

圖2 氯化鈣用量對除大豆分離蛋白效果的影響Fig.2 The effect of calcium chloride content on the removal of soy protein isolated

圖2中橫坐標為每升大豆乳清廢水所需1 mol/L CaCl2的量，縱坐標為得到的大豆分離蛋白的質量（大豆分離蛋白-CaCl2復合物干重減去加入氯化鈣質量）。由圖2可知，CaCl2用量不同時，除去大豆分離蛋白的效果有顯著差異，且去除效果隨CaCl2用量的增加呈現先升高后降低的趨勢，在1 mol/L CaCl2用量為18 mL/L時，除去大豆分離蛋白效果最好。另外由圖2可知，幾乎每個點的縱坐標值都超過了廢液中蛋白質的含量，這是因為加入氯化鈣與溶液中的離子生成沉淀，與大豆分離蛋白同時沉淀下來，這同時減少了溶液中的雜質離子含量。因此，在處理大豆乳清廢液時可以采用每升加入1 mol/L CaCl218 mL為最終用量，與吳海波等的研究結果一致[11]，即每升廢液中添加無水CaCl2（Mr=110.99 g/mol）的質量約為 2 g。

2.3 不同的處理溫度對大豆乳清蛋白得率的影響

在pH6.5，殼聚糖用量為0.3 g/L，加熱時間35 min條件下，選取實驗溫度為 15、20、25、30、35、40 ℃處理廢液，離心得到沉淀，計算大豆乳清蛋白得率，結果如圖3所示。

圖3 處理溫度對大豆乳清蛋白沉淀效果的影響Fig.3 The effect of tempreture on the removal of soy whey protein

由圖3可知，隨著處理溫度的升高，40 mL經氯化鈣預處理的乳清廢液中用殼聚糖沉淀出的大豆乳清蛋白的得率呈現降低趨勢[12]，溫度越低，越有利于大豆乳清蛋白的沉降，在處理溫度為15℃時，所沉淀出的大豆乳清蛋白的質量最多，即得率最高。

2.4 不同pH對大豆乳清蛋白得率的影響

在溫度為30℃，殼聚糖用量為0.3 g/L，加熱時間35 min 條件下，選取 pH 為 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5 處理廢液，離心得到沉淀，計算大豆乳清蛋白得率，結果如圖4所示。

圖4 廢液pH對大豆乳清蛋白沉淀效果的影響Fig.4 The effect of wastewater pH on the removal of soy whey protein

由圖4可知，隨著廢液pH的升高，40 mL經氯化鈣預處理的乳清廢液中用殼聚糖沉淀出的大豆乳清蛋白的得率呈現上升的趨勢，在pH為7時達到最大值，pH繼續增大時，大豆乳清蛋白的得率反而略有降低。比較各pH條件下所得到的大豆乳清蛋白的得率可知，pH為6.5～7.5之間時，廢液絮凝蛋白效果最好。

2.5 不同的殼聚糖用量對大豆乳清蛋白得率的影響

在溫度為30℃，pH6.5，加熱時間35 min條件下，選取殼聚糖用量為 0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L 處理廢液，離心得到沉淀，計算大豆乳清蛋白得率，結果如圖5所示。

圖5 殼聚糖用量對大豆乳清蛋白沉淀效果的影響Fig.5 The effect of the amount of chitosan on the removal of soy whey protein

由圖5可知，隨著殼聚糖用量的增多，40 mL經氯化鈣預處理的乳清廢液中所沉淀出的大豆乳清蛋白的得率呈現先升高后降低的趨勢。在殼聚糖用量為0.3 g/L時，所沉淀出的大豆乳清蛋白的得率最高。

2.6 不同的處理時間對大豆乳清蛋白得率的影響

在溫度為30℃，pH6.5，殼聚糖用量為0.3 g/L條件下，選取處理時間為 20、25、30、35、40、45 min 處理廢液，離心得到沉淀，計算大豆乳清蛋白得率，結果如圖6所示。

由圖6可知，隨著絮凝時間的增加，40 mL經氯化鈣預處理的乳清廢液中所沉淀得出大豆乳清蛋白的得率先升高后降低，在處理時間為40 min時得率達到最高。

圖6 處理時間對大豆乳清蛋白沉淀效果的影響Fig.6 The effect of the time on the removal of soy whey protein

2.7 正交試驗結果

根據上述四個單因素實驗結果，分析各個因素對沉淀效果的影響程度，確定正交實驗各個因素水平，設計正交實驗，以每瓶40 mL廢液進行實驗，各試驗均平行三組，根據正交實驗結果，對數據進行正交分析，確定各因素對沉淀效果的影響程度的大小，從而得到最佳沉淀條件。

表1 L9（34）正交試驗因素水平表Table 1L9（34）factors and levels of orthogonal test

根據表1進行四因素三水平正交試驗，結果如表2。

表2 四因素三水平正交試驗結果Table 2 The results of four factors three levels orthogonal

由表2可知，大豆乳清廢水中蛋白質的最優絮凝工藝條件為A1B3C3D3，即絮凝溫度為15℃，絮凝處理時間為45 min，廢液pH為7.5，絮凝劑殼聚糖用量為0.4 g/L。由極差分析可知，因素主次關系為A>C>D>B，即處理溫度為主要因素，其次為廢液的pH、絮凝劑殼聚糖用量和處理時間。在最佳工藝條件下，實驗室處理1 L廢水可得到大豆乳清蛋白-殼聚糖復合物干重1.018 g。將復合物用蒸餾水溶解，離心除去殼聚糖沉淀，測得上清液蛋白含量為0.618 mg/mL，計算得大豆乳清蛋白得率為41.48%。

3 結論

本研究采用二步絮凝法從大豆乳清廢水中提取可溶性大豆乳清蛋白，確定了最佳提取工藝條件。一步絮凝采用CaCl2作為預處理劑，在其用量為18 mL/L時，效果最好，可除去大部分大豆分離蛋白；二步絮凝采用殼聚糖作為絮凝劑，在處理溫度15℃，處理時間45 min，廢液pH7.5，殼聚糖用量為0.4 g/L時，大豆乳清蛋白-殼聚糖復合物最高得率可達68.3%，此復合物加入蒸餾水后，不溶性的殼聚糖可以采用離心方法去除，得到可溶性大豆乳清蛋白，然后對可溶性大豆乳清蛋白透析脫鹽真空冷凍干燥，最終蛋白得率為41.48%，即每升大豆乳清廢液可以得到0.618 g可溶性大豆乳清蛋白。此技術工藝簡單易行，條件溫和，可用于工業生產，但是對所得到的大豆乳清蛋白的功能性研究還要進一步探討，以期為大豆乳清蛋白的工業化生產提供基礎參考。

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