外源性一氧化碳釋放分子2對膿毒癥小鼠肝臟能量代謝的調控作用及機制

梁峰，孫炳偉，王旭，秦魏婷，劉大東，仇雪楓

（江蘇大學附屬醫院燒傷整形科，江蘇鎮江212001）

外源性一氧化碳釋放分子2對膿毒癥小鼠肝臟能量代謝的調控作用及機制

梁峰，孫炳偉，王旭，秦魏婷，劉大東，仇雪楓

（江蘇大學附屬醫院燒傷整形科，江蘇鎮江212001）

目的：觀察膿毒癥小鼠肝臟能量代謝的變化，同時探討外源性一氧化碳釋放分子2（carbon monoxide-releasingmolecules-2，CORM-2）對其調控及作用機制。方法：將48只C57BL／6小鼠隨機均分成對照組，盲腸結扎穿孔（CLP）組，CORM-2組，無活性CORM-2（inactivated CORM-2，iCORM-2）組。采用CLP術制作膿毒癥模型，對照組不作任何處理，CORM-2組和iCORM-2組除術后使用CORM-2或無活性CORM-2外，其余處理同CLP組，術后72 h內連續監測各組12只小鼠血糖濃度的動態變化及存活情況。另選32只小鼠分組同上，術后24 h收集肝臟組織及血漿，檢測肝組織的18F-FDG分布、葡萄糖激酶活性、乳酸含量，全自動生化分析儀檢測血漿丙氨酸轉氨酶（ALT），天冬氨酸轉氨酶（AST）。結果：與對照組比較，CLP組葡萄糖代謝水平增強，葡萄糖激酶、AST、ALT活性以及乳酸含量均明顯增高（P均＜0.05）；CORM-2干預后上述指標明顯降低（P均＜0.05）。與對照組比較，各手術組小鼠血糖在術后36 h內持續下降，且組間差異無統計學意義。結論：CORM-2能明顯減少膿毒癥小鼠肝18F-FDG攝取、葡萄糖激酶活性和乳酸含量，從而改善膿毒癥小鼠肝臟能量代謝紊亂，提高生存率。

一氧化碳釋放分子2；膿毒癥；肝臟；18F-FDG

膿毒癥是由感染引起的炎癥反應綜合征，進一步發展可導致嚴重膿毒癥、膿毒性休克及多器官功能障礙，病死率仍居高不下［1］。肝臟能量代謝紊亂是導致膿毒癥高病死率的重要原因。在膿毒癥早期就可出現血糖升高，并且與預后密切相關［2］。我們的前期研究已證實外源性一氧化碳能抑制膿毒癥時嚴重的炎癥反應所導致的多器官功能衰竭［3－4］，但其對膿毒癥時肝臟能量代謝紊亂的調控作用未見報道。本研究采用小鼠盲腸結扎穿孔術（cecal ligation and puncture，CLP）制備膿毒癥模型，尾靜脈注射外源性一氧化碳釋放分子2（carbon monoxide-releasing molecules-2，CORM-2）進行早期干預，觀察膿毒癥時小鼠肝臟能量代謝的變化，同時探討CORM-2對其影響并分析作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

γ計數器（PE／1470Wizard，美國PE公司）、VMR小動物麻醉機（美國Matrx公司）、酶標儀（美國Molecular Device公司）。CORM-2（美國Sigma公司）使用前溶于二甲基亞砜，濃度為10 mmol／L，同時制備無活性CORM-2（inactivated CORM-2，iCORM-2）。18F-FDG由江蘇省原子能研究所提供。小鼠葡萄糖激酶和乳酸試劑盒購自南京建成生物工程研究所。其他試劑如無特殊注明均購自美國Sigma公司。

1.2 小鼠膿毒癥模型的制作及樣本采集

C57BL／6雄性小鼠，體質量（20±2）g，由江蘇大學動物中心提供，隨機分成4組，每組12只，分別為對照組、CLP組、CORM-2和無活性CORM組（iCORM-2組）。小鼠均不限制飲食，室溫（25± 2）℃，濕度45%～65%，適應性喂養7 d后進行實驗?？瞻讓φ战M未做特殊處理，CLP組小鼠接受CLP手術。在小鼠持續吸入2%異氟烷麻醉情況下，于其腹壁逐層切開2 cm創口，輕柔提起盲腸并于末端約1 cm處用3號絲線結扎，16號針頭于結扎遠端穿孔，避開較大血管并擠出適量腸腔內容物。原位回復盲腸，腹腔注射37℃生理鹽水約1 mL。逐層縫合腹壁。其他手術組亦進行CLP手術并分別給予尾靜脈注射CORM-2或iCORM-2（8mg／kg）。CORM-2注射濃度參考以往小鼠實驗研究報道及我們課題之前的研究中所使用的濃度［3，5］。手術24 h后異氟烷吸入麻醉下心臟穿刺收集血液并完整提取肝臟，組織標本每份稱取0.1 g，加入1 mL PBS后冰上超聲波裂解2次，每次30 s［5］。組織勻漿4℃低溫離心（12 000 r／min），取上清，－70℃保存。

1.3 小鼠生存率的檢測

各受試小鼠術后分組飼養，不限飲食，每6 h觀察并記錄小鼠活力及死亡情況，持續72 h。

1.4 小鼠血糖的測量

分別檢測并記錄各組小鼠在術前及術后1，2，4，6，8，10，12，16，20，24，36，48，72 h的血糖值。檢測時剪去小鼠尾部尖端2～3 mm，按摩擠壓少許血液（0.5～10μL）于血糖試紙檢測孔，用快速血糖儀讀取數值。

1.5 小鼠肝臟18F-FDG生物分布檢測

各實驗組小鼠在檢測前禁食24 h。尾靜脈注射18F-FDG 20μCi，60 min后全部小鼠斷頸處死，取完整的肝臟組織逐一稱重后使用γ計數儀檢測組織放射性同位素示蹤劑18F-FDG含量，通過對組織重量的標準化，并計算放射性同位素的注射衰變時間，從而得出每只小鼠的標準化放射攝取值（SUV）。計算結果經過標準化處理后得到最后的SUV值［6］。

1.6 小鼠血清轉氨酶，葡萄糖激酶及乳酸含量的檢測

日本奧林巴斯公司AU2700全自動生化分析儀測定小鼠血清丙氨酸轉氨酶（ALT）和天冬氨酸轉氨酶（AST）活性。肝細胞葡萄糖激酶活性和乳酸的含量通過使用相應的試劑盒檢測，方法參照試劑盒使用說明書。

1.7 統計學分析

信息化管理是市政工程造價控制與管理的重要實現途徑，而且我國政府也比較重視信息化，也相繼推出了一系列的優惠政策來推動信息化管理的實施和信息化工程的建設。但在我國現階段的實施過程中，往往會出現工程造價不能得到真正意義的普及，而其中則存在兩方面的原因：①信息化工程造價居高不下；②缺乏完善、系統的工程信息化的配套政策；有很多市政施工單位的經營理念、施工方法技術、管理模式都比較傳統，也比較落后，這也導致其管理機制比較僵化，很難適應當下社會；很多施工單位都沒有進行信息化管理，也沒有相應的技術水平，缺乏信息化管理系統等，這些都是信息化管理問題出現的原因。

2 結果

2.1 各組小鼠的生存率

本實驗通過對4個受試組共48只小鼠72 h的觀察顯示，CLP小鼠24 h的生存率僅為33%，48 h僅為25%。相比之下，使用CORM-2干預后的小鼠24 h生存率為72%，48 h的生存率達60%，甚至72 h后仍有20%小鼠存活。見圖1。

圖1 4組小鼠生存曲線的比較

2.2 CORM-2對膿毒癥小鼠血糖濃度的影響

CLP術后每2 h檢測小鼠血糖，持續36 h。對照組小鼠血糖無明顯改變，CLP組小鼠血糖在CLP術后持續降低，術后36 h下降約63%，CORM-2組和iCORM-2組小鼠未能明顯改善CLP術引起的血糖降低（P均＞0.05）。見圖2。

圖2 CORM-2對CLP小鼠血糖濃度的影響

2.3 CORM-2對膿毒癥小鼠肝臟葡萄糖代謝的影響

CLP術后24 h，應用γ計數儀檢測小鼠肝臟18F-FDG生物分布。結果顯示，對照組SUV值為（0.75±0.17）ID%／g，CLP組為（1.94±0.54）ID%／g，CORM-2組為（1.04±0.16）ID%／g，iCORM-2組為（3.57±0.69）ID%／g。CLP組和iCORM-2組的18F-FDG分布明顯高于另外兩組（P均＜0.05）。

2.4 CORM-2對肝臟葡萄糖激酶活性及乳酸含量的影響

CLP術后24 h，與對照組比較，CLP組和iCORM-2組肝臟葡萄糖激酶活性及乳酸含量均明顯增高（P＜0.05）；與CLP組比較，CORM-2組肝臟葡萄糖激酶活性及乳酸含量明顯降低（P＜0.05）。見表1。

表1 4組小鼠肝臟葡萄糖激酶的表達及乳酸含量的比較n＝8±s

表1 4組小鼠肝臟葡萄糖激酶的表達及乳酸含量的比較n＝8±s

a：P＜0.05，與對照組比較；b：P＜0.05，與CLP組比較

組別 葡萄糖激酶（U／g） 乳酸（mmol／L）4.60±2.10 0.24±0.020 CLP組 6.38±0.56a 0.40±0.017a CORM-2組 4.74±0.14b 0.25±0.019b iCORM-2組 7.62±0.48a 0.31±0.016a F值 27.634 34.887 P值對照組0.001 0.001

2.5 CORM-2對血清ALT和AST活性的影響

CLP術后24 h，與對照組比較，CLP組和iCORM-2組血清ALT和AST均明顯增高（P均＜0.05）；與CLP組比較，CORM-2組ALT和AST均明顯降低（P均＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠血清轉氨酶的比較 n＝8±s

表3 各組小鼠血清轉氨酶的比較 n＝8±s

a：P＜0.05，與對照組比較；b：P＜0.05，與CLP組比較

組別 ALT（U／L） AST（U／L）43.23±2.94 86.12±6.02 CLP組 112.61±9.74a 380.78±16.34a CORM-2組 63.67±12.23b 200.19±11.09b iCORM-2組 121.79±8.29a 389.48±15.84a F值 37.975 278.916 P值對照組0.001 0.001

3 討論

臨床研究證實，膿毒癥時肝臟能量代謝紊亂，表現為葡萄糖、蛋白質、脂肪等需求加大，導致機體處于高代謝水平［7］。其中，由于無氧酵解增加以及肝糖原合成能力下降所引起的高血糖，導致重要器官的功能損害，與患者預后不良密切相關。一方面，高血糖降低了中性粒細胞活性，削弱了機體的免疫功能，使機體抗感染能力下降；另一方面高血糖能影響細胞因子的產生，增加了腫瘤壞死因子、白細胞介素6的釋放，減少了內皮細胞NO的生成［8］。

內源性一氧化碳（CO）是由血紅素經血紅素加氧酶（HO）催化分解而產生，具有明顯的抗炎、抗凋亡等作用［9］。既往采用吸入的方法作為外源性CO的來源，但其裝置復雜、吸入濃度難以控制，易導致碳氧血紅蛋白血癥（HbCO）。CORM-2是近幾年新合成的外源性CO釋放分子，溶解后能緩慢釋放CO，從而發揮生理作用。

實驗發現，CLP小鼠血糖在術后2 h開始逐漸下降，至36 h時已降低63%。使用CORM-2干預后并沒有改變這一情況。我們認為出現這一情況的主要原因可能是由于手術后小鼠的攝食行為明顯減低，作為代謝能力本身比較旺盛的嚙齒類動物，在創傷后所需要的能量更是顯著增高，因而短時間的禁食即可能出現明顯低血糖。Barkhausen等［10］在2009年報道過該現象。這有沒有可能是因為膿毒癥嚴重感染，導致代謝能力下降所引起？是否和之前所研究的膿毒癥患者全身高代謝征的理論相悖呢？本實驗中我們對此做了進一步的研究。18FFDG作為一種類葡萄糖放射性示蹤劑，可以顯示組織器官受到各種疾病或藥物的影響時葡萄糖代謝水平的變化，目前已被應用于人及小動物糖代謝的研究［11］。18F-FDG被細胞膜上的葡萄糖轉運蛋白（GLUT）運輸到細胞內，通過HK磷酸化為18F-2′-FDG-6，繼而不能像G-6-P那樣繼續進行糖代謝而是被滯留在細胞內，因此，其含量就代表了細胞轉運和代謝葡萄糖的能力?，F已發現，FDG高攝取的情況不僅僅發生在惡性腫瘤，許多良性的炎性反應也常常表現出高FDG攝取現象［11］。我們檢測18FFDG生物分布，發現膿毒癥小鼠的肝臟葡萄糖代謝水平明顯增高，超過了正常水平，而使用CORM-2干預后其葡萄糖代謝能力則受到了明顯的抑制。

葡萄糖激酶是葡萄糖代謝的關鍵酶，主要存在于動物肝細胞及胰島B細胞胞質內，其活性的增高常常意味著葡萄糖代謝水平的增高。通過對膿毒癥小鼠肝細胞葡萄糖激酶活性的檢測，我們發現膿毒癥時葡萄糖激酶活性較對照組明顯增高，而CO干預后這一改變受到明顯抑制。由此，我們推測，CORM-2可能是通過抑制葡萄糖激酶的活性，降低了肝細胞葡萄糖代謝水平。

膿毒癥時異常代謝的另一個重要變化就是高乳酸代謝，這是激素和細胞因子的反向調節異常而引起的肌肉及其他組織無氧酵解過程增加所引起的，這一過程被稱為乳酸穿梭。組織中乳酸含量的高低和持續時間直接影響后期器官功能障礙的形成，乳酸堆積所引起的酸中毒對于膿毒癥預后也是極為不利的［7］。機體清除乳酸最主要的器官就是肝臟。我們的實驗結果顯示，CORM-2干預后的膿毒癥小鼠肝臟乳酸堆積明顯受抑，這也是CORM-2調控膿毒癥小鼠肝臟能量代謝的一個重要機制。

因此，CORM-2通過調節膿毒癥小鼠肝臟葡萄糖代謝、組織乳酸含量及轉氨酶活性，改善了肝臟能量代謝，從而使膿毒癥小鼠的生存率明顯提高。本研究初步證實了CORM-2對膿毒癥時肝臟能量代謝紊亂的調控作用，后期，我們將進一步對CORM-2干預能量代謝中脂肪和蛋白質的代謝進行研究。

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Effect of CORM-2 on liver energy metabolism in sepsis and the potentialmechanism s

LIANG Feng，SUN Bing-wei，WANG Xu，QINWei-ting，LIU Da-dong，QIU Xue-feng

（Department of Burn and Plastic Surgery，the Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001，China）

Objective：To explore the effects of CO-releasing molecules［tricarbonyl dichlororuthenium（Ⅱ）dimer，CORM-2］-liberated CO on liver energymetabolism of septic model and potentialmechanisms.M ethods：Forty-eightmice were randomly divided into four groups：control group，CLP group，CORM-2 group，inactivated CORM-2（iCORM group），cecal ligation and puncture（CLP）group.The CORM-2 and iCORM-2 group were treated with CLP surgery then followed by tail vein injection of8 mg／kg CORM-2 and iCORM-2，respectively.Twelvemice in each group were used during the experiments of blood glucose testing and survival ratemeasurement.In the other experiment，eightmicewere used in each group.Levels of aminotransferases（ALT and AST）were measured by biochemicalmethods.Glucokinase activity and the concentration of lactate in tissue homogenateswere assessed using assay kits.Blood glucose ofmice in each groupswas tested every 2 hourswithin 36 hours using a fast blood glucose testmeter.Aγcounter was used to detect the biodistribution of18F-FDG in the liver ofmice.Results：The survival rate of septic mice was significantly increased by CORM-2.The uptake of18F-FDG was decreased when treated with CORM-2.The activity of glucokinase，AST，ALT and concentration of lactate in septic mice treated with CORM2 were maintained in normal levels.The blood glucose of septicmicewas decreased significantly in all the three op-eration groups.Conclusion：CORM-2-released CO improves the survival of septic mice by modulating the metabolism of glucose septic mice and protecting the function of liver in sepsismice.

carbon monoxide-releasingmolecules-2；sepsis；liver；18F-FDG

R631

A

1671－7783（2014）01－0018－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y130248

國家自然科學基金資助項目（30772256，81071546，81272148）；江蘇省自然科學基金資助項目（BK2012703）

梁峰（1983—），男，碩士研究生；孫炳偉（通訊作者），教授，博士生導師，E-mail：sunbinwe＠hotmail.com

2013－10－30 ［編輯］陳海林