響應面法優化多棘海盤車消化腺、生殖腺酶解工藝

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（1.中國水產科學研究院黃海水產研究所，碳匯漁業實驗室，山東青島 266071；2.獐子島集團股份有限公司，遼寧大連 116001）

多棘海盤車（Asterias amurensis）（以下簡稱海星）屬于棘皮動物門（Echinodermata）、海星綱（Asteroidea）、海盤車科（Asteriidae），主要分布在我國黃海、渤海海域[1]。海星是一種底棲的海洋無脊椎動物，掠食扇貝、牡蠣、鮑魚等海珍貝類，對沿海的貝類養殖危害巨大[2]。

海星具有發達的消化腺和生殖腺（統稱為海星黃），其中含有豐富的營養成分[3]。另外，科研人員相繼從海星中分離到皂苷、甾醇、生物堿、多糖等多種結構獨特的化學物質[4]，這些化學物質表現出降血壓、抑菌、抗病毒等多種生理和藥理活性[5]。海星在食品、動物飼料、醫藥等領域均展現出良好的應用潛力。然而，海星目前尚未得到有效的開發利用，有關海星黃蛋白水解方面的研究也較少。大分子蛋白經酶解后，更有利于后續的加工利用，為豐富海星高值化加工利用的基礎理論，本文以渤海產多棘海盤車為研究對象，研究了生物酶法在海星黃蛋白水解中的應用效果，并采用響應面法對酶解工藝進行了優化，以期為海星的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

多棘海盤車由大連獐子島集團股份有限公司提供。

中性蛋白酶（1.3×105U/g）、菠蘿蛋白酶（5.0×105U/g）、風味蛋白酶（1.5×104U/g）、復合蛋白酶（1.5×105U/g）購于青島諾馬科生物科技有限公司。其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 可溶性蛋白含量測定

取5.0 mL酶解液加入等體積的三氯乙酸（TCA）溶液（質量分數10%），靜置20 min后，12 000 r/min離心20 min。取上清液，采用雙縮脲比色法[6]測可溶性蛋白含量。

1.2.2 氨基酸態氮含量測定

參照GB/T 5009.39-2003《醬油衛生標準的分析方法》，采用比色法測定[7]。

1.2.3 水解度測定

大分子蛋白通過酶的作用降解為小分子的可溶性多肽和氨基酸，使得溶解性增加，因此可以用可溶性蛋白和氨基酸含量的增加表征蛋白質水解的程度。總蛋白含量的測定采用微量凱氏定氮法[6]。

按照如下公式計算水解度：

式中：DH（degree of hydrolysis）為水解度；P2為酶解液中可溶性蛋白含量，（mg/g）；P1為水解前海星黃勻漿液中可溶性蛋白含量，（mg/g）；N2為酶解液中氨基酸態氮含量，（mg/g）；N1為水解前海星黃勻漿液中氨基酸態氮含量，（mg/g）；N0為海星黃中蛋白質總含量，（mg/g）；9.14為氨基酸態氮與氨基酸含量之間的換算系數（以20種氨基酸平均分子量128計）。

1.2.4 氣味組成分析

采用PEN3便攜式電子鼻（德國AIRSENSE公司）檢測酶解液氣味組成。取樣品1 mL，置于20 mL頂空瓶中，加蓋密封。25℃恒溫靜置20 min，用電子鼻采集數據，采用系統自帶軟件進行數據處理。

1.2.5 水解用酶的篩選

取海星黃，加適量純凈水后勻漿。勻漿液分別添加中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、風味蛋白酶和復合蛋白酶，在各自適宜條件下，進行水解試驗，測定酶解液水解度和氣味組成。

1.2.6 單因素試驗

確定試驗用酶的基礎上，進行底物質量濃度、酶用量、水解時間、pH、溫度等單因素試驗，考察各因素對水解度的影響。

1.2.7 響應面分析

應用Design Expert7.0軟件，以水解度為響應值，基于單因素試驗結果，選取底物質量濃度、酶用量和水解時間進行響應面試驗設計，因素水平見表1。

表1 響應面試驗設計因素水平表Table 1 Design of response surface analysis

1.2.8 數據處理

試驗設3個平行，試驗結果以平均值±標準偏差表示，采用軟件SPSS 17.0進行數據統計分析，顯著性檢驗采用ANOVA，以P＜0.01為極顯著，P＜0.05為顯著，P＞0.05為不顯著。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶種類篩選

中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、風味蛋白酶和復合蛋白酶是水產動物蛋白水解的常用酶[8]。固定底物質量分數5%、酶用量2 000 U/g原料、水解時間90 min，4種蛋白酶在各自最適pH和溫度條件下，對海星黃進行水解，其水解度分別為38.00%、25.64%、8.24%和27.47%。中性蛋白酶對應的水解度相對較高。

4種蛋白酶對應的酶解液氣味如圖1所示。

圖1 酶解液氣味組成分析Fig.1 Flavor analysis of enzymatichydrolysate

中性蛋白酶和菠蘿蛋白酶對應的酶解液氣味組成與原液基本一致，10 個傳感器中，R（1）、R（3）、R（7）、R（9）的響應值略有增大。而風味蛋白酶和復合蛋白酶對應的酶解液氣味組成與原液相差較大，其中R（6）和R（8）傳感器的響應值明顯增大（P＞0.05）。4種蛋白酶對應的酶解液氣味在感官上均可接受，都具有海星特有氣味且無明顯腥、臭等不良氣味。由于中性蛋白酶對應的水解度相對更高且價格便宜，因此作為后續試驗用酶。

2.2 酶解條件單因素分析

以中性蛋白酶作為水解用酶，考察了底物質量分數（5%～20%）、酶用量（500 U/g～8 000 U/g）、pH（6.0～8.0）、溫度（35℃～55℃）、時間（30 min～180 min）等條件對水解度的影響，結果見圖2。單因素試驗結果表明：采用中性蛋白酶對海星黃進行酶解，適宜的底物質量濃度為10%左右、酶用量為2 000 U/g原料左右、pH6.5～7.5、溫度45℃、水解時間90 min左右。

圖 2 底物質量分數（a）、酶用量（b）、pH（c）、溫度（d）和水解時間（e）對水解度的影響Fig.2 Effectofsubstrateconcentration（a），dosageofenzyme（b），pH（c），temperature（d）andtime（e）onthedegreeofhydrolysis

2.3 酶解工藝的響應面優化

2.3.1 響應面試驗結果與方差分析

在單因素試驗基礎上，根據中心組合設計原理，以水解度為響應值，選取底物質量分數、酶用量和水解時間進行響應面試驗，試驗設計和結果見表2。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Results of response surface experiment

采用Design-Expert 7軟件對表2數據進行分析，通過二次多元回歸擬合，得到水解度對底物質量分數（A）、酶用量（B）和水解時間（C）的回歸方程為：DH%=0.41+0.014A+0.043B+0.069C+4.186E-003AB+7.425E-003AC+2.709E-003BC-0.056A2-0.037B2-0.043C2

對模型進行方差分析，結果見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of the regression model

可以看出，模型的P值小于0.01，表明模型高度顯著，而失擬項不顯著（P＞0.05），說明方程對試驗擬合較好。在所選取的因素水平范圍內，各因素對水解度的影響均極顯著，且影響大小依次為：C水解時間＞B酶用量＞A底物質量濃度。

2.3.2 響應曲面圖分析

模型中AB、AC、BC交互項的響應曲面圖見圖3，三維曲面圖越凸的位點表示響應值越大[9]，可以看出AB、AC、BC 交互作用均顯著（P＜0.01），這和表 3的結果一致。

圖3 因素A（底物質量分數）、B（酶用量）、C（時間）交互項的響應曲面圖Fig.3 Interaction diagram of factor A（substrate concentration），B（enzymedosage）and C（time）

2.3.3 驗證實驗

通過DesignExpert對回歸方程求解，得到海星黃最佳水解條件為：底物質量濃度11.0%、酶用量（以原料計）1 768 U/g、水解時間140min，水解度的理論值可達45.67%。在此條件下進行驗證實驗，3次試驗的均值為44.82%，與理論預測值的相對誤差僅為1.9%，說明該模型適宜對海星黃酶解工藝進行分析和預測。

3 討論與結論

海星黃是優質的蛋白來源，通過酶解將大分子蛋白質水解為小分子肽和氨基酸，一方面有助于作為食品利用時的消化吸收[10]，另一方面獲得的多肽可能具有潛在的生物活性[11]。利用酶工程技術水解海洋動物蛋白一直是研究的熱點，研究領域主要集中在魚[12]、蝦[13]、貝類[14]，有關海星黃酶解的研究鮮有報道。

水解度是指蛋白質的肽鍵被裂解的程度或百分比[15]，可以表征大分子蛋白質被降解為小分子肽或氨基酸的程度。水解度的測定可以通過滴定釋放出的質子（如pH-state法[16]）、檢測可溶性蛋白或游離氨基酸含量的變化實現[17]。蛋白酶解過程中，可溶性蛋白和游離氨基酸含量可能同時增加，在酶解的不同時期兩者產生的速率也有差別。本文為提高數據準確性，同時檢測酸可溶性蛋白和游離氨基酸含量變化，將兩者含量與不溶性蛋白的比作為水解度值。

響應面分析法在試驗設計和結果表述方面具有獨特優勢[18]。本實驗采用響應面法得到的海星黃水解工藝為：底物質量分數11.0%、酶用量（以原料計）1 768 U/g、水解時間140 min，此條件下水解度可達44%以上，所建立的二次回歸模型可較好的模擬海星黃的水解規律，對于相關產品的開發和生產具有一定的參考價值。

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