急性冠脈綜合征外周血單核細胞Toll樣受體4、鋅指蛋白A20與組織因子的表達及意義

于春楊，王昭軍，蒲肖君，陳小節(jié)

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇鎮(zhèn)江212001）

急性冠脈綜合征外周血單核細胞Toll樣受體4、鋅指蛋白A20與組織因子的表達及意義

于春楊，王昭軍，蒲肖君，陳小節(jié)

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇鎮(zhèn)江212001）

目的：觀察急性冠脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）患者外周血單核細胞Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）、鋅指蛋白A20（zinc finger protein A20，A20）的表達與血漿組織因子、組織因子途徑抑制物（tissue factor passway inhibitor，TFPI）水平的變化。方法：選擇ACS患者31例和穩(wěn)定型心絞痛（stable angina pectoris，SAP）患者21例為研究對象。ACS組包括急性心肌梗死（acutemyocardial infarction，AMI）15例和不穩(wěn)定型心絞痛（unstable angina pectoris，UAP）16例；對照組共入選20例，均為同期住院的非心血管疾病患者。根據(jù)病變血管數(shù)目將全部冠心病患者進一步分為3組：單支病變組17例；雙支病變組15例；多支病變組20例。采用熒光定量PCR檢測72例入選對象外周血單核細胞TLR4mRNA、鋅指蛋白A20mRNA的表達；采用ELISA法測定血漿組織因子、TFPI質(zhì)量濃度。結(jié)果：①ACS組患者外周血單核細胞TLR4 mRNA及A20 mRNA的表達明顯高于對照組和SAP組（P＜0.001），而后兩組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。多支病變組TLR4、A20 mRNA表達均明顯高于單支病變組（P＝0.006，P＝0.000）。②ACS組血漿組織因子、TFPI水平明顯高于SAP和正常對照組（P均＜0.01）；多支病變組血清組織因子含量高于單支病變組（P＝0.017）。ACS外周血單核細胞TLR4 mRNA表達與A20 mRNA的表達呈正相關(guān)（r＝0.640，P＝0.002），與血漿組織因子濃度亦呈正相關(guān)（r＝0.716，P＝0.000）。結(jié)論：冠心病患者冠狀動脈病變程度和粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性與外周血單核細胞TLR4表達水平有關(guān)；TLR4炎癥信號通路激活可能參與ACS冠脈粥樣斑塊破裂、促進凝血異常及血栓形成。

急性冠脈綜合征；Toll樣受體4；鋅指蛋白A20；組織因子；組織因子途徑抑制物

本研究觀察冠心病患者單核細胞TLR4、A20 mRNA表達的變化，并檢測了血漿組織因子、TFPI質(zhì)量濃度，以探討TLR4介導(dǎo)的炎癥通路和凝血異常在ACS發(fā)病中的作用，及其與冠狀動脈病變嚴重程度及粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的關(guān)系，進一步探討TLR4信號通路的激活是否參與凝血異常及血栓形成。

1 對象與方法

1.1 研究對象

52例冠心病患者均為2012年3月至2012年11月在本院心內(nèi)科住院病例，診斷根據(jù)典型的臨床表現(xiàn)、心肌酶學(xué)、心電圖等指標，符合世界衛(wèi)生組織

急性冠狀動脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）是由冠狀動脈不穩(wěn)定斑塊在炎癥基礎(chǔ)上發(fā)生破裂出血，啟動外源性凝血系統(tǒng)，引起冠狀動脈不完全或完全阻塞所致［1－3］。Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）是Toll樣受體家族中的重要一員，TLR4激活后可以通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)單核、巨噬細胞產(chǎn)生免疫炎性細胞因子、黏附分子以及共刺激分子等，這些分子在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用［4］。鋅指蛋白A20（zinc finger protein A20，A20）是機體炎癥反應(yīng)過程中內(nèi)源性表達的一種炎癥調(diào)節(jié)蛋白，通過泛素化和去泛素化調(diào)節(jié)參與TLR4／NF-кB（核轉(zhuǎn)錄因子кB）信號通路的調(diào)控。近年來國外一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)冠心病患者的高凝狀態(tài)、凝血異常與組織因子、組織因子途徑抑制物（tissue factor passway inhibitor，TFPI）系統(tǒng)的失衡有關(guān)［5－6］。國外學(xué)者認為炎癥和凝血系統(tǒng)不是獨立存在的，兩者相互激活，相互促進，（WHO）關(guān)于冠心病的診斷標準。經(jīng)冠狀動脈造影評價冠狀動脈狹窄程度，至少有1支主要血管狹窄≥50%。根據(jù)病史、體檢及冠狀動脈造影結(jié)果將患者分為兩組：ACS組31例，穩(wěn)定型心絞痛（stable angina pectoris，SAP）組21例。另外設(shè)立正常對照組20例，均來自本院住院病例，既往無糖尿病、高血壓病史，經(jīng)體格檢查和實驗室檢查其血壓、血脂、血糖正常；且經(jīng)冠狀動脈造影檢查排除冠心病。根據(jù)冠心病患者病變血管數(shù)目進一步分為單支病變組（17例），雙支病變組（15例），多支病變組（20例）。以上入選者均排除敗血癥、肺部感染等嚴重感染、嚴重肝腎功能衰竭、彌漫性血管內(nèi)凝血、惡性腫瘤和自身免疫性疾病及目前正在進行抗凝、抗栓治療的患者。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑和儀器 淋巴細胞分離液（天津灝洋生物有限公司）、Trizol試劑（上海普飛生物公司）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（加拿大Fermentas公司）、熒光定量試劑盒（寶生物工程大連有限公司）、CFX96熒光定量PCR儀、聚合酶鏈反應(yīng)擴增儀（美國BioRad公司）、ELISA試劑盒（蘇州賽德生物有限公司）、450 nm酶標儀（Model 570，日本Bio-Rad公司）。

1.2.2 標本采集與細胞分離 用EDTA-2K抗凝管采集動脈血4 mL，采用Ficoll法分離外周血淋巴細胞，Trizol提取總RNA；上層血漿于－70℃保存?zhèn)溆谩?.2.3 熒光定量PCR反應(yīng) 引物由上海生工合成，TLR4上游引物：5′-CCATTTCAGCTCTGCCTTCAC-3′，下游引物：5′-ACAACAATCACCTTTCGGCTTT-3′，擴增片段104 bp；A20上游引物：5′-GGAAGCTTGTGGCGCTGAA-3′，下游引物：5′-TCCAGTTGCCAGCGGAATTTA-3′，擴增片段166 bp；β-肌動蛋白上游引物：5′-CACGAAACTACCTTCAACTCC-3′，下游引物：5′-CATACTCCTGCTTGCTGATC-3′，擴增片段265 bp。按照Fermentas試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：95℃30 s預(yù)變性，然后95℃10 s，58℃30 s，72℃30 s，共38個循環(huán)。

1.2.4 血漿組織因子、TFPI水平檢測 嚴格按照試劑盒說明書操作，繪制標準曲線。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以ˉx±s表示，多個樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，計量資料采用χ2檢驗；采用Pearson相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組臨床基線資料比較

各組年齡、性別間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；ACS組與SAP組高血壓、糖尿病等冠心病相關(guān)危險因素間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；ACS組與SAP組空腹血糖均高于對照組，而HDL低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組基礎(chǔ)臨床資料比較 ±s

表1 各組基礎(chǔ)臨床資料比較 ±s

a：P＜0.05，與對照組比較

項目 ACS組 SAP組 對照組 F／χ2值 P值n 31 21 20年齡（歲） 64.64±9.04 64.19±7.86 55.2±8.58 1.915 0.155男／女 27／4 11／10 6／14 5.617 0.081高血壓［n（%）］18（58.06） 14（66.67） — 10.340 0.006糖尿病［n（%）］9（29.03） 6（28.57） — 7.289 0.026吸煙［n（%）］15（48.39） 7（33.33） 2（18.00） 6.004 0.050飲酒［n（%）］10（32.26） 3（14.29） 2（10.00） 4.422 0.110血糖（mmol／L） 5.50±1.19a 5.52±1.47a 4.79±0.55 3.902 0.049 TC（mmol／L） 4.44±0.98 4.42±0.87 4.37±0.91 0.039 0.961 TG（mmol／L） 2.10±1.75 1.66±0.74 1.27±0.54 2.603 0.081 ApoA（g／L） 1.15±0.43 1.12±0.17 1.22±0.29 0.515 0.600 ApoB（g／L） 0.87±0.23 0.87±0.51 0.74±0.17 1.147 0.324 LDL（mmol／L） 2.75±0.82 2.71±0.68 2.63±0.69 0.165 0.849 HDL（mmol／L） 1.12±0.23a 1.11±0.29a 1.36±0.39 4.847 0.011單支病變（n1） 8 9 —雙支病變（n2） 8 7 — 3.325 0.190多支病變（n3） 15 5—

2.2 外周血單核細胞TLR4 mRNA，A20 mRNA相對表達量

ACS組TLR4、A20 mRNA的表達明顯高于SAP組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.01）。多支病變組TLR4，A20 mRNA的表達明顯高于單支病變組（P＝0.006，P＝0.000）。見表2、表3。

表2 外周血單核細胞TLR4、A20 m RNA的表達±s

表2 外周血單核細胞TLR4、A20 m RNA的表達±s

a：P＜0.01，與對照組比較；b：P＜0.01，與SAP組比較

TLR4 mRNA A20 mRNA ACS組 31 0.49±0.16a，b 0.22±0.008a，組別 n b SAP組 21 0.19±0.09 0.09±0.03對照組 20 0.13±0.03 0.08±0.04 F值 36.249 41.746 P值0.000 0.000

表3 不同病變血管數(shù)患者間TLR4，A20 m RNA的表達±s

表3 不同病變血管數(shù)患者間TLR4，A20 m RNA的表達±s

a：P＜0.01，與單支病變組比較

TLR4 mRNA A20 mRNA單支病變組組別 n 17 0.27±0.18 0.12±0.07雙支病變組 15 0.39±0.17 0.18±0.08多支病變組 20 0.47±0.15a 0.22±0.08a F值 3.482 5.519 P值0.045 0.015

2.3 各組血漿組織因子和TFPI的濃度

ACS組患者血漿組織因子、TFPI水平高于SAP組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）；多支病變組與單支病變組血漿組織因子水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.017）。見表4、表5。

表4 各組患者間血漿組織因子和TFPI濃度的比較±s

表4 各組患者間血漿組織因子和TFPI濃度的比較±s

a：P＜0.01，與對照組比較；b：P＜0.01，與SAP組比較

組別 n 組織因子（ng／L） TFPI（μg／L）ACS組 31 22.79±1.49a，b 22.50±1.87a，b SAP組 21 19.31±0.51 20.44±0.48對照組 20 19.25±0.75 19.63±0.65 F值 18.937 50.216 P值0.000 0.000

表5 不同冠狀動脈病變血管數(shù)病例間血漿組織因子、TFPI含量的比較 ±s

表5 不同冠狀動脈病變血管數(shù)病例間血漿組織因子、TFPI含量的比較 ±s

a：P＜0.05，與單支病變組比較

組別 n 組織因子（ng／L） TFPI（μg／L）單支病變組17 20.31±1.22 21.71±1.75雙支病變組 15 20.77±1.33 22.18±2.14多支病變組 20 21.66±1.86a 21.47±1.88 F值 0.653 2.114 P值0.528 0.139

2.4 ACS外周血TLR4 mRNA與A20 mRNA表達、血漿組織因子含量的相關(guān)性

ACS患者外周血單核細胞TLR4 mRNA的表達與A20 mRNA的表達呈正相關(guān)（r＝0.640，P＝0.002），與組織因子含量亦呈正相關(guān)（r＝0.716，P＝0.000）。見圖4。

圖4 ACS患者外周血TLR4 m RNA表達與A20 m RNA、血漿組織因子含量的相關(guān)性

3 討論

Toll樣受體（TLRs）是重要的先天免疫模式識別受體，TLR4是TLRs家族中的重要成員，TLR4與配體結(jié)合后，經(jīng)MyD88依賴途徑和非MyD88依賴途徑啟動下游分子的級聯(lián)反應(yīng)，引起NF-кB轉(zhuǎn)位進入核內(nèi)。活化的NF-кB可誘導(dǎo)炎性介質(zhì)和趨化因子等細胞因子的表達、分泌，參與炎癥反應(yīng)，從而促進動脈粥樣硬化發(fā)生和進展［3，10－11］。研究顯示，在動脈粥樣斑塊內(nèi)的血管內(nèi)皮細胞、巨噬細胞、血管平滑肌細胞和血管外膜成纖維細胞中，TLR4表達上調(diào)［12］。我們檢測了ACS患者外周血單核細胞TLR4 mRNA的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TLR4在冠心病患者外周血單核細胞的表達上調(diào)，ACS患者的單核細胞TLR4 mRNA的表達明顯高于SAP患者和對照組，與國外研究者的結(jié)論相同［13］。ACS外周血單核細胞TLR4 mRNA表達增高，進一步證明了TLR4信號通路可能參與了動脈粥樣硬化以及斑塊破裂的進程。

鋅指蛋白A20是炎癥反應(yīng)過程中一種調(diào)節(jié)蛋白，由TNF-α、脂多糖等誘導(dǎo)產(chǎn)生，是NF-кB活化的產(chǎn)物［14］。A20同時又可以負反饋抑制NF-кB激活導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)［15］。A20通過下調(diào)細胞膜受體TLR4的表達，進而抑制炎癥。A20表達增高作為NF-кB依賴性基因表達的負反饋，對于終止TLR4誘導(dǎo)的NF-кB活化和前炎癥因子的表達非常重要［16］。本研究顯示，冠心病患者TLR4信號通路的負反饋調(diào)節(jié)因子A20 mRNA表達上調(diào)，ACS組明顯高于SAP組和對照組；ACS患者外周血單核細胞A20 mRNA表達的增加，進一步說明炎癥反應(yīng)參與了不穩(wěn)定斑塊的發(fā)生或進展；但可能由于A20功能缺陷或上調(diào)不足，并不能完全抑制TLR4介導(dǎo)的信號通路的激活，致使促炎與抗炎因子失衡，導(dǎo)致AS的發(fā)生和發(fā)展，具體機制尚不明確。A20表達上調(diào)可能抑制TLR4信號通路的激活，降低炎癥反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)或穩(wěn)定粥樣斑塊，這可能為冠心病及其并發(fā)癥防治提供新的思路和策略。

組織因子即凝血因子Ⅲ（又稱組織凝血活酶），是啟動凝血過程級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵因子，通過啟動外源性凝血系統(tǒng)而使機體處于高凝狀態(tài)，導(dǎo)致血栓形成。ACS不穩(wěn)定斑塊存在炎癥反應(yīng)，血管內(nèi)皮細胞、巨噬細胞、單核細胞、平滑肌細胞等動脈粥樣硬化斑塊中的主要細胞成分有大量組織因子表達，使斑塊內(nèi)組織因子的促凝活性增加［17－18］；同時在炎癥基礎(chǔ)上由于機械刺激或血流動力學(xué)改變，促使冠狀動脈內(nèi)易損性斑塊破裂，組織因子暴露，啟動凝血瀑布，外源性凝血途徑活化導(dǎo)致血栓形成［19－20］，引起血管狹窄、閉塞。TFPI是組織因子的生理性抑制物，可抑制活化因子Ⅹa（FⅩa）及活化因子Ⅶ（Ⅶa）／TF復(fù)合物，使凝血級聯(lián)反應(yīng)不能啟動，從而抑制血栓形成，預(yù)防ACS的發(fā)生。

本研究通過檢測冠心病患者血漿組織因子、TFPI的濃度評估機體的凝血狀態(tài)。結(jié)果顯示，ACS組患者血漿組織因子、TFPI較對照組明顯升高，顯示血漿組織因子、TFPI水平可能與冠狀動脈斑塊的穩(wěn)定性有關(guān)，且血漿組織因子水平與血管病變數(shù)目之間亦有相關(guān)性。臨床工作中有可能通過檢測冠心病患者外周血凝血情況來推測冠脈斑塊的穩(wěn)定性，可在條件允許的情況下，加強抗炎、抗凝治療以預(yù)防ACS的發(fā)生。

在正常情況下組織因子不存在于循環(huán)血液中或不與循環(huán)血液接觸，而外周血TFPI卻持續(xù)地表達，以構(gòu)成生理性抗凝屏障。組織因子、TFPI作為一對平衡系統(tǒng)，對維持機體正常凝血功能起著積極作用。基礎(chǔ)研究［21］已經(jīng)證實，TFPI的升高是機體對內(nèi)皮損傷及局部炎癥的一種代償反應(yīng)。但可能由于TFPI對高濃度組織因子介導(dǎo)的凝血途徑對抗不足，導(dǎo)致機體呈現(xiàn)高凝狀態(tài)，容易形成血栓。此外，本研究中冠心病患者外周血TLR4 mRNA表達與血漿組織因子呈正相關(guān)，提示炎癥通路激活可能促進凝血異常，兩者存在一定的相關(guān)性，TLR4介導(dǎo)的信號通道可能參與ACS冠脈粥樣斑塊破裂、促進凝血異常及血栓形成。

本研究尚存在以下局限性：①選擇偏倚：由于研究對象采用嚴格的入選標準，入選病例有明確的影像或臨床證據(jù)，故樣本量較少。②信息偏倚：對于病變特征及狹窄程度的判定尚存偏倚。

綜上，ACS患者存在炎癥與凝血異常；炎癥、凝血系統(tǒng)功能紊亂以及血栓在冠心病的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。深入探索炎癥、血栓在冠狀動脈粥樣硬化穩(wěn)定性中的作用，將有助于為臨床提供更有針對性的防治策略。

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Research on the correlation of TLR4，zinc finger protein A20 in peripheral blood monocyte and tissue factor in acute coronary syndrome patients

YU Chun-yang，WANG Zhao-jun，PU Xiao-jun，CHEN Xiao-jie

（Department of Cardiology，the Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001，China）

Objective：To investigate the relation between the expression levels of toll-like4／A20mRNA in peripheral blood mononuclear cells（PBMC）and tissue factor，tissue factor passway inhibitor（TFPI）in plasma of patientswith acute coronary syndrome（ACS）.M ethods：The patients of coronary artery diseases（CAD）were divided into the group of ACS（n＝31），there were 15 patients with acutemyocardial infarction（AMI），and 16 patients with unstable angina pectoris（UAP）；and stable angina pectoris（SAP，n＝21）group；the group of controlwere a total of20 cases.The expressions of TLR4 and A20 mRNA were detected by real-time fluorescence quantitation polymerase chain reaction（RT-PCR）.The concentrations of plasma tissue factor and TFPIwere measured by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.Results：There was a significant correlation between TLR4 mRNA and A20 mRNA in peripheral blood mononuclear cells（r＝0.640，P＝0.002）.The expressions of A20 and TLR4 mRNA in monocytes in patients with ACS were higher than patients with SAP and healthy persons（P＜0.001）.Comparing with the single lesion group，TLR4 and A20 mRNA positive expression in the multivessel branch lesion group were increased（P＝0.006，P＝0.000）.The levels of both tissue factor and TFPI in patientswith ACSwere significantly higher than the group of SAP and controls（P＜0.01）.Plasma tissue factor was statistically significant between themultivessel disease group and the single lesion group（P＝0.017）.The expression of TLR4 in PBMC group was positively related with the level of TF in ACS（r＝0.718，P＝0.000）.Conclusion：The increased expression of TLR4 in monocyteswas related to atherosclerotic plaque instability as well as coronary artery lesion degree.TLR4-mediated inflammatory pathway activation may promote clotting abnormalities and coronary artery thrombosis in patientswith ACS.

acute coronary syndrome；toll-like receptor4；zinc finger protein A20；tissue factor；tissue factor passway inhibitor形成炎癥 凝血 血栓循環(huán)，該循環(huán)可能在冠心病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［7－9］。因此，把炎癥反應(yīng)、凝血系統(tǒng)功能紊亂、血栓形成等過程聯(lián)合起來可能成為冠心病發(fā)病機制研究的新方向，但目前相關(guān)的臨床研究較少。

R544.2

A

1671－7783（2014）01－0063－05

10.13312／j.issn.1671-7783.y130036

于春楊（1987—），女，碩士研究生；王昭軍（通訊作者），主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，E-mail：doctorwangzj＠aliyun.cn

2013－03－15 ［編輯］陳海林