125I籽源短時低劑量率照射對胰腺癌神經生長因子表達的影響

司佩任 路箏 劉巖 馬建霞 吳洪玉 李兆申

胰腺癌組織125I籽源近距離放射治療是對位置深在的胰腺癌進行內放療的一種方法，包括在組織內、組織表面或組織附近放置具有放射性的粒子進行治療，通過放射性粒子持續釋放射線來達到最大限度地殺傷腫瘤細胞的作用。已有多篇國內外文獻報道采用B超或CT引導穿刺、術中定向植入及內鏡超聲引導下穿刺等方式植入放射性粒子治療胰腺癌是安全有效的，可明顯改善患者的生活質量，尤其可以明顯緩解疼痛反應[1-4]。目前，125I籽源治療胰腺癌的分子機制仍不清楚。文獻報道，胰腺癌組織神經生長因子(nerve growth factor, NGF)高表達，提示NGF可能由胰腺癌細胞分泌，從而引起胰腺癌的嗜神經特性并導致疼痛的發生[5]。本研究組前期構建了胰腺癌神經浸潤體外模型，并行125I籽源短時、低劑量近距離照射[6]。本研究建立胰腺癌神經浸潤體內模型，植入125I粒子行內照射，觀察照射后胰腺癌組織NGF表達的變化。

一、材料與方法

1．原位胰腺癌模型構建及125I粒子植入：20只NOD/SCID健康雄性裸鼠購自中國醫學科學院實驗動物中心，6周齡。用1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，按照Fu等[7]方法在鼠的胰尾接種10 μl(108/ml)胰腺癌CAPAN-2細胞懸液。把胰腺回納腹腔，無菌條件下縫合腹膜和腹壁。注射6周后，將裸鼠按數字表法隨機分為照射組和對照組。照射組裸鼠在麻醉后、無菌條件下剖腹，暴露胰尾部接種的腫瘤，測量大小后將1顆1.0 mCi125I粒子植入瘤體中央，縫合腹膜和腹壁；對照組植入1顆空粒子。2周后處死裸鼠，測量腫瘤大小，取腫瘤組織，部分液氮冷凍，部分甲醛固定。

2．NGF mRNA表達的檢測：取液氮中的腫瘤組織塊，用研缽研碎，采用Trizol(Invitrogen公司)提取組織總RNA。先用逆轉錄試劑盒 (Takara公司)逆轉錄為cDNA，再采用巢式PCP檢測NGF mRNA 的表達。使用軟件Primer Premier5.0設計引物，由上海英俊生物工程技術有限公司合成。NGF引物上游為5′-AGCAAGCGGTCATCATCCC-3′， 下游1為5′-GGCAGGTCAGGCTCTTCTCA-3′， 下游2為5′-ACCACCGCCACAGACATCA-3′，最終擴增片段294 bp；內參GAPDH引物上游為5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游為5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3′，擴增片段142 bp[8]。PCR參數： 94℃ 4 min，94℃ 45 s、58℃ 45 s、72℃ 45 s，35個循環，最后72℃延伸10 min。取5 μl擴增產物，用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，Image J軟件進行灰度掃描分析，以目的條帶與內參條帶的灰度比值表示mRNA相對表達量。每組實驗至少重復3次，取均值。

3．NGF蛋白表達的檢測：取固定的標本，常規行蛋白質印跡法檢測NGF蛋白的表達。一抗和二抗均購自Abcam公司，工作濃度均為1∶200，最后DAB顯色、蘇木精復染、蓋片，顯微鏡下觀察。以PBS代替一抗作為空白對照。以胞膜和胞質出現棕黃色顆粒為陽性表達。結果判定：取5個高倍鏡視野(×400)，共計數1 000個細胞，計算陽性細胞占總細胞數的百分比，染色強度分為-、+、++、+++，分別計為0、1、2、3。陽性率=染色強度×(陽性細胞數/細胞總數)×100。30以上為陽性，最高300。

二、結果

1．照射組和對照組胰腺癌組織NGF mRNA的表達：125I粒子照射組及對照組胰腺癌組織NGF mRNA表達量分別為0.39±0.19、1.15±0.23，照射組的表達較對照組顯著下調，差異具有統計學意義(P<0.01，圖1)。

圖1 兩組移植瘤組織NGF mRNA的表達(M：DNA marker，1、2、3為照射組，4、5為對照組)

2．照射組與對照組胰腺癌組織NGF蛋白的表達：NGF蛋白表達于癌細胞的胞膜和胞質。125I粒子照射組及對照組胰腺癌組織NGF 蛋白的表達量分別為99.90±40.02、171.4±9.18，照射組的表達較對照組顯著下調，差異具有統計學意義(P<0.01，圖2)。

圖2 照射組(a)和對照組(b)移植瘤組織NGF蛋白表達(免疫組化染色 ×400)

討論NGF是神經營養因子家族的重要成員，為神經細胞的生長、發育和修復所必需。NGF高親和性特異性受體——酪氨酸激酶受體(trkA)是調節NGF反應的主要成分[8]。NGF在胰腺癌細胞組織中過表達，其受體trkA在周圍神經的神經束膜上強表達。NGF與trkA結合可激活p44/42 MAPK信號通路，促進浸潤遞質MMP-2表達的上調，進而促進胰腺癌的局部浸潤、擴散和神經轉移[9-11]。

中腹部疼痛是胰腺癌常見的臨床表現之一，給患者帶來極大的痛苦，嚴重地影響患者的生活質量。這種疼痛通常認為是腫瘤的嗜神經性，與腫瘤浸潤到腹膜后或內臟神經叢有關[12]。125I放射性粒子植入體內后可以持續發出低能量的γ射線，可使乏氧細胞再氧化，增加腫瘤細胞對射線的敏感性，同時低劑量率照射可以抑制腫瘤的有絲分裂，使腫瘤細胞因輻射效應受到最大程度的殺傷。射線對腫瘤組織的損傷作用較為復雜，可直接導致細胞死亡，也可誘發細胞凋亡[13]。125I籽源植入后組織最大損傷發生在14 d左右[14]。在外照射模式下的“減瘤效應”發生在125I植入瘤體后，且隨著治療時間的延長而壞死范圍逐漸增大。但臨床研究發現，晚期胰腺癌疼痛緩解的最佳時間發生在125I粒子植入后的7 d內，短期疼痛緩解率明顯優于長期緩解率[5-6]，說明125I籽源植入后短時、低劑量率照射緩解疼痛的機制無法用傳統的“減瘤效應”解釋，可能還存在其他的生物學效應。

本研究結果顯示，照射組腫瘤組織NGF基因表達顯著降低，表明125I籽源短時、低劑量率照射可能抑制胰腺癌細胞及其間質成分產生NGF，提示NGF在胰腺癌細胞神經浸潤中起重要作用，其確切機制有待進一步探討。

參 考 文 獻

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