南極磷蝦中氟含量的兩種測定方法優化與比較

，3，*

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.中國水產科學研究院黃海水產研究所食品工程與營養研究室，山東青島 266071；3.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島 266003）

南極磷蝦（Euphausia superba Dana），資源蘊藏量巨大，據估計在6.5億t～10億t，是可供人類利用的海洋動物資源中蘊藏量最為豐富的一種，也是人類重要的后備蛋白庫[1]。南極磷蝦營養豐富，除富含蛋白質、必需氨基酸和亞油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸外，還含有鈣、鉀、鎂、鍶等多種礦物質元素，開發潛力巨大[2-4]。目前已有20多個國家正在進行南極磷蝦加工工藝及生物活性物質提取的研究，其研究熱點集中于南極磷蝦原料的保鮮、生物活性物質的提取、蝦油、蝦膏及蝦糜的加工工藝等[5]，但高氟含量成為開發利用的“瓶頸”。

氟是非金屬中最活潑的元素，氧化能力很強，可以同絕大部分非金屬元素和金屬元素反應，生成氟化物。適量的氟是人體所必需的，可以與牙齒鈣質生成不溶于水的氟化鈣，預防齲齒。過量的氟對機體的多種組織器官及系統均有影響，會引起氟斑牙、氟骨癥[6]。氟化物可以通過生物鏈蓄積進入人體[7]，主要積聚在骨組織（骨骼和牙齒）中[8]。世界衛生組織（WHO）提出，人均每天適宜的氟攝入量ADI值為2.5 mg～4.0 mg。國標（GB/T 5009.18-2003）《食品中氟的測定》中規定了食品中氟的三種測定方法，分別為擴散-氟試劑比色法、灰化蒸餾-氟試劑比色（ADFRC）法和離子選擇電極（ISE）法[9]。谷類、果蔬、肉類、蛋類及豆制品等食品的氟含量低于5 mg/kg，南極磷蝦整蝦的氟含量可達1 300 mg/kg～2 400 mg/kg（干重計）[3]。因此，探討國標中3種方法是否適用于南極磷蝦中氟含量的測定具有重要意義。擴散-氟試劑比色法的方法檢出限為0.10 mg/kg，所用的塑料擴散盒不易購買，樣品前處理較為繁瑣，檢測分析周期為24 h～30 h，檢測范圍0.10 mg/kg～1.00 mg/kg，不適于測定高氟含量的南極磷蝦樣品。本文比較并優化了ADFRC法和ISE法檢測南極磷蝦中氟含量的操作條件，采用精密度和t檢驗比較兩種方法檢測結果的差異性，旨在篩選出適宜檢測高氟含量南極磷蝦樣品的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

南極磷蝦由遼寧省大連海洋漁業集團公司提供，-20℃冰柜中儲藏。

蝦膏、蝦糜及蝦醬均由實驗室加工制作，蝦膏和蝦糜于-20℃冰柜中儲藏，蝦醬于-4℃冰柜中儲藏。

蝦糜的加工工藝：南極磷蝦→篩分→漂洗→瀝水→脫殼采肉→裝盤、稱重→速凍→脫盤、包冰→包裝、冷藏

蝦膏的加工工藝：南極磷蝦→篩分→漂洗→瀝水→脫殼采肉→酶解→分離→濃縮→調味殺菌→成品包裝

蝦醬的加工工藝：南極磷蝦→篩分→漂洗→瀝水→脫殼采肉→發酵→分離→濃縮→調味殺菌→成品包裝

1.2 試驗試劑

氟標準溶液，茜素氨羧絡合劑（氟試劑），硝酸鑭溶液，丙酮，緩沖液（pH4.7），硝酸鎂溶液（100 g/L），氫氧化鈉溶液（100 g/L），乙酸溶液（1 mol/L），酚酞-乙醇指示液（10 g/L），硫酸（2+1），鹽酸溶液（1+11），總離子強度緩沖溶液（TISAB）。

所用試劑均為A.R級，依照GB/T 5009.18-2003《食品中氟的測定》配制。所用水均為雙蒸水。

1.3 儀器與設備

UNICO UV-2000型紫外可見分光光度計：尤尼柯儀器有限公司；雷磁PHS-3C離子計：上海精密科學儀器有限公司；氟離子選擇電極PF-1-01型：上海儀電科學儀器股份有限公司；甘汞電極232型：上海儀電科學儀器股份有限公司；分析天平：賽多利斯BSA型；pH計STARTER 3C：奧豪斯儀器有限公司；九陽料理機JYL-C020：九陽股份有限公司；快速混勻器SZ-1型：江蘇金城國勝實驗儀器廠；電熱鼓風干燥箱101-1AB型：天津市泰斯特儀器有限公司；磁力攪拌器78-1型：常州國華電器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 ADFRC法

取100 g左右的南極磷蝦鮮樣，絞肉機攪碎。稱取5.00 g左右南極磷蝦樣品于30 mL坩堝中，加5.0 mL硝酸鎂溶液（100 g/L）和 0.5 mL氫氧化鈉溶液（100 g/L），混勻后浸泡30 min，烘箱中105℃蒸干，低溫炭化，550℃灰化6 h，干燥器中冷卻。按國標GB/T 5009.18-2003《食品中氟的測定》9.3規定蒸餾，9.4規定測定。

1.4.2 ISE法

稱取2.00 g左右南極磷蝦樣品，置于50 mL刻度管中，加入10 mL鹽酸溶液，組織混勻機混勻（避免樣品粘在瓶壁上），密閉浸提1 h，加入25 mLTISAB，再加水定容，混勻。氟離子選擇電極和甘汞電極與測量儀器相連接。電極插入盛有雙蒸水的50 mL塑料燒杯中，塑料燒杯中放有與其配套的磁力攪拌子，在電磁攪拌中，讀取平衡電位值，更換2次～3次水后，待電位值平衡后，一般回升到360 mV以上，即可進行樣液與標準液的電位測定。

1.4.3 數據處理與分析

分別用兩種方法測定南極磷蝦中的氟含量，每次3個平行，重復2次，結果以平均值X、標準偏差SD及相對標準偏差RSD表示，采用SPSS17.0進行配對樣品的t檢驗分析，若概率P＜0.05，則差異顯著；若P＞0.05，則差異不顯著。

2 結果分析與討論

2.1 ADFRC法的檢測條件優化

2.1.1 最適波長的確定

以未加氟標準使用液蒸餾得到的餾出液為空白，測定 1.0 μg/10 mL 氟標準使用液在 550、560、570、580、590、600、610、620 nm 下的吸光度，結果顯示波長在560 nm～590 nm之間，吸光度穩定，且在580 nm條件下，示數最快達到穩定。波長越大，吸光度值越小。雖然在550 nm吸光度較大，但是結果不穩定，有較大波動。確定波長580 nm為ADFRC法的測定波長。

圖1 波長對吸光度的影響Fig.1 Effect of wavelength on the absorbance

2.1.2 樣品稀釋倍數對吸光度的影響

按照國標GB/T 5009.18-2003規定，以氟濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。氟濃度為0、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0 μg/10mL，得到標準曲線 Y=0.012X+0.007 4，R2=0.995 2，線性范圍較窄 0.1 mg/kg～2.0 mg/kg。樣品經灰化蒸餾，得到蒸餾原液，其吸光度不在標準曲線線性范圍內，需對樣品原液進行稀釋。樣品原液稀釋10倍、25倍、50倍，測樣品吸光度，計算南極磷蝦氟含量（以濕基計），每組實驗三次平行，見表1。

結果顯示，稀釋25倍的樣品濃度氟含量測定結果準確，后續試驗選擇樣品餾出液稀釋25倍。

表1 樣品稀釋倍數對吸光度的影響Table 1 Effect of sample dilution multiple on the absorbance

2.2 ISE法的檢測條件優化

2.2.1 取樣量及加酸量

采用國標ISE法測定2012年南極磷蝦整蝦的氟含量（以濕基計），結果見表2中A組數據，南極磷蝦整蝦的氟含量X為312.43 mg/kg，SD為10.622 3，樣品平行性不好，需對取樣量及加酸量進行優化。以取樣量和加酸量作為變化參數，分別設置取樣1、2、3 g，鹽酸體積10、15、20 mL，得到九種試驗組合，每組三次平行，研究取樣量和加酸量對ISE檢測方法的影響。

表2 取樣量及加酸量的選擇Table 2 Selection of sampling quantity and hydrochloric acid volume

樣品測定時，必須用TISAB調節pH在5～6之間，以消除與氟離子形成絡合物的鐵、鋁及硅酸根等干擾離子及酸度的影響。當添加鹽酸20 mL，TISAB 25 mL，定容50 mL時，測定待測液的pH在5.0～5.2之間。當鹽酸體積超過20 mL時，待測液的pH低于5.0，因此設定鹽酸最大添加量為20 mL。結果顯示（見表2），A、B、C三組樣品平行性不好，D、E、F、G、H、I六組樣品平行性均較好，測定結果均在310.18±4.075 4左右。由于南極磷蝦氟含量分布不均，加大取樣量可以提高樣品的代表性，綜合取樣量與加酸量的檢測結果，確定取樣2 g，添加鹽酸10 mL，TISAB25 mL，進行后續試驗。

2.2.2 標準曲線

比較國標ISE法和標準溶液添加法的標準曲線。標準溶液添加法的標準曲線：加10 mL鹽酸，25 mL TISAB，定容到 50 mL，此標準液氟濃度為 0 μg/mL；連續添加 100、200、200、200、100 μL 的 1.0 mg/mL 氟標準溶液得到濃度為 1.996 0、5.964 2、9.901 0、13.806 7、15.748 0 μg/mL的氟標準液；以電極電位為縱坐標，氟標準液濃度的對數為橫坐標，繪制標準曲線。分別用兩種方法的標準曲線計算2012年南極磷蝦整蝦的氟含量（以濕基計），按照2.2.1優化的取樣量和加酸條件進行樣品測定，樣品三次平行，結果見表3。

表3 標準曲線Table 3 Standard curves of two methods

采用國標法與標準溶液添加法分別繪制標準曲線，得到的曲線方程沒有顯著差別，均具有良好的線性相關性（R2＞0.999）。南極磷蝦氟含量，國標法測定結果（308.78±2.588 7）mg/kg，RSD 為 0.838 4；標準溶液添加法測定結果（304.47±2.651 7）mg/kg，RSD 為 0.870 9。與國標方法相比，采用標準溶液添加法，操作簡單，節省時間及試劑，同時也減小誤差，因此確定采用標準溶液添加法繪制標準曲線。

2.3 兩種方法測定結果差異性分析

分別采用優化后的ADFRC法和ISE法測定2012年南極磷蝦中的氟含量（以濕基計）。取3個樣，每組6次平行，見表4。

表4 兩種測定方法的精密度比較Table 4 Precision comparison of the two methodsmg/kg

結果顯示，ADFRC法測定樣品氟含量306.63mg/kg～311.73 mg/kg，ISE法測定樣品氟含量304.93 mg/kg～306.64 mg/kg，數據均在（306.62±2.620 2）mg/kg。兩種方法相比，ADFRC法SD較大，RSD在5.9879%～9.2794%之間，樣品平行性不好；ISE法SD較小，RSD在0.4123%～0.903 1%之間，樣品平行性較好。

2號樣品的氟含量在三組樣品的測定結果中標準差及相對標準偏差均居中，取其測定結果進行配對樣品 t檢驗，見表 5、6。

表5 兩種測定方法的結果比較Table 5 Comparison of the results of two methods mg/kg

表6 配對樣品t檢驗Table 6 Paired t-test of samples

結果顯示，雙尾概率P=0.681大于0.05，表明兩種方法測定南極磷蝦整蝦的氟含量不存在顯著性差異。結合表5，ISE法的SD值（2.507 3）明顯低于ADFRC法的SD值（20.071 4），表明ISE法的樣品平行性較好，因此確定采用ISE法測定南極磷蝦制品中的氟含量。

2.4 南極磷蝦及其制品中氟含量的測定

采用ISE法測定2012年南極磷蝦各部位及其制品中的氟含量，見表7。

表7 南極磷蝦及其制品中氟含量（濕重）Table 7 Fluorine content of Antarctic krill and its products（wet weight） mg/kg

結果顯示，南極磷蝦中的氟含量的分布具有甲殼＞頭部＞肌肉的變化特征，與文獻報道一致[10]。蝦膏及蝦醬加工過程中去掉蝦頭，蝦糜加工不去蝦頭，致使蝦膏及蝦醬中氟含量低于蝦糜。在加工過程中去掉甲殼及頭部可降低南極磷蝦制品中的氟含量。

3 結論

本文分別對兩種方法的檢測條件進行優化，確定ADFRC法的測定波長為580 nm，樣品餾出液稀釋25倍測定樣品中氟含量；確定ISE法取樣2g，加鹽酸10mL，浸提1 h，加TISAB 25 mL，定至50 mL，采用標準溶液添加法繪制標準曲線，測定樣品中氟含量。兩種測定方法相比，ADFRC法操作復雜繁瑣，需配制硫酸、鹽酸、氫氧化鈉、硝酸鑭、茜素氨羧絡合劑等大量試劑，樣品經前處理后和系列氟標準都需逐一蒸餾，費時費力，對操作人員要求相對較高，不適宜大批樣品的測定[11]；ISE法只需配制總離子強度緩沖液和鹽酸溶液，操作簡便省時，適合大批量樣品的快速測定。ADFRC法的檢出限是 0.10 μg/mL[9]，ISE 法的檢出限 0.02μg/mL[12]。與ADFRC法相比，ISE法樣品平行性好，檢測范圍更寬，可以測定水、血液及尿中氟含量（1.0 μg/mL），也可測定南極磷蝦干粉中氟含量（2 518.6 mg/kg）[13]。

應用ISE法測定南極磷蝦各部位及蝦糜、蝦膏及蝦醬中氟含量。結果顯示，南極磷蝦各部位中氟含量的分布具有甲殼>頭部>肌肉的變化特征，在加工過程中去掉甲殼及頭部可降低南極磷蝦制品中的氟含量。

[1] Tou J C,Jaczynski J,Chen Y C.Krill for Human Consumption:Nutritional Value and Potential Health Benefits[J] .Nutrition Reviews,2008,65(2):63-77

[2] Yoshitomi B.Utilization of Antarctic krill for food and feed[J] .2004,42(2):45-54

[3] 孫雷,周德慶,盛曉風.南極磷蝦營養評價與安全性研究[J] .海洋水產研究,2008(2):57-64

[4] 劉麗,劉承初,趙勇,等.南極磷蝦的營養保健功效以及食用安全性評價[J] .食品科學,2010(17):443-447

[5] 李勵年,王茜.南極磷蝦產業發展最新動向[J] .現代漁業信息,2011(12):6-9

[6] 邊歸國.無機氟化物對人體健康影響機理研究新進展[J] .化工生產與技術,2008(5):13-16

[7] Nell J A,Livanos G.Effects of fluoride concentration in seawater on growth and fluoride accumulation by Sydney rock oyster(Saccostrea commercialis)and flat oyster(Ostrea angasi)spat[J] .Water Research,1988,22(6):749-753

[8] Camargo J A.Fluoride toxicity to aquatic organisms:a review[J] .Chemosphere,2003,50(3):251-264

[9] 中華人民共和國衛生部.GB/T 5009.18-2003食品中氟的測定[S] .北京:中國標準出版社,2003:143-150

[10] 朱蘭蘭,趙彥玲,趙曉君,等.南極磷蝦中氟含量的調查分析[J] .食品工業科技,2012,33(24):55-57

[11] 高素虹,蔡夢華,洪祥奇.灰化蒸餾-氟試劑比色法與離子色譜法測定茶葉中氟含量的比較[J] .預防醫學論壇,2010(6):549-550

[12] 管楠.氟化物離子選擇電極法最低檢出限的測定[J] .黑龍江科技信息,2012(3):4

[13] 趙曉君,朱蘭蘭,蘇婧怡,等.南極磷蝦粉中氟形態及其分析技術[J] .南方農業學報,2012(9):1386-1387