STAT3基因沉默對胰腺癌細胞株的增殖及對吉西他濱敏感性的影響

潘雪 Thiruvengadam Arumugam Vijaya Ramachandran Craig D Logsdon

吉西他濱目前仍代表著胰腺癌化療的標準傳統方案。然而由于其內源耐藥性導致其臨床效用一般，因此一系列體外實驗嘗試檢測吉西他濱耐藥的分子指標。越來越多的證據顯示，信號轉導與轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)在惡性腫瘤的轉化中起著重要作用[1-3]。STAT蛋白是細胞內信號轉導因子家庭的一員，轉導細胞外信號，激活酪氨酸蛋白激酶(JAKs)和酪氨酸激酶受體，而它們又反過來進一步激活STATs。激活的STATs移位至細胞核,從而調節基因轉錄[4]。文獻報道[5]，STAT3在白血病、淋巴瘤、乳腺癌和前列腺癌中表達，抑制STAT3活性可下調它的靶基因Bcl-XL、c-myc和cyclin D1等的表達，誘導腫瘤細胞凋亡。本研究應用RNA干擾技術沉默STAT3基因表達，探討STAT3基因在胰腺癌細胞株對吉西他濱耐藥機制中的作用。

材料和方法

一、材料

人胰腺癌細胞株BxPC3、L3.6pl、CFPAC-1、MPanc-96、PANC1和MiaPaCa-2均購自美國ATCC(American Type Culture Collection)，人胰腺癌上皮細胞(HPDE)由加拿大多倫多大學Tsao博士友情饋贈。除BxPC3在RPMI液中培養外，其他胰腺癌細胞株均在含10%胎牛血清的DMEM液中培養。HPDE細胞在含角質形成細胞的無血清培養液中培養。靶向STAT3的siRNA(siSTAT3)購自Dharmacon Res公司，陰性對照siRNA(siNC)購自Ambion公司。Hiperfect 轉染試劑購自Qiagen公司。細胞增殖試劑盒購自Promega公司。

二、方法

1．STAT3活性檢測：將癌細胞接種于96孔板，應用前期構建的STAT3熒光素慢病毒、對照的海腎螢光素酶慢病毒感染細胞[6]，獲得穩定轉染的帶熒光素報告基因的胰腺癌細胞株。將感染細胞接種于96孔板，待細胞生長至70%融合后，收集細胞裂解液，應用雙螢光報告基因試劑盒(Promega公司)定量檢測STAT3及磷酸化STAT3(pSTAT3)的活性。

2．STAT3 基因表達沉默實驗：取對數生長期細胞接種于6孔板或96孔板，待細胞長至50%融合時，應用Hiperfect轉染試劑將siSTAT3或siNC分別轉染癌細胞，在不含抗生素的無血清培養液中孵育48 h，采用蛋白質印跡法確認基因沉默效果。

3．細胞增殖實驗：取轉染的細胞孵育24 h，加入10 μmol/L的吉西他濱(耐藥株)或1 μmol/L的吉西他濱(敏感株)繼續培養48 h，應用MTS試劑(Promega公司)檢測細胞增殖，以未用吉西他濱處理的細胞數為100%，計算生長抑制率。

4．細胞凋亡檢測：取轉染siSTAT3或siNC的培養24 h的對數生長期細胞，加入上述濃度吉西他濱后繼續孵育72 h，收集細胞，用冷PBS洗滌，應用低張液(0.1% sodium citrate, 0.1% Triton X-100，20 mg/ml RNase，50 mg/ml propidium iodide)孵育30 min，上流式細胞儀EPICS-XO(Beckman Coulter)檢測細胞凋亡。

5．蛋白質印跡法：收集轉染的胰腺癌細胞，提取蛋白，常規行蛋白質印跡法檢測細胞STAT3和pSTAT3(Tyr705)的表達，以β-actin為內參。兔抗人一抗購自Cell Signaling Technology Inc，工作濃度1∶250，熒光標記的羊抗兔二抗IRDye 680購自Santa Cruz Biotech公司，工作濃度1∶100。最后通過Odyssey紅外熒光成像儀(Li-Cor Biosciences, Lincoln, Nebraska)檢測。

三、統計學處理

結 果

一、胰腺癌細胞株STAT3表達水平及其與吉西他濱耐藥性的相關性

根據本研究組以前的研究報道[6]，PANC1、MPanc96、MiaPaCa細胞株為吉西他濱耐藥菌株，BxPC3、CFPAC-1、L3.6pl細胞株為吉西他濱敏感細胞株。6株胰腺癌細胞株STAT3及pSTAT3蛋白表達量均顯著高于HPDE細胞，但胰腺癌細胞的表達量與其對吉西他濱耐藥性無明顯相關(圖1)。

圖1 人胰腺癌細胞株和HPDE細胞STAT3、pSTAT3蛋白表達

二、siRNA轉染后胰腺癌細胞的沉默效果

轉染siSTAT3的BxPC3、CFPAC、L3.6pl、PANC1、MPanc96、MiaPaCa細胞STAT3蛋白的表達均較轉染siNC的相應細胞顯著下調(圖2，表1)。

圖2 轉染細胞的STAT3 蛋白表達

三、STAT3基因沉默對胰腺癌細胞增殖、凋亡及與吉西他濱耐藥的影響

STAT3基因表達沉默后各胰腺癌細胞的增殖、凋亡均未受影響。但STAT3基因沉默可以增加所有6株細胞對吉西他濱的敏感性，吉西他濱的殺傷效應增加了10%～15%(圖3)。

表1 轉染細胞的STAT3蛋白表達量

圖3 吉西他濱對轉染siSTAT3、siNC細胞的增殖(1～6)及凋亡(7～8)的影響

討 論

腫瘤化療中一個關鍵問題是腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性。目前明確的是化療主要是通過上調凋亡、衰老或有絲分裂來誘導細胞周期阻滯或死亡。因為STAT3能夠誘導存活蛋白(Survival protein)表達、防止細胞周期阻滯或衰老的發生，因此，推測這種信號途徑不僅參與細胞轉化過程，而且也可能參與其內源性耐藥機制。有研究認為[7-9]，STAT3也許同內源性耐藥性有關。

很多胰腺癌患者對聯合化療效果較差的原因主要是胰腺癌細胞存在內源性的化療藥物耐藥性。在腫瘤細胞中STAT3被認為是通過抑制凋亡來產生化療藥物耐藥性的。一些研究證明，應用Jak2激酶抑制劑AG490抑制STAT3活性均可導致細胞凋亡發生[10-11]。本研究結果顯示，STAT3基因沉默的胰腺癌細胞株，不管是對吉西他濱敏感株還是對耐藥菌株，其增殖并未受到影響，但其對吉西他濱的敏感性均有不同程度的增加，提示阻滯STAT3信號途徑可能會逆轉內源性的藥物耐藥性。

參 考 文 獻

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