陰離子型胰蛋白酶原基因G191R突變與胰腺炎發(fā)病的關(guān)系

李璐 丁輝 楊玉秀 韓雙印 王春榮

胰腺炎(pancreatitis)是由于各種因素刺激導(dǎo)致胰腺分泌多種消化溶解酶，引起胰腺及周圍組織“自身消化”的炎癥病變。急性胰腺炎(AP)以胰腺局部炎癥反應(yīng)為主要特征[1]，慢性胰腺炎(CP)以胰腺實質(zhì)發(fā)生慢性持續(xù)性炎性損害、纖維化及可能導(dǎo)致的胰管擴張、胰管結(jié)石或鈣化等不可逆的形態(tài)改變?yōu)樘卣鱗2]。目前胰腺炎的分子生物學(xué)機制尚未明確，近年來的研究表明多種基因可能參與胰腺炎的發(fā)生[3]。國外已有學(xué)者證實，陰離子型胰蛋白酶原(anionic trypsinogen，PRSS2)基因的G191R突變可以降低CP的易感性，具有保護(hù)作用[4-5]，但國內(nèi)尚無相關(guān)報道。本研究采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)及DNA測序等技術(shù)分析胰腺炎患者PRSS2基因G191R突變情況，探討其與胰腺炎發(fā)生的關(guān)系。

材料與方法

一、材料

研究對象為2010年5月至2012年12月鄭州大學(xué)人民醫(yī)院明確診斷的155例AP、CP的住院患者，診斷均符合《中國急性胰腺炎診治指南(草案)》[1]及《慢性胰腺炎診治指南》[6]的標(biāo)準(zhǔn)，同時隨機選擇138例無親緣關(guān)系的健康體檢者作為正常對照。155例中AP 82例，其中男性46例，女性36例，年齡36～57歲，平均51歲；CP 73例，其中男性44例，女性29例，年齡38～60歲，平均50歲。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者及體檢者均簽署知情同意書。

二、方法

1．DNA抽提：采用NaI提取法抽提外周血白細(xì)胞基因組DNA。取空腹外周血100 μl (EDTA抗凝)，加入Ep管中，10 000 r/min離心3 min，棄上清；加雙蒸水200 μl，混勻后加6 mol/L NaI 200 μl，漩渦振蕩20 s，加氯仿-異戊醇(24∶1)400 μl，混勻20 s，12 000 r/min離心12 min，上清移入新Ep管，加入0.6倍體積異丙醇，混勻后室溫放置15 min，15 000 r/min離心12 min，加入70%乙醇1 ml，15 000 r/min離心12 min，棄乙醇，沉淀干燥后，加入1×TE緩沖液30 μl溶解DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2．巢式PCR：根據(jù)7號染色體(7p35)的基因組序列，選擇PRSS2基因第4外顯子前后的序列設(shè)計PRSS2基因G191R突變位點的第一次PCR擴增的引物，PRSS2e4-F1為5′-ATGGAGAACTTGCTATGATC-3′，PRSS2e4-R1為5′-GGTGTAGACTCCAGGCCTGT-3′。反應(yīng)體積50 μl，其中模板DNA 50 ng，引物各20 pmo，dNTP 0.2 mmol/L，10×PCR緩沖液5 μl，Tap DNA酶2.0 U(Promega公司)。反應(yīng)條件：95℃ 5 min，94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s，35個循環(huán)，72℃ 7 min。首次PCR產(chǎn)物經(jīng)1∶200稀釋后取2μl作為模板進(jìn)行第二次PCR。二次PCR反應(yīng)的引物PRSS2e4-F2為5′-TTCCTGATCCTCACAGCCGA-3′，PRSS2e4-R2為5′-GACAAGTTGTATGAAGAGA G-3′。PCR反應(yīng)體積和反應(yīng)條件同首次PCR。

3．RFLP：反應(yīng)體積20 μl，其中PCR產(chǎn)物6 μl，10×酶切緩沖液2 μl，Hpy188Ⅲ內(nèi)切酶1U(NEB公司)，BSA 0.2 μl，無菌水11.8 μl。混勻后置37℃酶切產(chǎn)物 6 h，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離，攝片觀察。

4．基因測序：第二次PCR產(chǎn)物用凝膠DNA回收試劑盒(Qiangen公司)回收、純化，送上海生工生物技術(shù)有限公司測序。測序引物為PRSS2e4-F2。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、PCR-RFLP

經(jīng)二次PCR擴增出的野生型PRSS2基因片段為436 bp。G191R雜合性突變是使571位堿基由G→A，它可被限制性內(nèi)切酶Hpy188Ⅲ切開(TCNNGA)形成309 bp和127 bp兩個片段(圖1)。

圖1 PCR-RFLP電泳結(jié)果

二、DNA序列分析

測序確認(rèn)PRSS2基因571位點上堿基存在G→A的錯義突變(圖2)。

圖2 PRSS2基因G191R突變序列分析

三、數(shù)據(jù)分析

138名健康者中共檢出PRSS2基因雜合性G191R突變12例，發(fā)生率為8.7%；82例AP患者共檢出5例PRSS2基因雜合性G191R突變，發(fā)生率為6.1%，OR值為0.682,95%可信區(qū)0.231～2.010；73例CP患者中只檢出1例PRSS2基因雜合性G191R突變，發(fā)生率為1.4%，OR值為0.145，95%可信區(qū)0.019～1.145。AP組與健康對照組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.487，P=0.485)，而CP組與健康對照組間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.432，P=0.035)。

討 論

正常情況下，胰液內(nèi)的胰蛋白酶原無活性，受到胰蛋白酶和腸激酶的激活后方具有消化能力。胰腺炎時因某些因素激活了胰腺內(nèi)的胰蛋白酶，后者又激活了彈性硬蛋白酶及磷脂酶A等，造成彈性組織溶解、血管壁及胰腺導(dǎo)管損傷、胰腺細(xì)胞的溶解和壞死。人體胰液中共有3種胰蛋白酶原亞型：陽離子型胰蛋白酶(cationic trypsinogen, PRSS1)，約占2/3；陰離子型胰蛋白酶原(anionic trypsinogen, PRSS2)，約占1/3；中性胰蛋白酶原(mesotrypsinogen，PRSS3)，量很少[7]。

陰離子型胰蛋白酶原(PRSS2)基因位于7號染色體7p35，mRNA長度約3.6 kb，共包含5個外顯子[8]，第191位甘氨酸位于第4外顯子。PRSS2基因的G191R突變可形成一個對胰蛋白酶高度敏感的Arg191～Gly192肽鍵，水解產(chǎn)生N-(16～191位氨基酸)和C-(192～247位氨基酸)兩個片段，其中C-水解片段含有酶活性至關(guān)重要的絲氨酸殘基(Ser200)[4]。G191R突變使得PRSS2自我分解、發(fā)生不可逆性改變，從而降低了胰腺炎發(fā)病的攻擊因素。本次研究發(fā)現(xiàn)，中國人PRSS2基因G191R突變在CP患者中的頻率明顯低于健康人，這與之前歐洲、日本及匈牙利人的研究相似[4-5，9]，支持G191R突變降低CP的易感性的觀點。但Mahurkar等[10]報道，印度人G191R突變發(fā)生頻率在慢性胰腺炎(0.7%)及健康人(0.3%)之間無顯著差異，認(rèn)為G191R突變對印度的CP患者沒有保護(hù)作用。

本研究結(jié)果顯示，PRSS2基因G191R突變在AP組與健康對照組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與歐洲及日本的研究結(jié)果基本一致[4-5]，表明AP的發(fā)生、發(fā)展與G191R突變無明顯相關(guān)性。有研究報道，急性膽源性胰腺炎與IL-6多態(tài)性(174C/C)有關(guān)、AP時發(fā)生器官功能衰竭與TNF多態(tài)性(238G/A)有關(guān)[11]，重癥急性胰腺炎的發(fā)生、發(fā)展與TLR4/NF-κB信號通路的激活有關(guān)[12]。

Kume等[5]的研究提示，自身免疫性胰腺炎G191R突變發(fā)生率與健康人相似，而酒精性和特發(fā)性慢性胰腺炎發(fā)生率較低。Rinderknecht等[13-14]提出慢性酒精中毒逆轉(zhuǎn)PRSS1及PRSS2的比率，使PRSS2成為主要的胰蛋白酶原，從而增加G191R突變的影響，因此，G191R突變可能對慢性酗酒者有更好的保護(hù)作用。由于本次實驗中搜集的病例數(shù)有限，無法按照病因等對胰腺炎患者進(jìn)行詳細(xì)的分類研究，因此尚需要大量的隊列研究進(jìn)一步闡明其與胰腺疾病的關(guān)系。

參 考 文 獻(xiàn)

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