丹參酮ⅡA對人牙周膜成纖維細胞增殖的影響

陳建明+童曉潔+陳瑾

[摘要] 目的 研究丹參酮ⅡA對人牙周膜成纖維細胞增殖的影響。 方法 將人牙周膜成纖維細胞培養在含不同濃度的丹參酮ⅡA培養液中（實驗組），同時設不含丹參酮ⅡA的空白對照組，24、48、72 h后，以CCK-8法檢測細胞的增殖情況。 結果 在倒置顯微鏡下，實驗組貼壁人牙周膜成纖維細胞數目明顯減少。加藥培養48、72 h，不同濃度丹參酮ⅡA組細胞的光密度（OD）值明顯低于對照組，差異有統計學意義（P<0.001）。 結論 丹參酮ⅡA對人牙周膜成纖維細胞增殖有一定的抑制作用。

[關鍵詞] 丹參酮ⅡA；人牙周膜成纖維細胞；牙周組織；改建

[中圖分類號] R780.2[文獻標識碼] A[文章編號] 1674-4721（2014）04（c）-0021-03

The effect of tanshinoneⅡA on proliferation of human periodontal ligament fibroblasts

CHEN Jian-ming TONG Xiao-jie CHEN Jin

Stomatology of Guangzhou Medical University;Stomatology Hospital Affiliated to Guangzhou Medical University;Key Laboratory of Oral Medicine,Guangzhou Medical University,Guangzhou 510140,China

[Abstract] Objective To study the effect of tanshinoneⅡA on proliferation of human periodontal ligament fibroblasts.Methods Human periodontal ligament fibroblasts was cultured in different concentrations of tanshinoneⅡA suspension in vitro (experimental group),control group without tanshinoneⅡA was selected.After 24 h,48 h,72 h,cell proliferation ability was examined by CCK-8.Results Less adherent cells were found in experimental groups under an inverted microscope.Meanwhile,after 48 and 72 hours culture,the OD values of experimental groups was lower than that of control group,had significant difference (P<0.001).Conclusion TanshinoneⅡA may inhibit the proliferation of human periodontal ligament fibroblasts.

[Key words] TanshinoneⅡA;Human periodontal ligament fibroblasts;Periodontal tissue;Remodeling

在口腔正畸治療過程中，要把牙齒重新排列，需要對牙槽骨不斷進行改建，而這個緩慢的過程有賴于成骨與破骨之間平衡的保持，涉及具有吸收骨質的破骨細胞、具有成骨功能的成骨細胞和牙周膜成纖維細胞復雜而緊密的偶聯反應。怎樣才能加快牙齒移動速度、縮短保持時間一直是國內外學者探索的課題。有學者研究發現，丹參酮ⅡA對破骨細胞有抑制作用[1]。而許多細胞因子通過作用于成骨細胞，從而間接地調節破骨細胞的分化成熟。由于牙周膜成纖維細胞具有成骨樣細胞表型特征[2]，猜想丹參酮ⅡA可能會對牙周膜成纖維細胞產生抑制作用。本研究旨在探討丹參酮ⅡA對牙周膜成纖維細胞增殖的影響，以期為臨床牙周組織改建提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器

α-MEM培養基、胎牛血清（Gibco，USA）、丹參酮ⅡA（Sigma，USA），CCK-8試劑盒（南京凱基公司）、倒置相差顯微鏡（Olympus，日本）、酶標儀（Thermo，USA）、恒溫CO2培養箱（Thermo，USA）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養人牙周膜取自正畸牙的患者，患者年齡12～29歲，刮取牙根中1/3牙周膜，均勻鋪于6孔板內，加入含15%胎牛血清的α-MEM培養液，飽和濕度、5%CO2、95%空氣，37℃（標準環境）孵育，每3～5天換一次液，直至細胞從組織塊游離出并長滿。當原代人牙周膜成纖維細胞約80%融合時，再以1∶3或1∶4傳代。將第5代細胞用于實驗。

1.2.2 實驗分組與處理取對數生長期人牙周膜成纖維細胞制成2×108/L細胞懸液，接種于96孔板，每孔100 μl，培養24 h后，分別更換為20、40、60 μg/ml丹參酮ⅡA的α-MEM培養液（每孔100 μl），每組設4個復孔，同時設不含丹參酮ⅡA的空白對照組。繼續培養24、48、72 h后，在相差顯微鏡下觀察各組的細胞形態。

1.2.3 CCK-8法檢測丹參酮ⅡA對人牙周膜成纖維細胞增殖活性的影響繼續培養24、48、72 h后，向各孔中加入10 μl新型細胞增殖及毒性檢測溶液。37℃下孵育2 h，酶標儀在450 nm波長處檢測每孔的光密度（OD）值。

1.3 統計學分析

采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差表示，不同時間段采用單因素ANOVA檢驗及多樣本均數間兩兩比較，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度丹參酮ⅡA對牙周膜成纖維細胞的形態學觀察

不同濃度的丹參酮ⅡA作用人牙周膜成纖維細胞24 h后，對照組細胞基本貼壁，細胞形態呈梭型；實驗組細胞僅存少量的貼壁細胞。培養48 h后，對照組牙周膜成纖維細胞基本長滿培養孔底；20 μg/ml組中，貼壁細胞較24 h前增多，細胞呈梭形；40 μg/ml組與60 μg/ml組培養孔中，僅見少量的貼壁細胞，細胞形態呈不規則形。培養72 h后，對照組牙周膜成纖維細胞完全長滿培養孔底；20 μg/ml組與40 μg/ml組中，貼壁細胞較少，細胞形態多樣；60 μg/ml組培養孔中，僅見少許的貼壁細胞（圖1）。

圖1 人牙周膜成纖維細胞在不同濃度丹參酮ⅡA中培養

24、48、72 h后的形態

2.2 不同濃度丹參酮ⅡA對牙周膜成纖維細胞增殖活性影響的OD值

加丹參酮ⅡA培養24 h后，不同濃度組的OD值與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；各組間兩兩比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。加丹參酮ⅡA培養48、72 h后，不同濃度組的OD值與對照組比較，差異有統計學意義（P<0.001）；各濃度組間兩兩比較，差異無統計學意義（P＞0.05）（表1、圖2）。

表1 不同濃度丹參酮ⅡA對人牙周膜成纖維細胞增殖活性影響的OD值（x±s）

與對照組比較，*P<0.001

圖2 不同濃度丹參酮ⅡA對人牙周膜成纖維細胞增殖活性的影響

與對照組比較，*P<0.001

3 討論

牙周膜細胞是一組有異質性的細胞群，包括了成牙骨質細胞、成骨細胞和牙周膜成纖維細胞等，其中成骨細胞和牙周膜成纖維細胞是牙周組織中的兩種重要的細胞成分，它們與破骨細胞一起參與牙周骨質平衡的維持，對于穩定正常牙周膜的生理功能起關鍵作用。

Kwak等[3]研究發現，丹參酮ⅡA通過調控成骨細胞上的NF-κB的配體和骨保護素來調節破骨細胞的活性。研究還發現，丹參酮ⅡA對破骨細胞分化的抑制作用是丹參酮ⅡA通過作用于成骨細胞，抑制其前列腺素E2/環氧化酶-2信號途徑而實現的。

研究表明，牙周膜成纖維細胞與成骨細胞具有相似之處，牙周膜成纖維細胞有向成骨細胞分化的趨勢，在一定情況下，可以表現出成骨細胞的特征[4-5]。Kanzaki等[6]將末梢血單核細胞與牙周膜成纖維細胞進行直接或間接共培養4周，直接共培養體系中牙本質片上形成較多的骨吸收陷窩，同時發現牙周膜成纖維細胞可以表達核因子-κB受體活化因子配體（RANKL）和骨保護素（OPG）。張丁等[7]也在人牙周膜細胞胞膜和胞質上發現RANKL蛋白的表達，同時在培養液中檢測到OPG蛋白，說明牙周膜成纖維細胞可能會像成骨細胞一樣，也可以參與破骨細胞的調節。

近來，有學者發現丹參酮ⅡA也參與牙周組織改建。張曉燕等[8]發現，丹參酮能促進牙槽骨骨形成和抑制骨吸收，防治牙槽骨骨質疏松。進一步說明，丹參酮ⅡA、破骨細胞、牙周膜成纖維細胞間存在密切的聯系。本實驗結果顯示牙周膜成纖維細胞在丹參酮ⅡA作用48、72 h后，其增殖受到了明顯的抑制，其中以40 μg/ml組最為明顯。先前筆者研究發現，末梢血單個核細胞作為破骨細胞的前體細胞，只有在牙周膜成纖維細胞存在的條件下，才能形成多核的破骨樣細胞，其單獨存在無法形成破骨細胞[9]。因此，猜測丹參酮ⅡA有可能通過抑制牙周膜成纖維細胞，間接產生抑制破骨細胞的作用，但是，其具體機制有待進一步研究。

[參考文獻]

[1]Kim HH，Kim JH，Kwak HB，et al.Inhibition of osteoclast differentiation and bone resorption by tanshinone ⅡA isolated from Salvia miltiorrhiza Bunge[J].Biochem Pharmacol，2004，67（9）：1647-1656.

[2]駱凱，閆福華，金巖，等.體外培養人牙周膜成纖維細胞及其成骨表型特征檢測[J].口腔醫學，2004，24（1）：8-10.

[3]Kwak HB，Sun HM，Ha H，et al.Tanshinone ⅡA suppresses inflammatory bone loss by inhibiting the synthesis of prostaglandin E2 in osteoblasts[J].Eur J Pharmacol，2008， 601（1-3）：30-37.

[4]Liang L，Yu JF，Wang Y，et al.Effect of estrogen receptor beta on the osteoblastic differentiation function of human periodontal ligament cells[J].Arch Oral Biol，2008，53（6）：553-557.

[5]Dereka XE，Markopoulou CE，Mamalis A，et al.Effect of rhBMP-7 combined with two bone grafts on human periodontal ligament cell differentiation[J].Growth Factors，2009，27（5）：274-279.

[6]Kanzaki H，Chiba M，Shimizu Y，et al.Dual regulation of osteoclast differentiation by periodontal ligament cells through RANKL stimulation and OPG inhibition[J].J Dent Res，2001，80（3）：887-891.

[7]張丁，楊雁琪，李小彤，等.人牙周膜細胞骨保護因子和破骨細胞分化因子蛋白的表達及1α，25（OH）2維生素D3的調節[J].北京大學學報（醫學版），2004，36（6）：646-649.

[8]張曉燕，崔燎，吳鐵，等.丹參酮對去卵巢大鼠牙槽骨丟失的抑制作用[J].中國老年學雜志，2012，32（1）：113-114.

[9]陳建明，蘭澤棟，劉嶸.牙周膜成纖維細胞對外周血單個核細胞分化的影響[J].口腔醫學研究，2011，27（9）：808-811.

（收稿日期：2014-03-12本文編輯：郭靜娟）

[基金項目] 廣東省中醫藥局資助項目（20121129）

[作者簡介] 陳建明（1982-），男，漢族，福建人，碩士，主治醫師，主要從事口腔正畸學基礎與臨床研究

表1 不同濃度丹參酮ⅡA對人牙周膜成纖維細胞增殖活性影響的OD值（x±s）

與對照組比較，*P<0.001

圖2 不同濃度丹參酮ⅡA對人牙周膜成纖維細胞增殖活性的影響

與對照組比較，*P<0.001

3 討論

牙周膜細胞是一組有異質性的細胞群，包括了成牙骨質細胞、成骨細胞和牙周膜成纖維細胞等，其中成骨細胞和牙周膜成纖維細胞是牙周組織中的兩種重要的細胞成分，它們與破骨細胞一起參與牙周骨質平衡的維持，對于穩定正常牙周膜的生理功能起關鍵作用。

Kwak等[3]研究發現，丹參酮ⅡA通過調控成骨細胞上的NF-κB的配體和骨保護素來調節破骨細胞的活性。研究還發現，丹參酮ⅡA對破骨細胞分化的抑制作用是丹參酮ⅡA通過作用于成骨細胞，抑制其前列腺素E2/環氧化酶-2信號途徑而實現的。

研究表明，牙周膜成纖維細胞與成骨細胞具有相似之處，牙周膜成纖維細胞有向成骨細胞分化的趨勢，在一定情況下，可以表現出成骨細胞的特征[4-5]。Kanzaki等[6]將末梢血單核細胞與牙周膜成纖維細胞進行直接或間接共培養4周，直接共培養體系中牙本質片上形成較多的骨吸收陷窩，同時發現牙周膜成纖維細胞可以表達核因子-κB受體活化因子配體（RANKL）和骨保護素（OPG）。張丁等[7]也在人牙周膜細胞胞膜和胞質上發現RANKL蛋白的表達，同時在培養液中檢測到OPG蛋白，說明牙周膜成纖維細胞可能會像成骨細胞一樣，也可以參與破骨細胞的調節。

近來，有學者發現丹參酮ⅡA也參與牙周組織改建。張曉燕等[8]發現，丹參酮能促進牙槽骨骨形成和抑制骨吸收，防治牙槽骨骨質疏松。進一步說明，丹參酮ⅡA、破骨細胞、牙周膜成纖維細胞間存在密切的聯系。本實驗結果顯示牙周膜成纖維細胞在丹參酮ⅡA作用48、72 h后，其增殖受到了明顯的抑制，其中以40 μg/ml組最為明顯。先前筆者研究發現，末梢血單個核細胞作為破骨細胞的前體細胞，只有在牙周膜成纖維細胞存在的條件下，才能形成多核的破骨樣細胞，其單獨存在無法形成破骨細胞[9]。因此，猜測丹參酮ⅡA有可能通過抑制牙周膜成纖維細胞，間接產生抑制破骨細胞的作用，但是，其具體機制有待進一步研究。

[參考文獻]

[1]Kim HH，Kim JH，Kwak HB，et al.Inhibition of osteoclast differentiation and bone resorption by tanshinone ⅡA isolated from Salvia miltiorrhiza Bunge[J].Biochem Pharmacol，2004，67（9）：1647-1656.

[2]駱凱，閆福華，金巖，等.體外培養人牙周膜成纖維細胞及其成骨表型特征檢測[J].口腔醫學，2004，24（1）：8-10.

[3]Kwak HB，Sun HM，Ha H，et al.Tanshinone ⅡA suppresses inflammatory bone loss by inhibiting the synthesis of prostaglandin E2 in osteoblasts[J].Eur J Pharmacol，2008， 601（1-3）：30-37.

[4]Liang L，Yu JF，Wang Y，et al.Effect of estrogen receptor beta on the osteoblastic differentiation function of human periodontal ligament cells[J].Arch Oral Biol，2008，53（6）：553-557.

[5]Dereka XE，Markopoulou CE，Mamalis A，et al.Effect of rhBMP-7 combined with two bone grafts on human periodontal ligament cell differentiation[J].Growth Factors，2009，27（5）：274-279.

[6]Kanzaki H，Chiba M，Shimizu Y，et al.Dual regulation of osteoclast differentiation by periodontal ligament cells through RANKL stimulation and OPG inhibition[J].J Dent Res，2001，80（3）：887-891.

[7]張丁，楊雁琪，李小彤，等.人牙周膜細胞骨保護因子和破骨細胞分化因子蛋白的表達及1α，25（OH）2維生素D3的調節[J].北京大學學報（醫學版），2004，36（6）：646-649.

[8]張曉燕，崔燎，吳鐵，等.丹參酮對去卵巢大鼠牙槽骨丟失的抑制作用[J].中國老年學雜志，2012，32（1）：113-114.

[9]陳建明，蘭澤棟，劉嶸.牙周膜成纖維細胞對外周血單個核細胞分化的影響[J].口腔醫學研究，2011，27（9）：808-811.

（收稿日期：2014-03-12本文編輯：郭靜娟）

[基金項目] 廣東省中醫藥局資助項目（20121129）

[作者簡介] 陳建明（1982-），男，漢族，福建人，碩士，主治醫師，主要從事口腔正畸學基礎與臨床研究

表1 不同濃度丹參酮ⅡA對人牙周膜成纖維細胞增殖活性影響的OD值（x±s）

與對照組比較，*P<0.001

圖2 不同濃度丹參酮ⅡA對人牙周膜成纖維細胞增殖活性的影響

與對照組比較，*P<0.001

3 討論

牙周膜細胞是一組有異質性的細胞群，包括了成牙骨質細胞、成骨細胞和牙周膜成纖維細胞等，其中成骨細胞和牙周膜成纖維細胞是牙周組織中的兩種重要的細胞成分，它們與破骨細胞一起參與牙周骨質平衡的維持，對于穩定正常牙周膜的生理功能起關鍵作用。

Kwak等[3]研究發現，丹參酮ⅡA通過調控成骨細胞上的NF-κB的配體和骨保護素來調節破骨細胞的活性。研究還發現，丹參酮ⅡA對破骨細胞分化的抑制作用是丹參酮ⅡA通過作用于成骨細胞，抑制其前列腺素E2/環氧化酶-2信號途徑而實現的。

研究表明，牙周膜成纖維細胞與成骨細胞具有相似之處，牙周膜成纖維細胞有向成骨細胞分化的趨勢，在一定情況下，可以表現出成骨細胞的特征[4-5]。Kanzaki等[6]將末梢血單核細胞與牙周膜成纖維細胞進行直接或間接共培養4周，直接共培養體系中牙本質片上形成較多的骨吸收陷窩，同時發現牙周膜成纖維細胞可以表達核因子-κB受體活化因子配體（RANKL）和骨保護素（OPG）。張丁等[7]也在人牙周膜細胞胞膜和胞質上發現RANKL蛋白的表達，同時在培養液中檢測到OPG蛋白，說明牙周膜成纖維細胞可能會像成骨細胞一樣，也可以參與破骨細胞的調節。

近來，有學者發現丹參酮ⅡA也參與牙周組織改建。張曉燕等[8]發現，丹參酮能促進牙槽骨骨形成和抑制骨吸收，防治牙槽骨骨質疏松。進一步說明，丹參酮ⅡA、破骨細胞、牙周膜成纖維細胞間存在密切的聯系。本實驗結果顯示牙周膜成纖維細胞在丹參酮ⅡA作用48、72 h后，其增殖受到了明顯的抑制，其中以40 μg/ml組最為明顯。先前筆者研究發現，末梢血單個核細胞作為破骨細胞的前體細胞，只有在牙周膜成纖維細胞存在的條件下，才能形成多核的破骨樣細胞，其單獨存在無法形成破骨細胞[9]。因此，猜測丹參酮ⅡA有可能通過抑制牙周膜成纖維細胞，間接產生抑制破骨細胞的作用，但是，其具體機制有待進一步研究。

[參考文獻]

[1]Kim HH，Kim JH，Kwak HB，et al.Inhibition of osteoclast differentiation and bone resorption by tanshinone ⅡA isolated from Salvia miltiorrhiza Bunge[J].Biochem Pharmacol，2004，67（9）：1647-1656.

[2]駱凱，閆福華，金巖，等.體外培養人牙周膜成纖維細胞及其成骨表型特征檢測[J].口腔醫學，2004，24（1）：8-10.

[3]Kwak HB，Sun HM，Ha H，et al.Tanshinone ⅡA suppresses inflammatory bone loss by inhibiting the synthesis of prostaglandin E2 in osteoblasts[J].Eur J Pharmacol，2008， 601（1-3）：30-37.

[4]Liang L，Yu JF，Wang Y，et al.Effect of estrogen receptor beta on the osteoblastic differentiation function of human periodontal ligament cells[J].Arch Oral Biol，2008，53（6）：553-557.

[5]Dereka XE，Markopoulou CE，Mamalis A，et al.Effect of rhBMP-7 combined with two bone grafts on human periodontal ligament cell differentiation[J].Growth Factors，2009，27（5）：274-279.

[6]Kanzaki H，Chiba M，Shimizu Y，et al.Dual regulation of osteoclast differentiation by periodontal ligament cells through RANKL stimulation and OPG inhibition[J].J Dent Res，2001，80（3）：887-891.

[7]張丁，楊雁琪，李小彤，等.人牙周膜細胞骨保護因子和破骨細胞分化因子蛋白的表達及1α，25（OH）2維生素D3的調節[J].北京大學學報（醫學版），2004，36（6）：646-649.

[8]張曉燕，崔燎，吳鐵，等.丹參酮對去卵巢大鼠牙槽骨丟失的抑制作用[J].中國老年學雜志，2012，32（1）：113-114.

[9]陳建明，蘭澤棟，劉嶸.牙周膜成纖維細胞對外周血單個核細胞分化的影響[J].口腔醫學研究，2011，27（9）：808-811.

（收稿日期：2014-03-12本文編輯：郭靜娟）

[基金項目] 廣東省中醫藥局資助項目（20121129）

[作者簡介] 陳建明（1982-），男，漢族，福建人，碩士，主治醫師，主要從事口腔正畸學基礎與臨床研究