嬰幼兒乳粉中泛酸測定的不確定度研究

（山東省產品質量檢驗研究院，山東濟南 250103）

測量不確定度是表征合理地賦予被測量值的分散性，與測量結果相聯系的參數[1]。它可以表征被測量值的合理范圍，并直接與檢驗結果的合格判定相關。完整的測量結果表示應該包括測量不確定度[2]。由于某些檢測方法的性質，決定了無法從計量學和統計學角度對測量不確定度進行有效而嚴格的評估，這時至少應通過分析方法，列出各主要的不確定度分量，并做出合理的評估[3]。

泛酸是輔酶A（CoA）和?；d體蛋白（ACP）生物合成的重要前體物質，參與人體中類固醇、褪黑激素、抗體和亞鐵血紅素的合成[4]，是維持生命正常生理機能的必需小分子有機物，也是嬰幼兒乳粉中重要的營養物質。GB 10765-2010《食品安全國家標準嬰兒配方食品》和GB 10767-2010《食品安全國家標準較大嬰兒和幼兒配方食品》中規定泛酸在嬰幼兒乳粉中的限量分別為96μg/100kJ～478μg/100kJ和大于70μg/100 kJ，即 1 920 μg/100 g～9 560 μg/100 g 和大于 1 400 μg/100 g（以乳粉能量為2 000 kJ/100 g計）。

目前測定泛酸的方法有高效液相法、氣相色譜法和微生物法[5-7]。微生物法測定泛酸含量靈敏度高，是美國公職分析化學家協會AOAC要求的官方檢測方法，也是國家標準檢驗方法的仲裁法。該方法操作繁雜，且因微生物生長的不確定性強使得影響結果的因素很多，對檢驗人員的操作和實驗室設施要求較高。為了保證泛酸測定結果的準確性，本實驗依據JJF1059.1-2012和GB/Z 22553-2010對泛酸測定過程中影響檢驗結果的各個分量進行了評估，并給出擴展不確定度，可據此提高微生物法測定嬰幼兒乳粉中泛酸的精密度和準確度。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

試樣為在市場上隨機抽取的嬰幼兒乳粉。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，ATCC8014）；乳酸桿菌瓊脂培養基；乳酸桿菌肉湯培養基；泛酸測定用培養基（配制見附錄A[8]）；泛酸鈣標準品（＞98.8%），德國Dr.Ehrenstorfer公司；Tris緩沖液；去離子水；0.1 mol/L鹽酸溶液；定量濾紙。

1.2 儀器與設備

AL204型電子天平：瑞士梅特勒-托利多儀器公司（精度0.1mg）；PHS-3E型酸度計：上海雷磁公司（精度0.01）；SX-300型高壓蒸汽滅菌鍋：日本TOMY公司；315K型高速冷凍離心機：德國Sigma公司（最大轉速15 300 r/min）；SHP-250型生化培養箱：上海精宏實驗設備有限公司（36℃±0.5℃）；Cary100型紫外-可見分光光度計：美國瓦里安公司（精度0.000 1）。

1.3 樣品處理與試驗方法

1.3.1 試樣處理與稀釋

稱取2.00 g（精確至0.000 1 g）試樣于三角瓶中，加入10 mL Tris緩沖液和少量去離子水，121℃水解15 min后冷卻。用0.1 mol/L鹽酸溶液調節pH至4.5，轉入250 mL容量瓶中用去離子水定容。取少許稀釋樣液，定量濾紙過濾。取5 mL濾液，用去離子水稀釋至160 mL，即為試樣的測試液。

1.3.2 測定

按照GB5413.17-2010《食品安全國家標準嬰幼兒食品和乳品中泛酸的測定》6.3～6.8進行標準曲線制作、試樣管制作、滅菌、接種、培養、測定。

1.4 標準曲線的繪制、結果計算與分析

以泛酸含量（ng）為橫坐標，OD550nm為縱坐標，使用專業繪圖軟件繪制標準曲線，并利用軟件讀取測試液中的泛酸含量[9]。數值取舍方法按照GB5413.17-2010《食品安全國家標準嬰幼兒食品和乳品中泛酸的測定》6.10進行。

1.5 計算公式

根據GB 5413.17-2010，測量結果計算公式為：

式中：X 為試樣中泛酸含量，（μg/100 g）；Cx為有效試樣管中每毫升測試液泛酸含量的總平均值，ng；m為試樣的質量，g；f為稀釋倍數。

2 結果與分析

2.1 不確定度來源分析

根據整個試驗過程分析，微生物法進行泛酸含量測定的不確定度主要來自以下方面：測量重復性、標準物質稱取及標準溶液配制、試樣稱量、試樣前處理及稀釋、紫外分光光度計測量偏差[10-12]。

2.2 測量不確定度評定

2.2.1 測量重復性引入的不確定度

重復測定產生的不確定度屬于A類不確定度[13]，它包含試樣稱量、試樣前處理及稀釋操作、微生物生長差異、使用器具和儀器引入的不確定度。按照GB 5413.17-2010的要求對同一試樣的泛酸進行12次平行測定，結果見表1。

表1 乳粉重復測定的結果及回收率Table 1 Results and recoveries of the repeated measurements

所測結果X平均值的標準不確定度u（X）采用平均值的標準偏差s（）來表示，則重復測定引入的不確定度：

相對標準不確定度為：

2.2.2 標準物質及標準溶液配制引入的不確定度

2.2.2.1 標準品引入的不確定度

根據泛酸鈣標準品說明書所述，其純度p=（100±1.2）%，按B類不確定度評定[13]，區間的半寬度為0.001 2，視為矩形分布，則標準不確定度為：

2.2.2.2 標準品稱量引入的不確定度

用電子天平準確稱取44.00 mg泛酸鈣標準品，所用天平精度為0.1 mg。根據檢定證書，最大重復性誤差為0.2 mg，當0≤m≤50 g時，示值誤差為0.5 mg。采用矩陣分布，包含因子為按B類不確定度評定，標準不確定度為：

合成標準不確定度為：

標準品稱量引入相對標準不確定度：

2.2.2.3 標準溶液配制過程引入的不確定度

標準溶液配制過程使用了容量瓶、吸量管等玻璃器具，而這些玻璃器具的校準和室溫對液體體積的影響可導致標準溶液配制的偏差[14-15]。

根據最大允許誤差[16]，按均勻分布處理據此計算不確定度分量：

據此計算得出的相對不確定度數值見表2。

表2 標準溶液配制時玻璃量具校準引入的不確定度Table 2 Uncertainties for measuring glasses’calibration in standard solution preparation

合成玻璃器具校準引入的不確定度分量：

實驗室溫度變化介于（20±5）℃之間，與玻璃器具20℃的校準溫度不同。根據水的膨脹系數為2.1×10-4/℃，且遠大于玻璃膨脹系數。假設溫度變化為矩形分布，其引入的不確定度分量為：

u（VT）=，相對標準不確定度為，合成實驗室溫度變化引入的玻璃器具相對不確定度分量：

由標準品及其稱量、標準溶液配制引入的不確定度分量合成的相對標準不確定度為：

2.2.3 試樣稱量引入的不確定度

試樣稱取質量介于0～50 mg之間，稱取2.013 2 g，即2 013.2 mg試樣引入的相對不確定度計算方法可參照本文2.2.2.2，應為：

2.2.4 試樣前處理及稀釋引入的不確定度

2.2.4.1 試樣前處理引入的不確定度

樣品前處理過程中泛酸存在損失，通過試樣添加泛酸計算回收率，12次試樣添加回收率見表1，回收率范圍88.1%～112.4%，平均回收率為r=99.1%，標準偏差S（r）=0.091。標準不確定度采用平均值的標準偏差，標準不確定度為，相對標準不確定度為因此，由試樣前處理過程產生的相對不確定度為2.64×10-2。

2.2.4.2 試樣稀釋過程引入的不確定度

試樣的前處理過程需要進行稀釋操作，期間使用了容量瓶、吸量管、量筒等玻璃器具，而玻璃器具的校準和室溫對液體體積的影響可導致試樣泛酸含量測定的偏差。根據2.2.2.3的公式可計算得出玻璃器具校準引入的相對不確定度，具體數值見表3。合成試樣稀釋過程中玻璃量具引入的不確定度：

表3 試樣稀釋時玻璃量具校準引入的不確定度Table 3 Uncertainties for measuring glasses’calibration in sample dilution

參照2.2.2.3的評估，合成實驗室溫度變化造成的玻璃量具不確定度分量：

由試樣前處理及稀釋過程引入的的不確定度分量合成的相對標準不確定度為：

2.2.5 紫外-可見分光光度計測量偏差引入的不確定度

根據檢定證書，紫外-可見分光光度計的透射比示值誤差是0.4%，透射比重復性是0.0%，測定值一般為對稱分布，則紫外分光光度計測量偏差引入的相對標準不確定度為：

2.3 合成不確定度的計算

實驗過程中影響檢驗結果的各個因素引入的相對標準不確定度見表4。綜合各分量可得到合成標準不確定度。則嬰幼兒食品和乳粉中泛酸含量測定的不確定度為：

表4 各影響因素分量引入的不確定度Table 4 Uncertainties of all affecting factors

2.4 擴展不確定度評定

擴展不確定度可由合成標準不確定度乘以包含因子（k），在 95%置信水平下，k=2，因此，試樣中泛酸含量測定的相對擴展不確定度為：

由計算得出的嬰幼兒乳粉中泛酸含量為（1 990.1±121.0）μg/100g。

3 結語

經評估，微生物法測定嬰幼兒乳粉中泛酸含量的操作過程中，對檢驗結果影響最大的是試樣前處理及稀釋，其次是標準溶液的配制和測量重復性。試樣的稱量、紫外-可見分光光度計測量偏差對試驗結果的影響較小。整個試驗過程涉及較多玻璃器具的使用，應嚴格移液操作，從而提高檢驗的精密度和準確度。

整個測定過程以植物乳桿菌作為媒介，每次測定時的細菌培養溫度、菌齡均有細微差異，這些不易估計的影響因素可粗略用基于試驗及最終結果的重復性的標準偏差來表征[17-18]。在以微生物為媒介測定化學成分的方法中，每次測定時微生物生長狀態的差異，是檢驗人員操作和儀器測量偏差之外的主要誤差來源。

微生物法測定嬰幼兒乳粉中泛酸的結果為（1 990.1±121.0）μg/100 g，k=2，p=95%。

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