循環miRNA檢測在診斷急性冠脈綜合征中的意義

許浩軍，顧明，于宗良，谷惠敏，王炳芳

（江蘇大學附屬昆山醫院心內科，江蘇昆山215300）

循環miRNA檢測在診斷急性冠脈綜合征中的意義

許浩軍，顧明，于宗良，谷惠敏，王炳芳

（江蘇大學附屬昆山醫院心內科，江蘇昆山215300）

目的：探討循環miRNA檢測在診斷急性冠脈綜合征（ACS）中的意義。方法：選擇100例ACS患者為研究組，匹配冠脈造影正常者100例為對照組，研究組再分為不穩定性心絞痛（UAP）組（n＝32）和急性心肌梗死（AMI）組（n＝68）。采用qRT-PCR方法檢測血清miR-1，miR-133a，miR-208b，miR-499。結果：AMI患者的血清miR-1，miR-133a，miR-208b，miR-499水平較對照組顯著增高，分別上調了4.15，4.46，7.95，6.62倍，UAP組較對照組也顯著上升，分別上調了1.62，1.98，2.32，2.98倍，P均＜0.05。4種miRNA在AMI患者中的變化曲線均表現為發病時顯著升高，發病后6 h最高，發病后24 h，72 h顯著下降，并接近正常水平。miR-1，miR-133a，miR-208b，miR-499對AMI患者診斷的ROC曲線下面積分別為0.68，0.75，0.80，0.73，介于肌酸激酶同工酶和肌鈣蛋白T之間。結論：循環特異性miRNA的水平升高可用于輔助診斷ACS。

急性冠脈綜合征；miRNA；診斷

心血管疾病是威脅人類健康的重要疾病之一，其中急性冠脈綜合征（ACS）是導致人類死亡的主要疾病。因此，早期、及時、準確的診斷及估計病情是積極采取有效的治療措施并減少死亡率的必要條件［1］。生物標志物是輔助診斷ACS的重要工具。美國心臟病學會（ACC）與美國心臟病協會（AHA）在相關治療指南［2］中推薦ACS患者在癥狀出現后6 h內檢查心肌生化標志物，如肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌紅蛋白和肌鈣蛋白（cTn）等。上述標志物雖已在ACS患者早期診斷的敏感性及特異性上達到一定水平，但研究者們對高敏感性及特異性的新血清標志物的研究仍在繼續，尤其是針對能反應ACS患者預后的良好血清標志物。近10年來新發現的非編碼RNA——MicroRNA（miRNA）與各種疾病的發生和發展及預后有緊密聯系。miRNA的表達不僅具有較好的組織特異性，且在血液中具有較高的穩定性，并已發現miRNA與心肌梗死的發生、發展有關，例如miR-1、miR-133、miR-208、miR-499等［3］，因此心肌特異性miRNA可能成為一種理想的生物學標志物用于ACS的早期診斷及判斷預后。因此，本研究將分析ACS相關的循環miRNA，探討其與不同類型ACS患者的關系，為ACS的診斷治療提供幫助。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2012年2月至2013年2月于本院就診的ACS患者100例為研究組，匹配冠脈造影正常者100例為對照組。研究組納入標準：（1）年齡≥18歲且≤75歲。（2）ACS診斷符合2007年美國心臟病學會（ACC）和美國心臟協會（AHA）頒布的指南［2］，依據臨床表現（心絞痛發作表現、心電圖異常）及冠脈造影結果。（3）心肌梗死患者參照2007年心肌梗死診斷指南，心臟生物標志物水平升高超過參考值上限99百分位值，同時至少伴有下述心肌缺血證據之一：①缺血癥狀；②心電圖提示新發缺血性改變；③影像學證據提示新發局部室壁運動異常或存活心肌丟失。對照組納入標準：無心血管病史，心電圖、胸片、肝腎功能、生化常規檢查正常，排除合并感染、腫瘤等。排除標準：ACS患者并發其他臟器功能衰竭或嚴重病變（如肺癌、肝腎功能衰竭等）及過敏性疾病和自身免疫性疾病的患者除外。研究組男63例，女37例，平均年齡（46.43± 4.90）歲，對照組男62例，女38例，平均年齡（45.45 ±5.12）歲，兩組年齡、性別分布差異無統計學意義，具有可比性。根據上述診斷標準將ACS組分為2個亞組：不穩定性心絞痛（UAP）組（n＝32）和急性心肌梗死（AMI）組（n＝68）。

1.2 樣本收集和處理

UAP患者，采集隨機靜脈全血5 mL；AMI患者，及時采集入院后即刻、心肌梗死后6，24，72 h靜脈全血5 mL，并記錄血清肌鈣蛋白T（cTnT）、CK-MB水平。抽取的外周靜脈血置于不含抗凝劑的試管中，靜置30min，室溫3 000 r／min離心10 min，提取上清分裝到去RNA酶的EP管中，再以12 000 r／min離心10 min，取上層血清每300μL分裝至去RNA酶的EP管中，最后放置到－80℃低溫冰箱中保存待用。

1.3 miRNA的檢測

1.3.1 RNA提取及質檢 依照miRNA提取試劑盒（Tiangen公司）說明，分別提取所有患者及對照血清樣本中RNA，用于檢測血清miR-1，miR-133a，miR-208b、miR-499水平，用紫外分光光度計檢測樣品的純度和濃度，瓊脂糖凝膠電泳分析提取質量。

1.3.2 反轉錄反應 配置反應液的過程在冰上進行，嚴格依據TaqManmicroRNA Assays（美國Applied Biosystems公司）說明書操作，將樣品RNA反轉錄成cDNA（其中引物及探針序列由Applied Biosystems提供）。反應體系中試劑包括100 mmol／L dNTPs 0.15μL、MutiScribe逆轉錄酶（50 U／μL）1.0μL、10×反轉錄緩沖液1.5μL、RNA酶抑制劑（20 U／μL）0.19μL、無核酸酶水4.16μL、反轉錄引物3μL及RNA 5μL。

1.3.3 PCR反應 以cDNA為模板，使用TaqMan microRNA Assays中的PCR引物探針混合液進行PCR擴增及熒光定量檢測，反應體系包括TaqMan 2 ×通用的PCR擴增預混試劑10μL、無核酸酶水7.67μL、PCR引物（20×）1.0μL及反轉錄產物（1∶15）1.33μL，共40個循環，實驗重復3次。反應結束后分析PCR反應曲線，得到Ct值，即熒光達到閾值所需的PCR循環數。依據2－ΔΔCt法，計算每個患者miRNA水平的比例，以倍數表示。

1.4 統計方法

采用SPSS14.0軟件進行統計分析，所有資料均采用中位數與四分位數間距（P25～P75）表示，計量資料之間的比較均采用秩和檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 UAP、AMI患者發病時miRNA比較

圖1為miR-1，miR-133a，miR-208b，miR-499在3組患者的血清水平比較。結果表明，AMI患者4種miRNA較對照組顯著增高，分別上調了4.15，4.46，7.95，6.62倍（中位數，下同），UAP組較對照組也顯著上調，分別上調了1.62，1.98，2.32，2.98倍，差異均有統計學意義。

2.2 miRNA在AMI發病時的變化及其與cTnT的診斷效能的比較

圖2統計分析了miR-1，miR-133a，miR-208b，miR-499在AMI患者發病后血清水平的變化情況，4種miRNA均表現為發病時顯著提升，發病后6 h最高，發病后24，72 h顯著下降，并已接近正常水平。

表1統計并計算了miR-1，miR-133a，miR-208b，miR-499對AMI患者診斷的ROC曲線下面積，分別為0.68，0.75，0.80，0.73。而cTnT用于AMI診斷的ROC曲線下面積為0.83，CK-MB為0.65，可見miR-1，miR-133a，miR-208b，miR-499用于診斷AMI的診斷效能介于CK-MB和cTnT之間。

圖1 各組患者發病時血清m iRNA水平比較

圖2 AM I患者血清m iRNA水平的變化

表1 m iR-1、m iR-133a、m iR-208b和m iR-499對AM I患者的診斷效能

3 討論

近年來，生物標志物對ACS等心血管疾病的早期診斷、治療以及預后的判定、降低疾病死亡率起到了關鍵性的作用［4］。并且，臨床醫生合理選擇理想的生物標志物對ACS的早期診斷、治療以及預后判斷等同樣也起到關鍵作用［5］。

miRNA是一段長18～23個核苷酸的非編碼RNA，具有負性調節基因表達的作用，有效地調控轉錄后翻譯的效率以及靶mRNA的穩定性，在轉錄后水平沉默特定基因從而對基因表達起到精細調節的作用，調控細胞的生長、發育、分化和凋亡［6］。miRNA是許多重要生物過程的重要調節因子，在多種心血管疾病的發生發展中起重要作用。miRNA還存在于人循環血中，逐漸成為多種疾病的生物標志物。細胞內的miRNA主要通過兩種途徑進入循環系統，形成循環miRNA。第一種是從破裂細胞被動滲漏，如心肌梗死。第二種是源自細胞的微囊泡主動分泌。微囊泡可能是運輸循環miRNA的主要載體，細胞內miRNA先被裝入分泌囊泡中，然后伴隨囊泡的分泌進入血液循環。由于循環miRNA存在于微囊泡的內部，避免了RNA酶的降解，因而具備一定的穩定性。并且循環miRNA能抵抗各種惡劣條件，包括煮沸、低或高pH值、延長貯存、凍融循環等［7］，因此，隨著商品化的試劑盒的應用，循環miRNA的檢測已十分可靠，可作為疾病的血清標志物。近年來已有大量研究表明循環miRNA與腫瘤、心血管疾病有關［8－9］，并已發現miRNA與心肌梗死有關，例如miR-1、miR-208、miR-499。Ai等［10］對心肌梗死患者采用實時定量PCR檢測血漿miR-1水平，結果發現miR-1在心肌梗死急性期顯著升高，2周后下降至基礎水平。Wang等［11］對AMI患者和AMI模型大鼠心肌內miRNA的表達規律分析后發現，miR-208具備心臟特異性，在AMI時明顯升高，但在正常心肌中無表達。最新研究發現［12－13］，miR-499在AMI后表達升高。D′Alessandra等［14］研究發現，miR-1，miR-133a，miR-133b和miR-499在心肌梗死患者及小鼠模型中顯著增高，時間變化曲線與cTnI波動基本一致，即心肌梗死后數倍增高，24～48 h即可恢復正常。Corsten等［13］研究表明，miR-499與mir-208b在急性心肌梗死患者中較對照組顯著上升，上升幅度與cTnI和肌酸磷酸激酶明顯相關。本研究結果表明，AMI患者miR-1，miR-133a，miR-208b，miR-499的血清水平較對照組顯著增高，分別上調了4.15，4.46，7.95，6.62倍，變化曲線均表現為發病后6 h最高，發病后24 h，72 h顯著下降，并接近正常水平。miR-1，miR-133a，miR-208b，miR-499對AMI患者診斷的ROC曲線下面積分別為0.68，0.75，0.80，0.73，用cTnT診斷AMI的ROC曲線下面積為0.83，而CK-MB為0.65，可見4種miRNA用于診斷AMI的效能均能高于CK-MB，但仍然不及cTnT，進一步研究可通過多個miRNA聯合診斷的方法提升診斷效率。

目前對ACS，尤其UAP中循環miRNA的研究才剛開始，許多結論尚有待進一步擴大樣本量進行深入探討，本研究結果初步表明循環miRNA的表達量對ACS的診斷具有一定的價值。

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Circulating m iRNA detection in the diagnosis of acute coronary syndrome

XU Hao-jun，GU Ming，YU Zong-liang，GU Hui-min，WANG Bing-fang

（Department of Cardiology，Kunshan Hospital Affiliated to Jiangsu University，Kunshan Jiangsu 215300，China）

Objective：To investigate the circulatingmiRNA detection in the diagnosis of acute coronary syndrome.M ethods：A total of 100 cases of ACSwere collected for the study group，and 100 subjects of normal coronary angiography werematched for the control group.The study group was further divided into unstable angina（UAP）group（n＝32）and acutemyocardial infarction（AMI）group（n＝68）.qRT-PCR was used to detect serum miR-1，miR-133a，miR-208b，miR-499.Results：Serum miR-1，miR-133a，miR-208b，miR-499 levels in AMIpatientswere significantly higher than the control group.They were increased 4.15，4.46，7.95，6.62 fold（median，the same below）.In UAP group，they were also increased significantly，1.62，1.98，2.32，2.98 fold compared with the control group respectively（P＜0.05）.Four kinds ofmiRNA in AMIpatients showed a change curve thatwas significantly improved after the onset of incidence，highest in 6 h and after the onset of24 h，72 h，decreased significantly and closed to the normal level.The area under the ROC curve ofmiR-1，miR-133a，miR-208b，miR-499 in patients with AMI were 0.68，0.75，0.80，0.73，higher than CK-MB but lower than cTnT.Conclusion：Elevated levels of specific circulatingmiRNA can be used for the diagnosis of ACS.

acute coronary syndrome；miRNA；diagnosis

R541.4

A

1671－7783（2014）01－0059－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y130224

許浩軍（1976—），男，江蘇昆山人，主治醫師，主要從事冠心病臨床及介入診治；王炳芳（通信作者），博士，碩士生導師，主任醫師，E-mail：shbingfang＠163.com

2013－10－07 ［編輯］何承志