STAT3基因沉默對人胰腺癌SW1990細胞的裸鼠移植瘤生長的影響

徐向輝 盛金鑫 張坤東 黃陳

信號轉導與轉錄激活因子3(signal transduction and activators of transcription, STAT3)是細胞內一關鍵的信號轉導與轉錄激活蛋白，當其上游Janus激酶被細胞因子或生長因子激活后，進而激活STAT3，形成磷酸化STAT3(p-STAT3)，2個p-STAT3分子相互作用形成二聚體進入細胞核，通過調控腫瘤細胞的增殖、凋亡、血管新生等參與腫瘤的進展，目前已經被定義為癌基因[1-2]。研究證實，STAT3和p-STAT3在胰腺癌組織中過表達，且p-STAT3與血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達及微血管密度(microvessel density，MVD)相關[3-4]，提示STAT3的激活在胰腺癌血管生成中起重要作用。本研究采用RNA干擾技術抑制SW1990細胞STAT3基因的表達，觀察基因沉默后對細胞增殖及裸鼠移植性胰腺癌生長的影響，探討其相關機制。

材料與方法

一、STAT3 shRNA表達載體的構建及細胞轉染

參考Genscript公司設計siRNA的在線軟件，選取針對STAT3編碼區1819～1837、1025～1043、237～255三段堿基序列作為RNA干擾靶序列，將其插入pRNAT-U6.1/Neo質粒中，構建重組質粒pRNAT-STAT3 shRNA-Ⅰ、pRNAT-STAT3 shRNA-Ⅱ和pRNAT-STAT3 shRNA-Ⅲ，并同時設計陰性對照序列，構建陰性對照重組質粒pRNAT-Con。前期研究證明pRNAT-STAT3 shRNA-Ⅱ對STAT3具有最好的沉默效果[5]，因此本研究選取pRNAT-STAT3 shRNA-Ⅱ穩定轉染細胞。人胰腺癌細胞株SW1990購自ATCC(American Type Culture Collection)，常規培養、傳代。取對數生長期SW1990細胞，以每孔2×105個接種于6孔培養板中，按照Invitrogen公司說明書配制質粒-脂質體復合物，并轉染細胞。應用G418(500 μg/ml)篩選穩轉細胞株。實驗分為SW1990組、SW1990-Con組和SW1990-RNAi組。

二、蛋白質印跡法

取各組對數生長期細胞，采用Santa Cruz公司的細胞總蛋白抽提試劑盒和Active Motif公司的細胞核蛋白抽提試劑盒分別提取各組細胞的總蛋白和核蛋白。采用常規蛋白質印跡法檢測細胞的STAT3、VEGF、基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2, MMP-2)蛋白的表達，以β-actin為內參。兔抗人STAT3、VEGF、MMP-2多抗分別購自Cell Signal公司及Santa Cruz公司，工作濃度均為1∶1000；羊抗兔辣根過氧化物酶耦聯二抗購自Santa Cruz公司，工作濃度1∶5000。最后ECL(Santa Cruz公司)發光，X線曝光。以BAND SCAN圖像分析軟件掃描灰度值，目的條帶與β-actin條帶的灰度比值表示蛋白相對表達量。

三、裸鼠皮下移植瘤模型建立

BALB/c nu/nu裸鼠購自中國科學院上海實驗動物中心，飼養于SPF級環境中。按完全隨機法分為SW1990組、SW1990-Con組、SW1990-RNAi組，每組6只。于裸鼠右側背部皮下組織分別注射100 μl(1×108/ml)SW1990細胞、SW1990-Con細胞、SW1990-RNAi細胞。飼養35 d后處死裸鼠，取腫瘤稱重，用10%甲醛固定。

四、移植瘤MVD測定

取固定的移植瘤組織，采用免疫組織化學染色法檢測移植瘤組織CD34的表達，以PBS代替一抗作為空白對照。參照Maeda等[6]方法計算MVD，即先在低倍鏡(10×10)下尋找微血管最密集的區域，然后于高倍鏡(10×40)下取5個視野觀察，以CD34陽性的單個血管內皮細胞或血管內皮細胞叢作為一個可以計數的微血管，分別計數每個視野的微血管數，取均值。

五、統計學處理

結 果

一、各組SW1990細胞STAT3、VEGF、MMP-2蛋白的表達

SW1990組、SW1990-Con組、SW1990-RNAi組細胞的STAT3蛋白表達量分別為84.69±9.31、82.00±7.76、7.93±1.24(圖1)，VEGF蛋白表達量分別為82.94±8.97、80.86±10.28、39.04±6.23，MMP-2蛋白表達量分別為40.88±5.09、38.26±5.71、12.54±2.15。SW1990-RNAi組細胞的表達量均顯著低于SW1990組(F分別為115.094、24.547、35.014，P值均<0.05)，而SW1990-Con組與SW1990組間細胞的3種蛋白表達量的差異均無統計學意義。

圖1 SW1990組(1)、SW1990-Con組(2)、SW1990-RNAi組(3)細胞STAT3蛋白的表達

二、各組裸鼠移植瘤的生長

注射SW1990、SW1990-Con細胞的裸鼠背部移植瘤體積較大，而注射SW1990-RNAi細胞的裸鼠移植瘤體積較小(圖2)，3組移植瘤的重量分別為(2.2±0.4)、(2.2±0.3)、(0.5±0.3)g，SW1990-RNAi組的瘤重顯著低于SW1990組和SW1990-Con組，差異有統計學意義(P<0.05)，而SW1990組與SW1990-Con組間的差異無統計學意義。此外，SW1990組和SW1990-Con組的腫瘤血供豐富、質脆，而SW1990-RNAi組的腫瘤血管稀少，并有明顯纖維化形成。

圖2 SW1990組(1)、SW1990-Con組(2)、SW1990-RNAi組(3)裸鼠的移植瘤標本

三、各組裸鼠移植瘤的MVD

SW1990組、SW1990-Con組、SW1990-RNAi組移植瘤的MVD分別為每高倍視野(20.35±2.41)、(18.79±1.94)、(9.62±1.06)個(圖3)，SW1990-RNAi組顯著少于其他兩組，差異有統計學意義(F=25.299，P<0.01)，而其他兩組間的差異無統計學意義。

圖3 SW1990組(a)、SW1990-Con組(b)、SW1990-RNAi組(c)移植瘤的MVD(免疫組化 ×100)

討 論

研究表明，STAT3在多種腫瘤組織與細胞系中異常表達和激活，并與腫瘤的增殖分化、細胞凋亡、血管生成、侵襲轉移和免疫逃逸密切相關[1-2]。

血管生成是一個多步驟的復雜過程，包括血管內皮細胞增殖、血管外基質降解、內皮細胞遷移及形成管腔等一系列過程[7]。腫瘤血管生成是腫瘤細胞生長和轉移的基礎，沒有營養血管的支持，腫瘤直徑一般不會超過2 mm[8]。腫瘤MVD是衡量腫瘤血管生成程度的標志，大量研究表明MVD是反映腫瘤預后的一個獨立因素，高MVD往往提示預后不良或復發轉移。

血管生成過程受許多細胞因子的調控，其中VEGF是目前已知最重要的促血管生成因子，調控著包括內皮細胞增殖、遷移、管腔形成等重要環節[9]。有研究報道，VEGF是血管內皮細胞強有力和特有的有絲分裂原，與胰腺癌的血管新生和預后密切相關[10]。Niu等[11]證實VEGF是STAT3的下游靶基因，并發現反義寡核苷酸阻斷腫瘤細胞中STAT3的信號轉導可下調VEGF的表達，抑制腫瘤新生血管形成。

在腫瘤的血管形成過程中，血管外基質降解、內皮細胞遷移亦起著重要作用。蛋白水解酶通過降解細胞外基質和基底膜，促進內皮細胞遷移，在腫瘤的血管形成中起著重要作用。MMP-2是蛋白水解酶的一種，與胰腺癌的血管形成和侵襲轉移密切相關[12]。Xie等[13]證實MMP-2是STAT3下游靶基因，并發現STAT3可調控惡性黑色素瘤細胞中MMP-2表達，促進惡性黑色素瘤的血管形成和侵襲轉移。

本研究應用RNAi技術抑制SW1990細胞的STAT3基因表達，并建立穩轉的SW1990細胞株和裸鼠移植瘤模型。結果顯示，SW1990細胞的STAT3表達被抑制后，細胞的VEGF和MMP-2表達下調，形成的裸鼠移植瘤的血管生成減少，瘤組織的MVD降低。提示STAT3信號通路在胰腺癌發生、發展中起著重要作用，沉默STAT3基因表達后能明顯降低裸鼠移植瘤的生長，其機制可能通過下調VEGF及MMP-2的表達、抑制腫瘤血管生成所致。

參 考 文 獻

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