右旋糖酐40中細菌內毒素超濾去除工藝*

支興蕾，李存玉，李紅陽，陸揚，彭國平

(南京中醫藥大學藥學院，南京 210029)

右旋糖酐40是經發酵后生成的高分子葡萄糖聚合物，均分子量32～42 kDa。臨床常用右旋糖酐40的葡萄糖注射液或氯化鈉注射液。右旋糖酐40常作為血容量擴充劑，靜脈注射后能提高血漿膠體滲透壓，吸收血管外水分而增加血容量，升高和維持血壓［1］。它可使已經聚集的紅細胞和血小板解聚，降低血液黏滯性，改善微循環，防止血栓形成［2］。此外，還具有滲透性利尿作用［3］，臨床的使用量較大。在其生產工藝中由于其分子量較大，無法采用超濾技術，因此目前多采用活性炭法去除其原料中的細菌內毒素污染。但是在突發污染時，由于活性炭的包合吸附特征［4］，難以保障細菌內毒素的去除效率。如果在放大膜孔徑保證成分透過的同時也能有效去除細菌內毒素，則超濾法［5-7］將是一種較理想的技術，筆者在本實驗中選擇截留分子量為100～300 kDa，不同親水性材質的超濾膜(聚醚砜、復合、聚偏氟乙烯)，進行右旋糖酐40的超濾工藝優選。參照2010年版《中華人民共和國藥典》二部中細菌內毒素檢查法中的動態濁度法，定量檢測右旋糖酐40超濾前后細菌內毒素的含量，同時用高效液相色譜(HPLC)法檢測超濾前后有效成分右旋糖酐40的變化情況，以去除細菌內毒素的效果和對有效成分的影響優選適宜的右旋糖酐40超濾工藝，為右旋糖酐40注射劑的生產工藝中去除細菌內毒素提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Millipore蠕動泵，復合材質超濾膜［中空纖維式，膜面積:0.5 m2，聚醚砜與聚偏氟乙烯復合，截留分子量(MWCO)=100，200，300 kDa;南京拓鉒醫藥科技有限公司，批號:HVF-1205010，HVF-1205020，HVF-1205030］，聚偏氟乙烯超濾膜(中空纖維式，膜面積:0.5 m2，MWCO=100，200，300 kDa;杭州水清科技環保有限公司，批號:E2009G4-10，E2009G4-20，E2009G4-30)，聚醚砜超濾膜(中空纖維式，膜面積:0.5 m2，MWCO=100，200，300 kDa;浙江潤達環保科技有限公司，批號:PES-1003010，PES-1003020，PES-1003030)。BET-16M細菌內毒素測定儀、渦旋混合儀(天津市天大天發科技有限公司)。高效液相色譜儀(日本島津):LC-10ATVP輸液泵，RID-10A示差折光檢測器，CTO-10ASVP柱溫箱;GPC色譜工作站(天津龍智達公司)。馬爾文激光粒度分析儀(Malvern ZEW3600，Malvern Instruments)。

1.2 試藥 動態濁度法鱟試劑(湛江博康海洋生物有限公司，批號:1003090，λ =0.03 EU·mL－1，規格:每瓶0.6mL);細菌內毒素工作標準品(批號:150601-201174，規格:每瓶160 EU，中國食品藥品檢驗研究院);細菌內毒素檢查用水(湛江博康海洋生物有限公司，批號:0910190，規格:每瓶5mL)。右旋糖酐40對照品(中國食品藥品檢驗研究院，批號:1179876，生化純)。右旋糖酐40原料(北京九州天瑞科技有限公司，一級，規格:每袋 100 g，批號:58798-40-2)。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備 稱取適量右旋糖酐40原料，加超純水溶解，加入一定量的細菌內毒素，煮沸，為原液，得0.1 g·mL－1右旋糖酐40 溶液。

2.2 右旋糖酐40溶液的超濾 取原液2.0 L，分別經截留分子量100，200和300 kDa的超濾膜超濾，溶液在超濾之前首先進行平衡，排除膜表面、孔徑等因素對溶質的吸附影響，平衡時間以超濾液總流量的4倍藥液體積，進而進行超濾，待超濾完全后，取樣超濾液。并按式(1)和式(2)分別計算各藥液中細菌內毒素的去除率以及有效成分的回收率。

Q(%)=(C原－C超)/C原×100%(1)。

式(1)中，Q(%)為內毒素的去除率，C超為超濾液中細菌內毒素的含量(EU·mL－1);C原為藥液原液中細菌內毒素的含量(EU·mL－1)。

R'(%)=C'超/C'原×100%(2)。

式(2)中，R(%)為右旋糖酐40的回收率，C'超為超濾液中右旋糖酐40的含量;C'原為藥液原液中右旋糖酐40的含量。

2.3 細菌內毒素的檢測

2.3.1 標準曲線的繪制及其可靠性實驗 用細菌內毒素檢查用水將細菌內毒素工作標準品溶解并稀釋，配制成細菌內毒素濃度分別為 2，0.5，0.125，0.031 25 EU·mL－1標準溶液系列，各取0.1mL，分別加到預先加有鱟試劑溶液0.1mL的反應管內，混合均勻，插入細菌內毒素定量檢測儀內進行檢測，其中每一濃度重復3管，并同時作陰性對照3管。以細菌內毒素濃度(C)為橫坐標，反應時間(t)的對數為縱坐標，按最小二乘法進行統計分析，得標準曲線為:LogT=2.986 6－0.315 8 LogC，r=－0.992 7。結果表明，內毒素濃度在 2～0.031 25 EU·mL－1時，反應時間在840～335 7 s之間，而陰性對照管反應時間大于標準曲線最低濃度的反應時間，故標準曲線成立。

2.3.2 干擾實驗及內毒素定量測定 按公式最大有效稀釋倍數(MVD)=L·C·λ1－1，L為右旋糖酐40的細菌內毒素限值(0.5 EU·mL－1)，C為1.0mL·mL－1，λ1－1為標準曲線的最低細菌內毒素濃度(0.031 25 EU·mL－1)，右旋糖酐40的最大有效稀釋倍數為16倍。

根據供試品最大稀釋倍數，分別將各樣品藥液用細菌內毒素檢查用水稀釋2，4，8，16倍，以此稀釋液作為供試液(negative product control，NPC)，同時分別將此倍數稀釋液配制成含內毒素標準品0.5 EU·mL－1的溶液，作為陽性對照(positive product control，PPC)。分別取上述溶液0.1mL加到預先加有0.1mL鱟試劑反應管內，混勻，插入細菌內毒素定量檢測儀內進行檢測，其中每一濃度重復2管。按照下式計算回收率:回收率(%)=(CPPC－CNPC)/λm×100%。CPPC為樣品陽性對照液中細菌內毒素的含量，CNPC為樣品液中細菌內毒素的含量，內毒素含量單位為EU·mL－1。λm為標準曲線中點或一個靠近中點的內毒素濃度，即0.5 EU·mL－1。當細菌內毒素的回收率在50% ～200%，則認為在此實驗條件下供試品溶液不存在干擾作用。稀釋濃度為2，4，8，16 倍時，回收率分別為24%，78%，105%，168%，取平均回收率在50% ～200%之間，且更接近于100%的稀釋倍數時所測的內毒素值作為樣品中內毒素的含量，最終選擇稀釋倍數為8倍，見表1。

2.4 右旋糖酐40的含量測定［8］

2.4.1 色譜條件 色譜柱:TSK-GEL G4000 PWXL柱(7.8mm × 300mm，10 μm);示差折光檢測器，流動相:0.71%硫酸鈉溶液;流速:0.5mL·min－1;柱溫:35℃;進樣量:20 μL。

2.4.2 對照品及供試品溶液的制備 取右旋糖酐40對照品適量精密稱定，加超純水溶解并定容，搖勻，配制成0.1 g·mL－1的右旋糖酐40對照品溶液。取每次超濾前原液和超濾后濾液適量作為供試品溶液待測。

2.4.3 測定法 精密吸取各供試液20 μL注入高效液相色譜儀中分析，計算各供試品中右旋糖酐40的峰面積。

2.5 右旋糖酐40溶液的粒徑分布檢測 原液和濾液中右旋糖酐40的粒徑分布通過馬爾文激光粒度分析儀檢測。檢測溫度為25℃，分散劑為水，激光光源的波長是633 nm，水的折射率為1.330。

2.6 結果

2.6.1 細菌內毒素限值 按公式L=K/M為人的最小發熱閾值5.0 EU·kg－1，M為1 h內最大給藥劑量10mL·kg－1。按公式L=K/M計算得右旋糖酐40的內毒素限值為 0.5 EU·mL－1［9］。

2.6.2 細菌內毒素的去除 經3種材質、3種不同截留分子量超濾膜超濾后，各樣品液中細菌內毒素的含量及細菌內毒素的去除率，見表1。

表1 超濾法去除右旋糖酐40中細菌內毒素的測定結果Tab.1 Results of removing bacterial endotoxins in dextran 40 injection by ultrafiltration

由表1可知，藥液經單一材質的PES和PVDF超濾膜超濾后，細菌內毒素的含量仍然很高，PES超濾膜內毒素去除率低于20%，PVDF超濾膜地去除率僅約36%。而藥液經復合材質的3種孔徑超濾膜超濾后，內毒素含量均大幅度降低，低于注射劑中的限值0.5 EU·mL－1，去除率達到 99%，3種孔徑的膜都能很好地去除右旋糖酐40溶液中的內毒素，有效地將熱原污染嚴重的右旋糖酐40溶液中的細菌內毒素控制在低水平，達到注射用級別。

2.6.3 右旋糖酐40的透過率 經截留分子量100，200及300 kDa的3種材質超濾膜超濾后，右旋糖酐40的透過率見表2。

表2 右旋糖酐40的透過率Tab.2 Transmittance of dextran 40

分析表2數據可知，經復合材質的分子量300 kDa超濾膜超濾后，右旋糖酐40溶液中的右旋糖酐透過率＞93%，說明該孔徑超濾膜對右旋糖酐基本無影響;但經分子量100和200 kDa該材質的超濾膜超濾后右旋糖酐損失嚴重，透過率只有54.77%和77.31%。PES和PVDF超濾膜超濾藥液后，隨著膜孔徑的增大，右旋糖酐40的透過率相應增加，孔徑增大到分子量300 kDa時，右旋糖酐40的透過率均＞91%，說明不同材質的大孔徑超濾膜對右旋糖酐40的超濾適用性較好。

2.6.4 超濾前后溶液的平均粒徑分布 右旋糖酐40原液和經分子量300 kDa復合材質超濾膜超濾后藥液的粒徑分布圖，見圖1，2。原液和濾液的粒徑均分布約在10 nm，但原液的平均粒徑為10.7 nm，超濾液平均粒徑為7.9 nm。超濾后的右旋糖酐40溶液的平均粒徑降低，分布范圍偏窄，同時結合表2中數據可知，300 kDa超濾膜處理后右旋糖酐40損失＜10%，說明超濾后的右旋糖酐40中的大分子雜質得到了較好的去除。

2.6.5 復合超濾膜耐受性 稱取適量右旋糖酐40原料，加超純水溶解至10 L，選擇膜面積為0.5 m2，截留分子量為300 kDa的復合材質超濾膜進行耐受性實驗，在操作壓力為0.2 MPa下，考察膜通量與藥液循環體積之間的相關性。結果發現，在藥液總循環藥液量達到60 L時，膜通量下降基本穩定，說明膜表面已經形成了凝膠層，見圖3。

圖1 右旋糖酐40原液粒徑分布圖Fig.1 Particle size distribution of detran 40 injection

圖2 分子量300 kDa復合材質膜超濾后濾液粒徑分布圖Fig.2 Particle size distribution of detran 40 ultrafiltrated by 300 kDa composite material membrane

圖3 分子量300 kDa復合超濾膜耐受性實驗Fig.3 Tolerance test of 300 kDa composite material membrane

3 討論

右旋糖酐40經過發酵生產，所以其注射用原料中尚存在一些分子量偏大的聚合物或雜質，筆者以超濾技術中的分子篩分分離原理對右旋糖酐40中大分子物質進行了較好的去除，且主成分損失不明顯。

在注射劑生產中常采用活性炭去除內毒素結合微濾除菌，此方法很難應對內毒素的突發性污染。本實驗用超濾法去除藥液中熱原，并比較復合材質和單一材質PES和PVDF兩種膜的超濾效果。對于糖類的大分子物質進行超濾去內毒素，單一材質的 PES和PVDF超濾膜效果較差，這可能是由于熱原在單一膜材質表面多以單分子或小分子的內毒素存在，容易通過大孔徑的超濾膜;而經截留分子量300 kDa復合材質的超濾膜聚對右旋糖酐40溶液超濾時，內毒素在膜表面容易以團聚的形式存在，并被膜孔截留，從而呈現內毒素去除率好的同時，右旋糖酐40透過率也較高。因此，采用分子量300 kDa特制的復合材質的超濾膜適于右旋糖酐40這類大分子注射劑生產中的內毒素的去除，可提升制劑質量。

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