刺槐苗木抗氧化保護系統對石油污染的響應

王 波，李凱榮，崔碧霄，韓 剛

（1.西北農林科技大學 資源環境學院，陜西 楊凌712100；2.西北農林科技大學 林學院，陜西 楊凌712100）

陜北已經成為我國重要的石油開采基地之一，然而石油開采、冶煉和運輸過程中的污染和泄露問題已經對當地脆弱的生態環境造成巨大威脅。石油污染可引起土壤孔隙堵塞，改變土壤有機質的組成結構和微生物區系，并對植物生長和生產力產生影響。與此同時，石油中的有害物質可在植物體內積累，并通過食物鏈對動物和人類產生危害。鑒于石油污染的上述威脅，對污染土壤進行修復已經成為一個亟待解決的環境問題。相對于其他土壤修復方法，植物修復由于具有成本低、無二次污染、吸收污染物量大、環境友好等諸多優點，逐漸成為去除土壤石油污染的首選手段[1]。然而，目前大多數針對石油污染土壤修復植物的研究僅限于考慮草本植物和農作物的生長指標或根際降解能力對土壤石油烴的去除作用，如時騰飛等[2]研究了石油污染對豆科牧草發芽和幼苗生長的潛在影響，并據此篩選出毛苕子（Viciavillosa）等適于在石油污染區播種且生長良好的灌草種，陳嫣等[3]則研究了紫花苜蓿（Medicagosativa）、披堿草（Elymusdahuricus）根際微生態效應對石油污染的去除效果。此外，尚有關于大麥（Hordeumvulgare）[4]和三葉草（Trifoliumrepens）等草本植物根系降解石油能力的眾多研究。而由于在陜北地區特別是一些老油井區普遍存在先墊土覆蓋后進行植被恢復的現象，草本植物和農作物受到根系長度限制，對地下石油污染的修復效果十分有限。在此情況下，篩選適宜在石油污染地區生長并等具有修復石油污染潛能的木本樹種是非常必要的。目前，僅有Spriggs等[5]研究了白楊（Populustomentosa）等樹種對根際土壤石油污染去除的作用，關于陜北石油污染區適生喬木樹種則少見報道，關于樹種在石油污染下的生理特征特別是抗氧化保護系統的響應研究尤為不足。

刺槐（Robiniapseudoacacia）是陜北地區植被恢復和重建的主要樹種之一，耐干旱瘠薄，在該地區表現出較強的適應性和抗逆性。而因其具有根系發達、生物量大的特點，能夠穿透覆土層對污染土壤進行修復，具有更強的吸收、降解土壤石油的潛力。對石油污染刺槐抗氧化保護系統的響應進行研究能更為深刻地反映其對石油污染的耐受能力，且較之生長指標更為靈敏[6]。據此，本研究采用盆栽試驗對不同濃度石油污染下，較長時期內刺槐苗木的抗氧化保護系統對土壤石油污染的響應特征進行研究，以期闡明石油污染下刺槐苗木抗氧化保護調節適應機制，確定其對石油污染的耐受能力，為篩選適宜陜北地區的木本石油污染修復植物提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

盆栽試驗設在陜西楊凌西北農林科技大學苗圃，當地屬暖溫帶半濕潤大陸性季風氣候，海拔454.5m，年均日照數2 150h，年均降水635mm，年平均濕度70%左右。年平均氣溫12.9℃，≥10℃年有效積溫4 169.2℃，無霜期221d。

1.2 試驗材料及處理

試驗苗木（長勢基本一致的1年生刺槐苗）及供試原油購自安塞縣。栽培基質采集自陜北安塞縣人為活動稀少的荒草地表層（0—20cm）無污染土壤，其有機質含量8.45g／kg，全氮0.42g／kg、速效磷5.5 mg／kg、速效鉀74.6mg／kg，pH 值為7.8。

于2011年2月中旬將供試土壤風干后過4mm篩，在部分土壤中分別按照石油污染物濃度為5，10，15，20g／kg共4個水平添加原油（據在安塞調查，采油區內原油污染物含量呈不均勻分布狀態，大致在5～20g／kg的范圍內，故盆栽試驗設置上述4個石油污染濃度水平），多次攪拌混合均勻（不添加任何有機溶劑），經自然平衡60d后過4mm篩備用，以無污染土壤作為對照栽培基質。

于2011年4月中旬在盆栽桶中裝入處理后的栽培基質，每桶基質相當于12.94kg無污染土壤（干重），每處理9桶。將刺槐苗木植入桶中，每桶植3株，定植后放置于可移動式防雨棚內，防止天然降雨，晴天正常照光，各處理充分供水，以保證成活和正常生長。至6月底采用稱重法將土壤水分統一控制在各處理土壤的田間持水量75%的水平。為消除苗木對稱重控水的影響，各處理均毀苗1桶測苗木鮮重，確定稱重標準。此后為隔30d均毀苗1桶測苗木鮮重，用于調校稱重標準。并分別于30，60，90d的上午9：00前后在每處理剩余栽植桶內隨機挑選5桶，并分別在內采集5份苗木中部功能葉片測定抗氧化酶活性以及抗氧化劑、H2O2和MDA含量。

1.3 指標測定

葉片中抗氧化保護系統相關指標采用下述方法測定[7]：SOD活性采用氮藍四唑光還原法，以抑制NBT光反應50%為一個酶活單位；CAT活性采用H2O2分解量法，以每分鐘OD值減少0.1為一個酶活單位；APX活性采用AsA氧化比色法，以每1min消耗1μmol的AsA為一個酶活單位；GR活性采用NADPH氧化比色法，以1min內OD340下降變化1.0為一個酶活單位；AsA含量采用H2O2消耗比色法；GSH含量采用DTNB法；Car含量采用丙酮浸提比色法測定；MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定；H2O2含量采用過氧化物－Ti復合物沉淀法測定。各指標均重復5次測定。

1.4 數據處理

應用SPSS 19.0軟件進行方差分析（one－way ANOVA），多重比較采用最小顯著差法（LSD）。

2 結果與分析

2.1 石油污染對刺槐苗木抗氧化酶活性的影響

SOD可以將超氧陰離子自由基歧化成H2O2，在保護系統中處于核心地位[8]，其活性的高低是植物抗逆性的重要標志之一。隨生長時間延長，刺槐苗木葉片SOD活性對不同濃度石油處理的響應有所變化（圖1A）：總體而言，各濃度石油污染處理30d時，刺槐苗木SOD活性均較對照顯著降低，其中石油濃度為10，15g／kg 時 降 幅 最 為 顯 著，達 51.03% ～54.28%，石油濃度為5，20g／kg時SOD活性降幅則相對較小。這可能是由于低濃度下，石油對SOD的毒性作用相對較弱，而在高濃度下則對刺槐幼苗產生強烈脅迫，刺激了SOD活性使其有所提高；隨時間延長，各石油濃度下SOD活性較對照基本無顯著差異或顯著提高，表明長期污染下刺槐苗木可對石油污染產生一定適應，從而保持正常的活性水平。

圖1 石油污染對刺槐苗木抗氧化酶的影響

CAT是專性清除 H2O2的保護酶[9]，其活性隨污染時間和石油污染濃度的變化規律與SOD有所不同（圖1B）：在不同濃度石油污染處理30d時，CAT活性均較對照顯著降低，其中10，15g／kg石油濃度時降幅最為顯著（55.08%～76.06%），這與上述SOD活性的變化規律一致，出現此現象的機理可能也與SOD活性變化的機理相似。而60d時，除5 g／kg石油濃度下CAT活性較對照增加不明顯外，其他濃度下CAT活性則均較對照顯著升高，且隨濃度增加呈遞增趨勢。至處理90d，石油濃度為5，10g／kg時，CAT活性再次顯著低于對照（降幅達31.97%～33.96%），而石油濃度為15，20g／kg時CAT 活性與對照無顯著差異。這表明在石油污染短期內，CAT活性即受到抑制，而隨時間延長，植物對脅迫環境進行適應，CAT活性逐步恢復并產生一定提高，且在較高石油濃度下，這種抗脅迫響應持續的時間更長。

APX與SOD和CAT共同構成植物的抗氧化保護系統，三者間具有協同作用[10]，但在石油污染下APX的響應規律與后兩者存在不同（圖1C）：石油污染處理30d時，刺槐苗木APX活性較對照均無顯著差異，而在60，90d時較對照顯著降低，且隨石油濃度增加，APX活性降幅趨于明顯，其中石油濃度為15～20g／kg時降幅可達57.12%～62.62%，但兩者在同期差異不顯著。表明相對于SOD和CAT，APX對短期石油污染的耐受性較高，但對長期污染的適應性較差。GR是Halliwell－Asada途徑的重要組成部分，對于葉綠體內H2O2的去除具有重要意義。石油污染處理下，刺槐苗木GR活性基本低于對照同期水平，與APX的變化趨勢相似（圖1D）：5g／kg濃度石油處理30d和60d時，GR活性較對照無顯著差異，至90d時其活性則顯著降低（降幅為37.78%），表明在污染短期至中期內，GR對較低石油污染具有一定抗性。但隨著時間延長，GR受到一定程度的破壞，在10～20g／kg石油濃度下，處理30～90d時GR活性均出現顯著降低，其中20g／kg下處理90d時降幅最顯著，表明長時間的高濃度石油污染可對GR的活性產生強烈損害。

2.2 石油污染處理下刺槐苗木抗氧化物質含量的變化

AsA是APX最重要的電子供體，缺少AsA時APX將迅速失活[11]，刺槐苗木AsA受到不同程度石油污染時其響應方式有所差異（圖2A）：各濃度石油污染處理30～60d時，AsA含量較對照均無顯著差異或顯著增加的現象（增幅達4.19%～52.59%），隨后這種趨勢減弱至不顯著的程度。至處理90d時，AsA含量在較低石油濃度下則表現為較對照顯著降低。表明在石油污染短時段內，刺槐苗木通過增加AsA以清除活性氧，但長時間污染下AsA的形成受阻，保護能力下降，這與APX活性在長期石油污染后顯著降低的現象相吻合。GSH可直接或通過Halliwell－Asada途徑間接清除H2O2，猝滅單線態氧及其他自由基，防止膜脂過氧化，并修復自由基損傷[12]。在5～15g／kg濃度石油污染下，GSH在處理30d時較對照顯著降低（圖2B），但60～90d時，其含量與對照無顯著差異，表明在上述濃度下，刺槐苗木GSH保護機制在較長時段內對石油污染產生適應；在20 g／kg石油濃度下，GSH含量對石油污染的抗性更為明顯：處理30d時，GSH含量即可保持對照水平，而在60～90d時則較對照顯著增加（增幅達24.87%～36.86%），表明在該污染濃度下，GSH保護機制的反應更加迅速，且強度更大。

圖2 石油污染對刺槐抗氧化劑的影響

Car可直接猝滅單線態氧，或間接猝滅三線態葉綠素阻止其產生，從而保護葉綠素[13]。在5g／kg濃度石油處理下，刺槐苗木Car含量在30d時與對照差異不顯著（圖2C），60d時較對照顯著提高，90d時則顯著降低；石油濃度為10～15g／kg，處理30d時Car含量變化不顯著，石油濃度達到20g／kg時則較對照顯著增加（增幅為25.92%），除石油濃度為5 g／kg處理60d時Car含量較對照顯著增加外，其他濃度石油處理60～90d時，Car含量均則較對照顯著降低（降幅達12.42%～33.98%）。上述結果表明短時段內Car對石油污染具有一定抗性，且表現出應激增加的現象，但隨脅迫時間延長，刺槐苗木Car維持能力受到明顯破壞。

2.3 石油污染處理下刺槐苗木H2O2和MDA含量的變化

脅迫環境下植物產生的活性氧往往超過其活性氧清除系統能力范圍，導致H2O2等產生積累，對蛋白質和膜結構產生破壞。除在15g／kg濃度下，60d時較對照差異不顯著外，幾乎所有石油濃度下，處理30～60d時刺槐苗木H2O2含量均較對照顯著提高（圖3A），增幅可達192.00%；處理90d時，石油濃度為5，15g／kg下H2O2含量均較對照顯著降低，而濃度為10，20g／kg下雖仍較對照顯著增加，但增幅明顯變小（46.41%～57.60%）。試驗結果表明H2O2含量對石油污染敏感，在較低污染程度下即顯著增加，且除部分處理較對照顯著降低外，在長時間內基本高出正常水平，對植物生理過程造成長期干擾，但其同時受到抗氧化保護系統的有效抑制。MDA是活性氧積累導致膜脂過氧化作用的典型產物，故常用于評價活性氧造成的膜傷害程度。本試驗中，4種石油污染程度下，處理時間為30～90d時刺槐苗木MDA含量均顯著等于或低于對照水平（圖3B）。該結果表明，盡管在石油污染下刺槐苗木體內活性氧水平有明顯提高，但在抗氧化保護系統作用下并未對膜結構造成實質性的損傷。

圖3 石油污染對刺槐苗木H2O2和MDA含量的影響

3 討論與結論

植物體在受到脅迫時，體內往往產生大量活性氧，從而導致蛋白質、生物膜發生損害。在長期進化過程中，植物形成了完備的活性氧清除系統從而對各種環境脅迫進行適應和抵抗。通常情況下，適度的逆境處理可以提高保護酶系統的活性，增強抗逆性。隨脅迫程度增加和時間延長，造成植物體活性氧產生量增加，同時降低保護酶活性和抗氧化劑含量，引發膜脂過氧化以及蛋白質、DNA等的損傷。

弓曉峰等[14]研究發現，在石油污染20d時，1%～10%濃度石油處理下，玉米SOD的活性均顯著提高，APX活性顯著下降且隨濃度增加降幅趨于明顯，MDA含量顯著提高。李春榮等[15]研究發現隨石油濃度增加，黃豆SOD活性先升后降，而MDA在高濃度下顯著增加。與上述結果相反，本試驗的結果則表明，各石油污染濃度處理30d后，除APX外其他保護酶活性基本出現顯著降低，同時MDA含量則顯著低于對照，這可能是由于植株因分解有毒物質消耗了大量的保護酶活性，而MDA產生量因毒害物質減少而降低[16]。此外，本實驗結果表明，高濃度石油污染處理30d時AsA和Car含量顯著增加，這表明短期內，盡管刺槐苗木受到石油污染影響，體內出現H2O2積累，但其抗氧化劑含量仍能維持較高水平以抵消活性氧含量的增加，降低生物膜所受到的實際傷害。且刺槐抵御活性氧脅迫的機制與玉米不同，更加傾向于維持非酶抗氧化劑的含量而非抗氧化保護酶系的活性。出現上述現象可能是由于土壤水分和氮素有效性對刺槐抗氧化保護系統的組分均具有一定的影響[17]，而石油污染對土壤水分和氮素有效性存在顯著相關性，不同程度的石油污染即可通過影響土壤氮素而間接對抗氧化保護酶和抗氧化劑產生作用。此外，石油還可能影響到刺槐苗木根系的生長狀況、體內激素水平和其他的生化代謝途徑，從而增加石油脅迫結果的復雜性。同時，考慮到不同試驗使用的石油成分存在一定的差異，其毒性物質的含量必然也有所不同，這可能是引起不同試驗間結果變異的重要原因之一。

隨處理時間延長，SOD活性在各濃度下均能維持或高于對照水平，CAT活性僅在濃度為5～10 g／kg下90d時顯著低于對照，其余則仍高于或持平于對照水平，APX和GR活性則均顯著低于同期對照水平，且隨石油濃度增加降幅顯著增大；AsA和GSH含量在中長期石油污染下仍能維持正常水平，在20g／kg下甚至顯著增加。Car含量則在石油濃度≥10g／kg下處理60～90d時，較對照顯著降低。說明在長期石油污染下，刺槐抗逆機制由單一依靠抗氧化劑清除活性氧逐漸轉變為抗氧化保護酶與抗氧化劑協同作用，其中SOD對石油脅迫的適應能力最強，CAT活性以及AsA和GSH對脅迫的適應能力相對較弱，但在各濃度石油持續處理下仍可維持較高水平，這可能是由于H2O2積累對上述抗氧化保護物質產生了一定的誘導。而APX、GR活性和Car則在長期石油污染處理下遭到嚴重破壞，其降低程度與石油濃度正相關。這可能與不同酶和抗氧化保護物質本身的特性有關，其機理有待進一步的研究。另外，刺槐苗木各時期的生理指標受影響的程度很少呈現明顯的濃度—指標響應關系（同期高濃度石油污染并未造成更明顯脅迫），這可能是由于石油濃度增加的同時，其中主要毒性成分的積累越過了刺槐苗木的耐受閾值，而在多種毒性成分綜合作用下產生復雜的脅迫現象。此外，石油長期污染下其中間代謝產物的作用也對其脅迫效果產生影響[17]，其機理也尚需進一步的研究闡釋。

盡管在5～20g／kg石油脅迫下刺槐苗木體內H2O2產生量顯著增加，但膜脂過氧化產物MDA在5～20g／kg濃度下始終維持在或者顯著低于同期對照水平，這與岳冰冰等[18]的研究結果相似，表明在抗氧化保護系統在較高濃度石油污染下能快速做出響應，使活性氧造成的膜損傷顯著降低。試驗結果表明，刺槐苗木抗氧化保護系統對20g／kg以內的石油脅迫具有較強且長期的抗逆響應。

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