胰腺導管腺癌細胞系研究進展

楊建宇 孫勇偉 花榮

胰腺癌約占全身所有惡性腫瘤的2%，它是一種惡性程度極高，早期難以診斷，預后極差的惡性腫瘤，其中超過90%的類型為導管腺癌(PDAC)[1]。胰腺癌細胞系是用于了解胰腺癌生物學特征，闡明其發生、發展規律并尋找有效診治方法的重要實驗材料。自Dobrynin等[2]1963年建立了第一個胰腺癌細胞系CAPA以來，美國、日本、中國、德國及以色列等國的科學家已相繼建立了近百個人胰腺癌細胞系供科研使用，其中大多數為PDAC細胞系。本文就PDAC細胞系的建立及其在胰腺癌研究方面取得的一些進展做一綜述。

一、PDAC細胞系的建立

1．PDAC細胞系建立方法：PDAC細胞系的建立方法主要包括：(1)常規原代培養法：常規建系是經剪切分離法、機械分散法或消化分離法將人或動物的胰腺腫瘤組織塊制備成單細胞懸液，原代培養后經傳代獲得。新鮮瘤組織接種于裸鼠成瘤后取材培養更易建系。北京協和醫院病理科從一57歲女性胰頭中分化腺癌的標本中取材后經剪切分離法培養得到了PC-3細胞系[3]。Liu等[4]將人胰腺癌手術標本直接移植于裸小鼠胰腺內，通過腫瘤異體移植和連續傳代成功獲得能產生大量癌胚抗原(CEA)的PTNMP-2 PDAC細胞系。(2)化學物質誘導法：Chen等[5]利用阿霉素(ADM)體外濃度梯度倍增法誘導培養人胰腺癌細胞株SW1990得到耐藥細胞株SW1990/ ADM。SW1990/ADM形態學上發生了明顯的改變，其倍增時間延長以及對4種化療藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)、吉西他濱、ADM及絲裂霉素(MMC)均顯示出一定的耐藥性,尤以對ADM和MMC最為明顯。Guo等[6]利用相似的方法建立了SW1990/ FU細胞系。

2．目前已建立細胞系及其特點：目前特征明確、廣泛使用的PDAC細胞系有PANC1、SW1990、SUIT-4、AsPC-1、PK-1、HPAC、CFPAC-1、PL-45、PaCa5061等(表1)。國內建立較早并且廣泛使用的為北京協和醫院病理科于1992年建立的PC-3細胞系[3]。研究顯示雖然有些細胞系已經連續培養使用了近40年，但長時間的培養傳代不會導致其基因結構與親本腫瘤基因產生明顯差異[7]。

PANC1、PK-9、JoPaca-1、PC-3、BxPC-3、PL45、HPAC、MIA PaCa-2、KMP-4、PP109及PaCaDD-43細胞系建自胰腺癌患者原發灶。JF305細胞系建自裸鼠移植瘤。CFPAC-1，SUIT-2，RWP-1，RWP-2，PK-1、-8、-12，CaPan-1和KMP-1、-2、-5、-6細胞系建自胰腺癌患者肝轉移灶。SW1990細胞系建自胰腺癌患者脾臟轉移灶，KMP-3和PaCaDD-135細胞系建自胰腺癌患者的轉移淋巴結。而HPAF-Ⅱ、AsPC-1及SUIT-4細胞系建自患者癌性腹水，p34、MZ-PC-1和PaCaDD-60細胞系建自癌性胸水。

PDAC細胞系染色體數目多為非整倍體，如PaCa5061、p34、PANC1為超三倍體，CFPAC-1為超二倍體，MIAPaCa-2為亞三倍體，CaPan-2為假三倍體。胰腺癌細胞系中最顯著的染色體異常為8號染色體的改變[8]。Sato等[9]曾報道8號染色體的異常與惡性腫瘤的生長及侵襲性相關。此外某些細胞系還包含特異性的染色體異常，如SW1990及SUIT-4細胞系Y染色體的缺失[10-11]，p34細胞系中2號染色體短臂的缺失[8]。胰腺癌有獨特的基因特征：K-ras基因突變概率超過95%，p16突變率幾乎為100%[12]，p53及DPC4的突變率都超過50%，DPC4基因失活的概率大約為50%[13](表2)。某些細胞系還有其獨特的基因表達，PaCa5061最突出的過表達基因為Mucin 4和癌胚抗原家族相關分子CEACAM-1、CEACAM-5和CEACAM-6[14]；CFPAC-1表達囊性纖維化基因(CF)[15]；SUIT-4表達某些金屬蛋白酶(MMP)基因和金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)基因[11]；HPAC則為第一個被報道的具有表達功能性糖皮質激素受體的人胰腺癌細胞系[16]。

雖然胰腺癌的侵襲轉移能力很強，但有報道顯示僅有5個細胞系(CaPan-1、SUIT-2、PCT-1、SUIT-4 和 PaCa5061)會在裸鼠體內自發轉移到區域淋巴結、肺或腹部器官。其中SUIT-4和PaCa5061可轉移到肺組織，PaCa5061具有高侵襲性可以在75%的實驗動物體內發生轉移[11,14]。Luo等[17]于2012年建立了國內首個在裸鼠體內具有高侵襲性、高淋巴轉移能力的BxPC-3-LN細胞系。CaPan-1、CaPan-2、CFPAC及MPanc96對人有神經侵襲性，其中具有高神經侵襲性的CaPan-1和CaPan-2對小鼠也顯示有神經侵襲性。具有低神經侵襲性的HPAF-Ⅱ、AsPC-1及PANC1在人和小鼠身上都沒有發現有神經侵襲性[18]。

表1 常見國內外已建立的PDAC細胞系

表2 胰腺癌基因改變

從PDAC細胞系產物上來看，絕大部分的細胞系都會產生CA19-9及CEA等腫瘤標記物。SUIT-2細胞系是第一個被報道的分泌CA19-9的人胰腺癌細胞系[19]。到目前為止，在所有報道的PDAC細胞系中SUIT-4的CA19-9的表達量最高。有報道顯示腫瘤的體積與血清中的CA19-9水平呈正相關性[11]。此外，KMP細胞系會分泌鱗狀細胞癌抗原(SCC)及細胞角蛋白19片段，CaPan-1可分泌胃型黏蛋白。一般來說，胰腺導管來源的腫瘤不產生胰腺相關酶類，如在SW1990、MIAPaCa-2和PANC1，而COLO357細胞系可產生胰淀粉酶、胰蛋白酶及糜蛋白酶，PK-8和PK-9細胞系也會產生胰蛋白酶。

二、胰腺癌細胞系的用途

1．分子生物學研究：胰腺癌細胞系K-ras基因的突變幾乎都局限在12密碼子上，如SUIT-4、PANC1、KP-3、PaCa-2、BxPC-3、KP-2、AsPC-1和SUIT-2。而其中最常見的為發生在第2位置上由GGT到GAT的突變。PDAC中所有p53的突變均為點突變。到目前為止，胰腺癌細胞系的表現型與其基因突變并無明確關系。有研究表明K-ras基因突變是PDAC發生中的早期事件，而p53基因突變則代表了導管惡性腫瘤進展中從低等級發展到高等級的過程[20]，p53基因的狀態還與胰腺癌體內轉移行為相關[21]。但也有研究表明K-ras、p53、p16及MADH4基因的突變狀態與胰腺癌細胞的分化及生物學行為并無關系[22-23]。

細胞因子具有廣泛調節功能，它不僅作用于免疫系統、神經內分泌等系統，還在腫瘤的發生、浸潤轉移、凋亡過程中起著重要作用。鄭正榮等[24]發現趨化因子配體16(CXCL16) 可誘導胰腺癌細胞系PANC1和AsPC-1增強對基質的粘附性、侵襲性和遷移性，并協同癌的發展。Zhang等[25]發現表皮生長因子(EGF)通過活化核因子-κB(NF-κB)促進胰腺癌細胞的尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)表達和侵襲力，采用NF-κB抑制劑阻斷NF-κB通路有利于胰腺癌的綜合治療。此外，學者們還對轉化生長因子-β(TGF-β)、β-神經生長因子(β-NGF)、膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)等細胞因子進行了大量研究，希望能在未來胰腺癌綜合治療中找到更有效的方法。

2．腫瘤轉移性及侵襲性研究：Kawano等[11]從胰腺癌患者腹水中建立了SUIT-4細胞系，并發現它是少數幾個可以自發在裸鼠體內轉移至區域淋巴結、肺臟及腹部器官的細胞系。同時發現MMP尤其是MMP-1在癌轉移過程中起著重要的作用。腫瘤細胞微環境中的信號物質對腫瘤細胞侵襲能力的影響備受關注，這些信號物質包括兩類：趨化因子和神經遞質。郭坤等[26]通過逆轉錄-聚合酶鏈反應以及Transwell侵襲實驗等方法研究發現經典神經遞質——去甲腎上腺素通過β受體介導上調MMP-2、MMP-9和VEGF的表達而增強胰腺癌細胞的侵襲能力。Eppinga等[27]通過對BxPC-3中動力蛋白2(Dyn2)的研究發現，磷酸化Dyn2的高水平表達通過增加細胞板狀偽足的生成增強了細胞的侵襲能力。De Oliveira等[28]通過對T3M4、Su8686及PANC1胰腺癌細胞系中SDC-2基因表達及其與K-ras基因關系發現，SDC-2是一個新的神經侵襲相關基因，并與K-ras協同誘導胰腺癌侵襲性的增強。

3．胰腺癌治療的研究：隨著癌基因、抑癌基因、細胞因子研究的深入及分子生物學研究手段的進步，基因治療已向傳統的腫瘤治療方法提出挑戰并日益體現出其活力。Satoh等[29]通過研究PANC1等胰腺癌細胞系與正常胰腺細胞中MSX2基因的差異表達發現其可以增強PDAC的惡性程度及其侵襲性，因此MSX2基因可應用于PDAC早期診斷及基因靶向治療。Huang等[30]應用RNA干擾技術通過沉默PANC1中OCT4基因表達，證明了OCT4基因可抑制PANC1細胞增殖并誘導其凋亡。王葆春等[31]將合成的信號轉導與轉錄因子3(STAT3)siRNA轉染SW1990細胞，通過檢測轉染前后STAT3mRNA及蛋白的表達變化發現STAT3siRNA能特異性地阻斷胰腺癌細胞中STAT3信號的活化，并進一步通過下調MMP-2和MMP-9的表達從而抑制胰腺癌細胞的侵襲能力。近年來研究者對USP9X、GFP-TRAIL、ACVR1B、MDR1、PTEN、KAI1、Bad等大量胰腺癌表達基因進行了深入的研究，相信未來在胰腺癌基因診斷及治療方面會取得更多、更有臨床意義的成果。

目前用于胰腺癌化療的經典化療藥物有5-FU、吉西他濱、順鉑等，臨床實踐中發現胰腺癌治療在過去10年中并未有大的提高，其主要原因在于胰腺癌對化療的耐受。胰腺癌主要耐藥機制包括胰腺癌個別基因及信號通路的改變、微環境的改變和高耐受干細胞的存在。Chen等[5]報道，SW1990/ADM耐藥性與多藥耐藥基因mdr1的mRNA表達上調呈正相關。Hong等[32]研究發現，Nrf2基因在PANC1、AsPC-1等胰腺癌細胞系及胰腺癌組織中高表達，并在胰腺癌耐藥性中起重要作用，敲除該基因后AsPC-1等細胞系對藥物更敏感。

除手術外，放射治療是目前治療胰腺癌、預防術后復發、延長患者生存時間和提高生活質量的重要手段之一，但不同患者放療療效不一。吳巍巍等[33]使用6MV X線照射SW1990、CaPan-1、AsPC-1、MIAPaCa-2、PANC1、P3等6株胰腺癌細胞系后計算其存活分數，結果顯示，胰腺癌細胞系MIAPaCa-2對放射治療最敏感，CaPan-1對放射治療最不敏感，而其他細胞系的放射敏感性無顯著差異，從而為胰腺癌臨床放療的個體化提供了有效的參考。最近有研究發現MEK抑制劑可增強AsPC-1、MIAPaCa-2、PANC1等胰腺癌細胞系對輻射的敏感性，聯合Akt抑制劑效果更好[34]，這將有助于提高胰腺癌患者放療療效。

4．其他方面研究：微小RNA(microRNA,miRNA)是一類高度保守的非編碼RNA，在轉錄后水平調控基因表達，近年來研究發現其在PDAC診斷、治療和預后評估中有重要作用。Szafranska等[35]通過對胰腺癌組織及6株胰腺癌細胞系miRNA表達譜的檢測發現miR-196特異性表達于PDAC，可作為潛在的檢測腫瘤標志物。Hwang等[36]發現低表達miR-21的BxPC3、HPAF-Ⅱ、HPAC、PANC1及PL45 PDAC細胞系對吉西他濱更敏感，因此miR-21可能成為一個潛在的治療靶點。Laurials等[37]發現上調或下調低表達胰腺癌細胞系或高表達胰腺癌細胞系中的miR-31均可抑制腫瘤的增生轉移及侵襲。

綜上所述，由于胰腺癌細胞系具有各自的特殊結構及不同的生物學特性，因而對于研究胰腺癌的病因、發病機制及診斷治療具有特殊意義。隨著時代的發展，胰腺癌的發生及發展不可避免地受到了更多因素的影響，人們對它的認識也在逐步深入。胰腺癌的基礎研究在很大程度上依賴于胰腺癌細胞系，建立更多在基因改變、耐藥性等方面具有自身特點的細胞系有利于對胰腺癌進行更加深入的研究。

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