XRCC 2和XRCC 3在大腸癌及大腸息肉中表達的臨床意義

范秀秀

XRCC 2和XRCC 3在大腸癌及大腸息肉中表達的臨床意義

范秀秀

目的 對大腸癌和大腸息肉中X射線交叉互補修復基因2（X-ray repair cross-complementing gene 2,XRCC 2）和X射線交叉互補修復基因3（XRCC 3）所編碼的蛋白檢測，探討二者在大腸癌及大腸息肉中的作用，評價其作為早期診斷和預后判斷的生物學標志的可能性。方法 選取手術切除確診為大腸癌并未做放療、化療的標本218例；選取電子結腸鏡下采集、病理證實為大腸腺瘤性息肉的標本33例，另取36例基本正常的大腸黏膜標本作為對照，通過免疫組化的方法，觀察XRCC 2、XRCC 3所編碼蛋白的表達。結果 (1)XRCC 2蛋白、XRCC 3蛋白在大腸癌的表達分別為80．28%（175/218）、74．77%（163/218），顯著高于息肉組的表達率57．58%（19/33）、54．55%（18/33）和正常黏膜組27．78%（10/36）、25%（9/36）（P＜0．05），息肉組蛋白表達顯著高于正常黏膜組，差異有統計學意義（P＜0．05），在直腸癌的表達率分別為81．74%（94/115）、79．13%（91/115），左半結腸癌的表達率分別為92．19%（59/62）、79．03%（49/62），均高于息肉組，右半結腸癌的表達率分別為62．86%（22/41）、56．10%（23/41），與息肉組差異無統計學意義；(2)癌組織中XRCC 2和XRCC 3蛋白的表達呈明顯正相關關系（P＜0．05）。結論 XRCC 2及XRCC 3蛋白表達在大腸癌、大腸腺瘤性息肉中上調，在不同的大腸癌部位有不同的影響，同時二者可能具有協同作用，因此聯合檢測XRCC 2、XRCC 3有助于診斷和預警大腸癌。

大腸癌；腺瘤性息肉；X射線交叉互補修復基因2；X射線交叉互補修復基因3

大腸癌發病率在全球各種腫瘤中居第3位。絕大部分大腸癌是由腺瘤或經過一定的腺瘤期演變而來，通過對人群進行結腸鏡篩查和高危人群的結腸鏡追蹤，以及息肉的內鏡切除，可使大腸癌的發生率下降80%，病死率下降70%[1-2]。

研究大腸癌發生和發展中DNA損傷方式和修復機制有助于腫瘤的早期診斷并采取有效的干預手段。目前國內外關于X射線交叉互補修復基因2(X-ray repair cross-complementing gene 2，XRCC 2)及X射線交叉互補修復基因3(XRCC 3)基因的研究多局限于單核苷酸多態性與腫瘤易感性之間的關系，而對大腸癌和息肉中蛋白的表達情況鮮有報道，缺乏從腺瘤→癌的系統的聯合對比性研究資料。本研究旨在通過對大腸癌和大腸息肉中兩種基因的蛋白表達情況的檢測，探討二者在大腸癌及大腸息肉中的作用，評價其作為早期診斷和預后判斷的生物學標志的可能性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取臺州市臺州醫院、溫嶺市第一人民醫院2006年1月～2010年8月手術切除確診為大腸癌并未做放療、化療的標本218例，患者男118例，女100例；年齡27～88歲，平均（62.72±8.03）歲；其中直腸癌115例，左半結腸癌62例，右半結腸41例。

選取2007年3月～2008年12月電子結腸鏡下采集、病理證實為大腸腺瘤性息肉的標本33例。另取36例因有腸道癥狀行結腸鏡檢查的基本正常的大腸黏膜標本作為對照。通過免疫組化的方法，觀察同源重組修復基因XRCC 2、XRCC 3的蛋白表達情況。分析這兩種蛋白的表達與腫瘤發病的關系。

1.2 免疫組化染色 標本經4%中性甲醛固定，常規石蠟包埋，制成4 μm連續切片，行常規蘇木精—伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)染色，選擇細胞狀態良好處，用已知染色陽性大腸癌細胞切片作陽性對照，磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS）取代一抗作陰性對照。免疫組化試劑鼠抗人XRCC 2、XRCC 3單克隆抗體，SP試劑盒二氨基聯苯胺(Diaminobenzidine，DAB)顯色劑：均購于福州邁新生物技術開發公司，為美國Zymed公司產品。按試劑說明書推薦的染色方法進行染色。

1.3 判斷標準[3]免疫組化染色后，顯微鏡下觀察切片細胞中棕黃色顆粒的出現情況。陽性表達以細胞內出現棕黃色顆粒為準計數5個高倍視野或500個細胞，按照染色強度計分：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕揭色；按陽性細胞所占百分比計分：0分為陰性，1分為陽性細胞占10%，2分為陽性細胞占11%～50%，3分為陽性細胞占51%～75%，4分為陽性細胞＞75%。染色強度與陽性細胞所占百分比計分乘積3分以上記為陽性，否則為陰性。

1.4 統計學方法 所有數據均應用軟件SPSS 13.0進行統計處理。計數資料組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 XRCC 2和XRCC 3蛋白的表達情況

2.1.1 XRCC 2和XRCC 3蛋白在大腸癌、息肉和正常大腸黏膜組織的表達 XRCC 2蛋白主要在上皮細胞質表達。該蛋白在大腸癌的表達顯著高于息肉組及正常黏膜組（P＜0.05），息肉組蛋白表達顯著高于正常黏膜組，差異有統計學意義（P＜0.05）。XRCC 3蛋白主要在上皮細胞核表達。該蛋白在大腸癌的表達顯著高于息肉組及正常黏膜組（P＜0.05），息肉組蛋白表達顯著高于正常黏膜組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表1）。

表1 癌、息肉和正常大腸黏膜組織XRCC 2和XRCC 3蛋白的表達

2.1.2 XRCC 2和XRCC 3蛋白表達與大腸癌部位之間的關系 XRCC 2蛋白的表達在直腸癌和右半結腸癌之間差異有統計學意義(P＜0.05)，直腸癌和左半結腸癌之間差異無統計學意義。XRCC 2蛋白的表達在直腸癌、左半結腸癌和右半結腸癌的表達率均高于息肉，右半結腸癌與息肉組差異無統計學意義。XRCC 3蛋白的表達在直腸癌和右半結腸癌之間差異有統計學意義(P＜0.05)，直腸癌和左半結腸癌之間差異無統計學意義。XRCC 3蛋白的表達在直腸癌、左半結腸癌的表達率高于息肉，右半結腸癌與息肉組差異無統計學意義(見表2)。

表2 XRCC 2和XRCC 3蛋白表達與大腸癌部位之間的關系

2.2 XRCC 2與XRCC 3蛋白的表達相關性 癌組織中XRCC 2和XRCC 3蛋白的表達呈明顯正相關關系（P＜0.05，見表3)。

表3 癌組織中XRCC 2與XRCC 3蛋白的表達（n）

3 討論

人類XRCC 2和XRCC 3基因是RAD 51基因的家族成員，與RAD 51基因具有20%～30%的序列同源性，兩種基因編碼的蛋白功能相似，所以又被稱為RAD 51類似體。XRCC 2和XRCC 3蛋白可以與其他幾種RAD 51類似體在細胞中形成復合物：RAD 51 B-RAD 51 C-RAD 51 D-XRCC 2異四聚體和RAD 51 D-XRCC 2、RAD 51 C-XRCC 3異二聚體，通過參與同源重組來修復DNA雙鏈斷裂（double-strand breaks，DSB）和交聯損傷，維持基因組的穩定和細胞的正常功能。XRCC 2/ XRCC 3基因的缺陷或蛋白的缺失可導致DNA雙鏈斷裂損傷修復減少，腫瘤的發生率增加。已有研究[4]證實，XRCC 2或XRCC 3基因突變的細胞中，特定部位的DNA雙鏈斷裂的同源重組修復降低25～250倍；研究顯示XRCC 3蛋白缺失誘導自發性的DSB形成并抑制乳腺癌細胞系MCF 7的增殖[5]。 XRCC 2和XRCC 3蛋白通過促進RAD 51的聚集、DNA鏈解螺旋以及單鏈交換來修復DNA損傷[6-7]。此外，有文獻報道[8]RAD 51 C-XRCC 3 復合物在同源重組晚期促進重組中間體的溶解從而發揮DNA損傷修復作用。

本研究發現，在大腸癌病例中，XRCC 2和XRCC 3蛋白的表達率分別為80.28%和75.24%，明顯高于息肉組織與正常大腸黏膜，提示二者可能與大腸癌的發生和發展有一定關系。XRCC 2和XRCC 3蛋白的表達上調可能由于癌細胞在不斷增殖、進行DNA復制的過程中產生大量的DSB，并誘導XRCC 2和XRCC 3蛋白參與的同源重組修復反應。目前國內外關于XRCC 2和XRCC 3蛋白在大腸癌中表達情況的報道較少，研究多為XRCC 2和XRCC 3基因單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)與腫瘤易感性之間的關系。目前研究認為XRCC 2基因Arg 188 His的多態可增加個體乳腺癌的發病風險。Jin等[9]對中國漢族人群進行的研究，Giuseppina等[10]對意大利南部人群進行的研究均表明，XRCC 3基因Thr 241 Met的多態增加結直腸癌的發病風險。但文獻中亦有相反結果的報道出現。我國臺灣地區進行的研究、Camilla等對挪威地區人群以及Victor等[11-13]的研究結果顯示，XRCC 3 241密碼子多態性與結直腸癌患病風險無顯著關聯。目前有關XRCC 2和XRCC 3基因單核苷酸多態性方面的研究結果存在著較大差異，可能與試驗人群、腫瘤類型及環境因素相互作用共同影響腫瘤易感性，另外，樣本大小不同也可能是造成結果存在差異的原因。

本實驗發現不同部位的大腸癌XRCC 2和XRCC 3蛋白表達情況有差異，直腸癌和左半結腸癌中兩種蛋白的表達上調，顯著高于右半結腸癌的表達率，表明兩種蛋白對直腸癌和左半結腸癌發生的關系更為密切，更具有診斷和預警意義。大多數學者[14-15]的研究結果顯示，大腸息肉及大腸癌均主要分布于直腸和乙狀結腸，并且很多解剖亦證實了這一點。孫婷等[16]報道直腸、乙狀結腸息肉癌變發生率高于其他部位，差異有統計學意義，因此直腸、乙狀結腸為息肉癌變的好發部位。本研究觀察到不同部位的大腸癌中XRCC 2和XRCC 3蛋白的表達有差異，提示兩種蛋白可能對于不同部位的大腸息肉惡變的影響不同，對于左半結腸和直腸息肉惡變的作用更大，分析其機制可能與大腸各部位的生理功能和菌群分布的不同有關。右半結腸的生理功能主要為吸收水和電解質，而左半結腸和直腸貯存和排出糞便，大腸黏膜與糞便中輔助致癌物的接觸時間及被細菌作用的時間較長，更易引起DNA損傷從而誘導修復反應。有文獻報道[17]，一些可能和產生致（促）癌物有關的膳食因素與左半結腸癌的相關性較顯著，而右半結腸癌的發生可能與膳食因素的相關性較弱，支持上述分析。XRCC 2和XRCC 3蛋白在癌組織中的表達呈明顯正相關關系，提示二者在DNA損傷的同源重組修復中可能具有協同作用。

XRCC 2與XRCC 3蛋白在大腸癌中的高表達率可能為診斷和預警大腸癌提供新的依據。但是大腸癌和大腸息肉中兩種蛋白的表達上調對于各自組織的具體作用還有待于進一步研究，例如有表達和無表達的大腸息肉惡變的機率有無差異？大腸癌中蛋白的表達是否影響放療或化療效果？對兩種蛋白的表達進行干預會有怎樣的現象出現？這些都是目前尚未研究清楚的問題，將在今后的工作中逐步進行研究和分析。

[1] Rude DR，Zdon MJ．Update on colorectal cancer[J]．Am Fam Physician,2000,61(6)：1759．

[2] Kato S，Fujii T，Koba I，et al．Assessment of colorectal lesions using magnifying colonoscopy and mucosal dye spraying：can significant lesions be distinguished?[J]．Endoscopy，2001,33(4)：306-310．

[3] 許良中，楊文濤．免疫組織化學結果的判定[J]．中國癌癥雜志，1996，6(4)：229-231．

[4] Brenneman MA,Weiss AE,Nickoloff JA,et al．XRCC 3 is required for efficient repair of chromosome breaks by homologous recombination[J]．Mutat Res,2000,459(2)：89-97．

[5] Johnson RD,Liu N,Jasin M．Mammalian XRCC 2 promotes the repair of DNA double-strand breaks by homologous recombination[J]．Nature,1999,401(6751)：397-399．

[6] Loignon M,Amrein L,Dunn M,Aloyz R．XRCC 3 depletion induces spontaneous DNA breaks and p 53-dependent cell death[J]．Cell Cycle,2007,6(5)：606-611．

[7] Takata M,Sasaki MS,Tachiiri S,et al．Chromosome instability and defective recombinational repair in knockout mutants of the five Rad 51 paralogs[J]．Mol Cell Biol,2001,21(8)：2858-2866．

[8] Brenneman MA,Wagener BM,Miller CA,et al．XRCC 3 controls the fidelity of homologous recombination：roles for XRCC 3 in late stages of recombination[J]．Mol Cell,2002,10(2)：387-395．

[9] Jin MJ,Chen K,Song L,et al．The association of the DNA repair gene XRCC 3 Thr 241 Met polymorphism with susceptibility to colorectal cancer in a Chinese population[J]．Cancer Genet Cytogenet,2005,163(1)：38-43．[10] Improta G,Sgambato A,Bianchino G,et al．Polymorphisms of the DNA repair genes XRCC 1 and XRCC 3 and risk of lung and colorectal cancer：a case-control study in a Southern Italian population[J]．Anticancer Res,2008,28(5B)：2941-2946．

[11] Yeh CC,Hsieh LL,Tang R,et al．MS-920：DNA repair gene polymorphisms,diet and colorectal cancer risk in Taiwan[J]．Cancer Lett,2005,224(2)：279-288．

[12] Skjelbred CF,Saeb? M,Wallin H,et al．Polymorphisms of the XRCC 1,XRCC 3 and XPD genes and risk of colorectal adenoma and carcinoma,in a Norwegian cohort：a case control study[J]．BMC Cancer,2006,6：67．

[13] Moreno V,Gemignani F,Landi S,et al．Polymorphisms in genes of nucleotide and base excision repair：risk and prognosis of colorectal cancer[J]．Clin Cancer Res,2006,12(7Pt1)：2101-2108．

[14] Zhang YL，Zhang ZS，Wu BP，et al．Early diagnosis for colorectalcancer in China[J]．World J Gastroenterol,2002,8(l)：21-25．

[15] Qing SH，Rao KY，Jiang HY,et al．Racial differences in the anatomical distribution of colorectal cancer：a study of differences between American and Chinese patients[J]．World J Gastroenterol,2003,9(4)：721-725．

[16] 孫婷，劉長浩，趙瑩，等．大腸息肉癌變的相關因素分析[J]．實用腫瘤學雜志,2008，22（5）：456-457．

[17] 楊工，高玉堂，季步天，等．左、右半結腸癌危險因素的回顧性研究[J]．中國醫學科學院學報，1994，16（1）：63-67．

Objective To explore the role in colorectal cancinoma and polypus by detecting the protein expression of XRCC 2, XRCC 3 , and evaluate its possibility as a biological marker for early diagnosis and prognosis. Methods Colorectal carcinoma with clear pathological diagnosis from 218 patients were collected. Immunohistochemistry was used to detect the protein expressions of XRCC 2 and XRCC 3 in carcinoma group of all the patients and in polypus group of 33 patients, normal group of 36. Results 1 the protein expression of XRCC 2, XRCC 3 of colorectal carcinoma was signif i cantly higher than polypus group and normal group (P＜0.05), the polypus group signif i cantly higher than the normal group (P＜0.05), colorectal carcinoma and the left colon carcinoma signif i cant than polypus, there were no signif i cant difference between right colon carcinoma and polypus; 2 The protein expression of XRCC 2 and XRCC 3 was positively correlated in carcinoma (P＜0.05). Conclusion The expression levels of XRCC 2 and XRCC 3 in colorectal carcinoma, polypus were up-regulated, have different effects in different parts of the colorectal carcinoma , and may have a synergistic effect, therefore it may be helpful to detect the protein expressions of both XRCC 2 and XRCC 3 for the diagnosis and predication of colorectal carcinoma.

Colorectal carcinoma; Polypus; X-ray repair cross-complementing gene 2; X-ray repair cross-complementing gene 3

10.3969/j.issn.1009-4393.2014.29.001

浙江 317500 溫嶺市第一人民醫院 (范秀秀)